（茶学专业论文）茶树多酚氧化酶基因的克隆和转化系统研究.pdf

摘要 l 茶树( c a m e l l i as i n e n s i s ( l ) 0 k u n t z e ) 是我国重要的经济作物之一。 茶叶富含多种次生代谢产物，其中多酚类物质具有多种重要的生理功能， 在食品和医药等行业具有巨大的应用潜力。多酚氧化酶与茶叶加工密切 相关，不同的茶叶类型需要不同的多酚氧化酶活性，如加工红茶的品种 需要较高的酶活性，而生产绿茶则希望有低的酶活性j 1 本项研究重点在 茶树多酚氧化酶基因的克隆和茶树遗传转化系统方面，结果如下。 根据已经发表的多酚氧化酶基因中的保守序列，设计兼并引物，利 用n e s t p c r 技术，首次在茶树中克隆了多酚氧化酶基因。陔基因已经在 、 g e n b a n k 上登录，登录号为a f 2 6 9 1 9 2 。序列分析表明，茶树多酚氧化酶 基因与其他植物中的多酚氧化酶基因有较高的相似性，尤其在铜离子的 结合部位，所有的植物基本上一致。进化树分析表明，茶树的多酚氧化 、 酶可以与大多数的木本植物聚合成一个组。 通过对茶树茎培养的激素水平和相互关系的研究，以叶片数为生长 指标，初步明确了茶树茎培养所需的激素条件。统计结果表明，n a a 和 、 b a p 的浓度对培养材料的影响很大。在培养的早期，不同浓度的n a a 对茎生长作用效果不甚明显，未达到统计上的显著水平。但随着生长的 进程，n a a 的浓度效果逐渐显现，即不同浓度的n a a 对生长的影响显 著不同，在统计上达到极显著水平。与n a a 的作用效果不同，不同的 b a p 浓度对茶树茎生长的作用一直有着极显著的效果差异。同时通过统 计分析还首次发现了n a a 和b a p 对茎的生长没有互作作用。研究表明， 茶树茎培养的较为适宜的生长调节剂浓度为b a p2 5 - 5 m g l 、n a a0 5 1 m g l ，在这个浓度条件下，经过6 0 天的培养，一个茎最多可生长到1 5 片叶片。、 我们以g u s 的瞬间表达为指标，对根癌农杆菌介导的茶树转化系统 的影响因子进行了研究。由于3 0m l ，l 的卡那霉素即能够有效地抑制茶 树叶片愈伤组织的发生，因而对以k a n 为筛选标记的表达载体来说， 5 0 m g l k a n 是较为适宜的选择浓度。我们比较了三种不同染色体遗传背 景的根癌农杆菌对茶树叶盘的侵染情况，发现侵染效果的差别不大。在 侵染过程中采用真空处理反而会降低g u s 的瞬间表达。从试验结果看， 茶树较为适宜的根癌农杆菌转化系统是用o d 6 0 0 为o 5 一o 8 的l b a 4 4 0 4 侵染茶树叶盘1 0 分钟左右，在暗中2 8 c c 共培养2 3 天。硝酸银对农杆菌 生长有抑制作用，不宜在共培养阶段添加。、) 关键词：茶树( c a m e l l i as i n e n s i s ( l ) 0 k u n t z e ) ，多酚氧化酶基因 n a a b a p ，转化系统 i j a b s t r a c t t e ap l a n t ( c a m e l l i as i n e n s i s ( l ) o k u n t z e ) ，o n eo fm o s ti m p o r t a n t e c o n o m i cp l a n ti nc h i n a ，c o n t a i n sa b u n d a n ts e c o n d a r ym e t a b o l i cp r o d u c t s ，o f w h i c h p o l y p h e n o l sp o s s e s s i m m e n s e p o t e n t i a l f o rf o o da n dm e d i c a l i n d u s t r i e sd u et ot h e i rv a r i o u sp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n sf o rh u m a nb o d y t h e p o b p h e n o lo x i d a s e s ，a sa r ew e l lk n o w n ，p l a y v i t a lr o l e si l lt e ap r o c e s s i n g ，e g h i g he n z ) 7 m a t i ca c t i v i t yi si nf a v o ro f b l a c kt e aw h i l el o we n z y m a t i ca c t i v i t y b e n e f i t sg r e e nt e a i np r e s e n ts t u d y ，w ef o c u so np o l y p h e n o lo x i d a s e ( p p o ) g e n ec l o n i n g a n dt r a n s f o r m a t i o n s y s t e m o ft e a p l a n t t h e r e s u l t sw e r e r e p o r t e da sf o l l o w s f o rt h ef i r s tt i m et h ep p o g e n ei nt e ap l a n tw a sc l o n e d d u r i n gw h i c h ， t i l ec o n s e n s u s s e q u e n c e so fp r e v i o u s l yp u b l i s h e dp p o w a su s e dt od e s i g nt h e d e g e n e r a t ep r i m e r s a n dt h er e v e r s e t r a n s c r i p t i o n a n dn e s t p c rw e r e e m p l o y e d t h eo b t a i n e dp p og e n eo f t e ap l a n tw a s r e g i s t e r e di ng e n b a n k ， w h o s ea c c e s sn u m b e ri sa f 2 6 919 2 a l i g n m e n to f s e q u e n c e sw i t hc l u s t a l w i n d i c a t e st h a tt h eg e n eo ft e ah a sh i g hh o m o l o g yn i t ht h o s ef o u n di no t h e r p l a n t s ，e s p e c i a l l yc o p p e rb i n d i n gr e g i o n s t h ep o l y p h e n o lo x i d a s eo f t e ac a n b ec l u s t e r e dw i t hm o s to t h e rw o o d yp l a n t sa c c o r d i n gt op h y l o g e n e f i ct r e e a n a l y s i s t h ee f f e c t so f n a aa n db a pa tv a r i o u sc o n c e n t r a t i o n ss u p p l e m e n t e dt o m sm e d i u mo nt e as t e mc u l t u r ew e r ei n v e s t i g a t e dw i t ht h en u m b e ro f n e w l y d e v e l o p e dl e a v e sa sg r o w t hi n d e x i ts h o w e d t h a tt h ec o n c e n t r a t i o n so fn a a a n db a ph a dg r e a ti n f l u e n c e so i lt h eg r o w t ho fc u l t u r e s n a aa td i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n ss h o w e dn oc o n s i d e r a b l yd i f f e r e n te f f e c t so nt h eg r o w t ho f c u l t u r e sa te a r l yc u l t u r es t a g e ，u n t i lt h es t e m sw e r ec u l t u r e df o r5 0d a y s i n t h e c o n t r a s t ，b a pa t v a r i o u sc o n c e n t r a t i o n se x e r t e d s i g n i f i c a n t d i f f e r e n t e f f e c t so nt h eg r o w t ho fc u l t u r e sf r o mt h e b e g i n n i n go fc u l t u r i n g f a r t h e r l m o r e ，i tw a sf i r s t l yp r o v e dt h a tt h e r ew a sn oi n t e r a c t i o nb e t w e e nb a i a n d n a ao nt h e g r o w t ho fc u l t u r e ds t e mb a s e d 0 1 1b i o s t a t i s t i c a n a l y s i s t h e p r e s e n ts t u d yi n d i c a t e dt h eo p t i m i s t i cc o n c e n t r a t i o nf o rt e as t e mc u l t u r ew a s b a p2 5 - 5m g la n dn a a0 5 1 m g l ，u n d e rw h i c ho n es t e ma ti t sh e i g h t c o u l dd c 、e l o pa b o u t15l e a v e sa f t e rc u l t u r i n g6 0d a y s t h ef a c t o r s a f f e c t i n g t h e a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s m e d i a t e d t r a n s f o r m a t i o no ft e al e a fd i s c sw e r es t u d i e db a s e do ng u st r a n s i e n t e x p r e s s i o n i tw a sf o u n dt h a tc a l l u sf o r m a t i o ns t a r t e dt ob ed e p r e s s e df r o m t c al e a fd i s c sc u l t u r e do nm sm e d i u mc o n t a i n i n g3 0m g i 。k a n a m y c i n ，t h u s 5 0m e 2 lk a n a m y c i n - v a sc o n s i d e r e ds u i t a b l ef o rs e l e c t i n ge x p r e s s i o nv e c t o r w i t h n e o m y c i np h o s p h o t r a n s f e r a s eg e n e ( n p ti i ) t h r e ea g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s s t a i n sw i t hd i f f e r e n tc h r o m o s o m a l b a c k g r o u n d ，l b a 4 4 0 4 ， e h a l 0 5 ，p g v 3 8 5 0 ，w e r et e s t e d t h e r e s u l t ss h o w e dn oc o n s i d e r a b l e d i f f e r e n ti nt h ei n f e c t i o nb e t w e e nt h e r et h r e es t a i n s d u r i n gt h ep r o c e s so f i n f e c t i o n ，v a c u u m ，o nt h ec o n t r a r y , w e a k e n e dt h et r a n s i e n te x p r e s s i o no f g u s g e n e i nl i g h to ft h er e s u l t so b t a i n e di nt h ep r e s e n ts t u d y , t h es u i t a b l e s y s t e m o f a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s m e d i a t e d t r a n s f o r m a t i o nw a s s u g g e s t e dt h a tt e al e a fd i s c sb e i n f e c t e d1 0m i n b yl b a 4 4 0 4 o f o d 6 0 0 a b o u t 0 5 0 8f o l l o w e db yc o c u l t u r eo f2 3d a y sa b o u t2 8 i n d a r k n e s s b e s i d e s a g n 0 3 w a sf o u n d i n h i b i t i n gt h eg r o w t ho fa g r o b a c t e l 4 i u mt u m e f a c i e n s ，t h u s w a sn o ts u i t a b l et ob ea d d e di n t ot h ec o c u l t u r em e d i u m k e yw o r d s ：t e a ( c a m e l l i as i n e n s i s ( l ) o k u n t z e ) ，p o l y p h e n o lo x i d a s e ( p p o ) g e n e ，n a a ，b a p , t r a n s f o r m a t i o n v 致谢 本论文是在导师刘祖生教授悉心指导下完成的。从论文选题、试验方案、实 验开展到论文写作，无不凝聚着导师的大量心血。导师高瞻远嘱的学术眼光、开 放宽容的胸怀气度、严谨的治学态度、忘我的工作热情使我受益匪浅。感谢导师 在五年的博士学习期间，在学习、工作和生活上给予的无微不至的关怀。 感谢奚彪博士在整个研究过程中给予的支持和指导。远在美国作博士后研究 的奚彪博士通过近百封电子邮件，对关键的试验环节和实验操作给予了具体的指 导，保证了试验的顺利进行。该研究工作也是奚彪博士主持的国家自然科学基金 项目的部分研究内容。 研究进行过程中得到了农业部重点开放实验室浙江大学植物病理及生物技 术研究所开放基金的部分资助，部分研究在该所进行，感谢董海涛副教授、董继 新博士等的指导和帮助。 本系茶树育种教研室的梁月荣教授、陆建良老师、骆颖颖硕士、冯艳飞硕士 等对研究工作提出了很多建设性的意见，给予了大力帮助。同时茶学系童启庆教 授、潘根生教授、周巨根副教授、骆耀平副教授、董尚胜副教授、黄亚萍老师、 徐月荣老师、钱利生老师、朱晓琳女士等许多老师在本人的教学和科研中给予了 很多支持和帮助，在此一并表示感谢。 感谢家人对我的理解和支持，使我有勇气和动力完成五年的学业。谨以此文 献给父母、妻子和儿子。 赵东 二零零一年四月于杭州华家池 第一章绪论 茶树( c a m e l l as n e n s s ) 是一种重要的经济作物，在我国的种植历史 已有三千余年。随着对外的交流，茶树的种植、加工和饮用也逐渐流传 到其他国家，目前已成为世界上三大无酒精饮料之一。中国古代就有“诸 药为各病之药，茶为万病之药”之说，近年来的研究和调查更证明茶叶 对人有重要的生理保健作用，如防龋齿作用、抗菌抗病毒作用、抗氧化 功能、降血压血脂胆固醇、抗癌抗突变效应等。不仅有越来越多的人饮 茶而且也利用茶叶提取有效成分和加工医药产品等。市场对茶树品种 的要求也越来越高，传统的育种虽然育成了大量的优良品种，但难以满 足人们日益增长的需求。因而，利用生物技术改良和育成新一代茶树品 种已成为国内外茶学研究的热点问题之一。 1 1 茶树再生系统研究进展 种子是植物组织中分化程度最低的部分，具有较强的再生能力，许多植物都 以种子的部分组织建立了再生体系。在茶树中利用这部分组织进行培养的研究较 多，而利用叶片、茎等营养器官进行培养的研究结果相对较少。营养器官的再生 在植物组织培养中成功率较低，主要涉及到器官的脱分化和再分化等复杂的过 程。由于这方面的机理尚不清楚，难以获得满意的培养结果。 1 1 1 胚培养 颜慕勤等( 19 8 3 ) 用茶树子叶离体培养得到了胚状体。并且认为胚状体起源 于子叶表皮，在胚胎发生的最初分隔方式上与合子胚不同。茶树胚状体发育过程 与合子胚一样，由于表皮的发生而进入球形胚原阶段，细胞在特殊的顺序下进一 步分裂形成了胚状体主体和胚柄，使胚状体进入球形期；接着是子叶的伸出，上 胚轴芽原基的形成；下胚轴芽原基的形成使胚状体进入心形期，由于下胚轴的仲 长而进入鱼雷期，最后由于芽的生长和根的伸长形成完整的植株。 茶树子叶的年龄对其分化率有较大的影响( 蒋祖丰，1 9 8 8 ) 。在培养过程中 发现越是年幼的子叶柄，愈伤组织诱导率和芽分化频率越高。芽的分化率还与茶 树品种即基因型有关，如铁观音芽的分化率几乎为零。但对于愈伤组织的诱导， 茶树品种之问的差异很小。 b a n o 等( 1 9 9 1 ) 也发现茶树子叶经诱导形成胚性愈伤组织的效果与其发育 状况有关，年幼的子叶发育形成的胚性愈伤组织多于年老的子叶。生长素类激素 如2 4 d 以及n a a 的浓度均与胚性愈伤组织诱导效果成反比。组织学观察表明 体细胞胚直接起源于予叶的表皮细胞。 从茶树子叶柄分化形成的胚状体，在发育阶段上是不同步的。在同一外植体 上可看到胚性细胞团和球形胚、心形胚、鱼雷形胚、肾形胚和香蕉形胚等( 刘德 华等，1 9 8 9 b ) 。在茶树子叶柄培养中，近轴端不定芽的分化率高，随着子叶柄断 面离胚轴距离的增大，其分化率降低，而不定胚的分化率则相反。可能在茶树子 叶柄中存在极性梯度，越靠近胚轴端单极性越强，越靠近子叶端双极性越强( 刘 德华等，1 9 9 9 b ) 。刘德华等( 1 9 9 9 a ) 还发现在细胞分裂素生长素比值低及添加 g a 3 的培养基上，子叶柄、叶柄愈伤组织的畸形胚分化率较高。但大多数畸形 胚在转化培养基上经过一定时间的培养，最后均能直接诱导成苗。 刘德华等( 1 9 8 8 ) 用茶树种籽的下胚轴为材料经过培养最后得到了芽的分化。 不同茶树品种之间的诱导效果差异不大。b a 对芽的诱导有较好的作用。 王立等( 1 9 8 8 ) 用茶树未成熟胚经离体培养得到了植株。经过对培养基成分 进行优化，发现茶树胚培养所用的改良e r 附加6 - b a2 5 m g l 和n a a0 2 m g l ， 愈伤组织和芽分化均获得了最佳效果。而诱导根以i b a1m g l 最为有效。 p a r k 等( 1 9 9 7 ) 用茶树成熟胚成功地诱导了体细胞胚和不定芽的分化。未成 熟胚在2 4 d 作用下是一种较好的胚性愈伤组织来源。 在没有添加任何植物生长调节剂的m s 培养基中，最高约有6 0 的茶树子叶 经过培养形成了初级体细胞胚。但随着激动素和i b a 浓度的增加，这种成胚能 力逐渐下降。b a p 和i b a 浓度对成胚能力也有同样的影响。但体细胞胚在无激 素的培养基上萌发率低于含激素的培养基，表明器官分化必须有生长调节剂参与 才能完成。在较低的浓度时，玉米素( 1 0m g l ) 和b a p ( 1 8m g l ) 均能刺激 体细胞胚的萌发( w a c h i r a e ta 1 ，1 9 9 5 ) 。 在未成熟子叶培养过程中，用3 和6 琼脂的m s 培养6 0 天即可诱导胚性 愈伤组织的发生。体细胞胚的诱导与培养基中琼脂浓度有很大的关系，而生长调 节剂一般是增加胚的数目。较高浓度的生长素仅诱导子叶产生非胚性愈伤组织， 大多数生长素与细胞分裂素配合使用时能促进体细胞胚的发生( p o n s a m u e l e ta 1 ， 1 9 9 6 ) 。 胚性愈伤组织在继代培养过程中，酯酶、多酚氧化酶、过氧化物酶同工酶带 丢失与分化能力丧失十分吻合。凡是具有试管苗的过氧化酶、多酚氧化酶同工酶 酶带的愈伤组织，都具备体细胞胚分化能力( 刘德华1 9 9 5 ) 。 1 1 2 花药培养 与其它的植物一样，茶树的花药培养非常困难。陈振光( 1 9 8 3 ) 第一个报道 了获得再生的茶树单倍体植株。不同的培养基对茶树花药培养的效果有较大的影 响，主要是由于愈伤组织的形成与培养基类型有较大的关系，而花药培养获得的 再生植株几乎都是在愈伤组织发生率很低的培养基上得到的，n 6 可能是茶树花 药培养较为适宜的培养基。高浓度的2 4 d 和低浓度的蔗糖均能促进药壁愈伤组 织的发生，不利于花药培养。全光照对药壁愈伤组织的诱导有强烈的抑制作用。 这些研究暗示单倍体细胞与二倍体细胞所需的培养条件有较大的差异。 下门久( 1 9 9 5 ) 通过花药培养获得了1 0 0 0 多株由体细胞途径再生的单倍体 植株。不同茶树品种间的差异，即基因型对单倍体再生植株的成功率有很大的影 响，在下门久总共获得的1 1 7 5 株再生花药植株中，就有1 1 1 0 株是来自于同一个 茶树品种。 1 1 3 芽培养 a g a r w a l 等( 1 9 9 2 ) 用茶树的顶芽和腋芽进行了无性繁殖研究。发现用1 2 m s 附加1 0 c m ，2 9g mi a a 和1 7 8g mb a 是较为适宜的生芽培养基，而1 2 m s 附加l1 4t x m 抗坏血酸和3 4 5i x mi b a 则是较为适宜的生根培养基。 茶树腋芽培养的成功率与培养材料的采集时间有很大的关系。以春季的材料 最好，夏材次之秋材较差，冬材不发。而带第一腋芽的顶芽，在培养中比其它 腋芽的萌发成活率要高。不同的茶树品种对培养基虽然有一定的要求，但这种倾 向性不十分明显。( 奚彪等， 1 9 9 4 ) 。 茶树的腋芽培养效果不仅与茶树品种即基因型有关，而且与繁殖时外植体的 分割所形成的形状有较大的关系( 刘德华等，1 9 9 1 ) 。 在0l m g li b a 的m s 培养基中，腋芽的增殖与b a p 和g a 3 的水平有很大 的关系( a k u l ae ta 1 ，1 9 9 8 ) 。最好的结果来自o 5m l 的b a p 和无g a 3 的培养 基。将经过1 2 0 天培养的材料转入1 2 大量元素的无激素m s 培养基中，有多达 6 0 的产生了黄色球形胚。在胚的发育过程中，不同发育阶段的胚形态( 球形、 心形、鱼雷形等) 同时出现。 比较不同的培养基，m s 优于w p m 。m s 培养基中大量元素的浓度对生长最 为适宜，改变其浓度将会引起生长的下降( k u r a n u k ie ta 1 ，1 9 9 3 a ) 。而激素则以 i b a o0 1m g l 、3 al 0 m g l 、g a 3 1 0 m g l 时生长最好( k u r a n u k i e ta 1 ，1 9 9 3 b ) 。 1 1 4 茎培养 k i m 等( 1 9 9 8 ) 用茶茎培养得到了植株。不同品种之间的差异不大，在b a 1 5m g l 范围内，均能促进茎长和叶片数的增加，以及诱导愈伤组织。n a a 能 增加根的数目，但只有i b a ( 1 - 3m g l ) 能促进根的发育。不同的器官诱导生根 的能力有所不同( k i m1 9 8 6 ) 。叶片为2 9 4 5 ，茎为5 0 1 5 ，而根为4 3 9 5 。 有不少因素影响到茶树茎培养不定芽的分化率( 青岛洋一，1 9 9 8 ) 。不同的 激素要求浓度不同，i b a 在o 0 1 - 0 5m g l 之间，b a 在1 1 0m g l 之间较好，而 添加了5m g l 的g a 3 的的处理其分化率反而有所下降。糖的种类也有较大的影 响，通过比较蔗糖、葡萄糖、半乳糖等几种不同的糖，以蔗糖在3 的浓度时分 化率最高。 1 1 5 叶培养 王毅军等( 1 9 9 4 ) 用叶片愈伤组织诱导形成了胚状体，并得到了完整的植株。 在胚状体的发育过程中，每一发育步骤都可能受到某种阻碍而停滞在某一发育阶 4 段，从而形成畸形胚。但其表皮细胞能重新脱分化，进而再生出胚状体。 茶树叶诱导愈伤组织的效果与品种有一定的关系( 刘德华等，1 9 9 1 ) 。多酚 类含量高可能会影响到诱导的效果。在培养过程中，叶柄基部切口处形成的球状 愈伤组织上有肉眼可见芽点，并能很快地诱导出芽和胚状体。 用茶树叶的不同部位作为外植体，对培养的最终结果有很大的作用( p a r ke t a 1 ，1 9 9 7 ) 。愈伤组织和根一般从叶的基部和顶端发生，胚一般在叶缘处发生，而 不定芽仅能从中脉形成。 在叶片愈伤组织形成过程中，叶片外植体上叶肉中的小叶脉周围以及主脉中 的薄壁细胞首先启动，脱分化而进行分裂，形成分生细胞团，继而形成愈伤组织。 在此过程中，细胞壁以及细胞器也发生了相应的变化( 暨淑仪等，1 9 9 5 ) 。 以幼叶为材料在不同的2 4 一d 水平的培养基中培养，在叶的基部能直接或经 胚性愈伤组织诱导出体细胞胚，这种诱导效果与叶龄成反比。组织学观察表明体 细胞胚起源于叶片中脉( k a t o e ta 1 ，1 9 9 6 ) 。 茶树叶柄具有较强的芽、胚状体、胚性细胞团分化能力( 刘德华等，1 9 8 9 a ) 。 经过培养，在叶柄和愈伤组织交界处，有些微小突起能发育成芽，其成芽过程 与子叶柄、下胚轴培养直接形成芽大致相似。而愈伤组织经过培养，在其皱起的 表面形成胚状体。 1 1 6 细胞培养 茶树的细胞培养报道尚不多见。杜克久等( 1 9 9 7 ) 利用胚性细胞的悬浮培养 物，建立了高频率同步化体细胞胚发生及体胚苗形成体系。暗条件在体细胞胚的 诱导阶段对体细胞胚分化有一定作用，可能是与抑制了酚类、质体醌、类黄酮等 次生物质的形成有关。 悬浮培养条件下观察到体细胞胚发育过程与合子胚类似( 杜克久等，1 9 9 7 ) 。 细胞首先进入球形原胚阶段，然后进入球形胚阶段，接着进入心形期、鱼雷期， 最后发育成小植株。 1 1 7 生根诱导 不同的器官诱导生根的能力有所不同( k i m1 9 8 6 ) 。叶片为2 9 4 5 ，茎为 5 0 1 5 ，而根为4 3 9 5 。 1 1 8 植物生长调节剂的影响 不同的品科t 、不同的起始培养材料，其要求的激素种类、绝对量及其比值的 差别很大。其中的规律尚不清楚，一般均需要通过试验摸索最佳的培养条件。 子叶培养在单独使用2 4 d 其用量在1 5m g l 以下时对胚状体的形成有促进 作用，用量超过1 5m g l 时不形成胚状体。2 4 一d 与k t 或b a 配合使用时则能 提高胚状体的分化率。但培养基中生长调节物质含量的多少与胚状体的分化率之 间并无明显的规律。b a 在茶树胚状体分化及假胚珠的继代繁殖上的效果是良好 的，但在此培养基上只有极少数的胚状体成苗。在含z t2 m g l 和n a a 0 5 m g l 的培养基上，不管是否脱离外植体及假珠芽，经过1 个月的培养胚状体都能长成 小植株( 颜慕勤等，1 9 8 3 ) 。 对于培养腋芽，添加了lm 【g l 赤霉素的培养基中腋芽生长较好。可能赤霉 素起着很重要的作用( 刘德华等，1 9 9 1 ) 。并且赤霉素的添加对畸形胚的分化及 正常胚转化成畸形胚有促进作用( 刘德华等，1 9 9 9 a ) 。 以愈伤组织为外植体，在添加了a d e5m g l 和n a aim g l 的1 2 m s 培养 基上进行培养，其胚状体和芽的分化率较高，可能腺嘌呤、赤霉素对芽的分化有 促进生产( 刘德华等，1 9 9 1 ) 。 在子叶柄诱导胚状体、胚性细胞团的研究中( 刘德华等，1 9 8 9 b ) ，以添加 b al m g l 、i b a 2m g l 的效果较好，胚状体和胚性细胞团分化率商，但生长缓 慢。而以在添加b a1m g l 、i b a2m g l 的基础上再添加g a 33m g l 的效果最 佳。 在子叶柄培养中，在培养基中添加2 5m g lb a 和0 5m g ln a a 对芽的分 化最有利( 蒋祖丰，1 9 8 8 ) 。 在悬浮培养体细胞胚诱导期间，胚分化需要一个较低浓度的2 4 一d 的诱导过 程，高浓度的2 4 一d 明显地降低了其产生的体细胞胚质量，而a b a 有利于高质 量体细胞胚的形成。这种效果与激素影响了体细胞胚内蛋白质的积累有关( 杜克 久等，1 9 9 7 ) 。 无菌苗经过4 周培养，有大约1 的培养材料即可在添加了1 0 “m 的i b a 的 培养基上诱导出根( p a r k e ta l ，1 9 9 7 ) 。无菌苗诱导生根比较容易，我们的实验表 明培养材料用不同浓度的i b a 均可有效地诱导生根。 研究表明，有一些新型植物生长调节剂在茶树组织培养中的作用优于2 4 一d 和n a a ，并能有效地诱导体细胞胚的产生，如p b o a ( p h e n y l b o r o n i c a c i d ) 、t p b ( t e t r a p h e n y l b o r o n ) 等。另外如芸苔素( 2 ，3 ，3 3 1 3 ，2 3 1 3 一t e t r a h y d r o x y 一2 4 1 3 - m e t h y l d h o m o 7 0 x a 5 一c h o l e s t a n 一6 o n e ) 也有较好的作用( p o n s a m u e le ta 1 ，1 9 9 6 ) 1 2 茶树转化系统研究进展 植物遗传转化是指利用生物及物理化学的等手段，将外源基因导入植物细 胞，以获得转基因植物的技术。近年来已经有许多的植物遗传转化体系得到了应 用，如农杆菌法、基因枪法、电激法等。在茶树的遗传转化研究方面中，虽然已 经开展了一些比较初步的研究，尚处于起步阶段，并且均是利用农杆菌系统完成 的。 1 2 1 抗生素浓度的选择 在植物的转化研究中，由于许多常用的植物表达载体带有n p t i i 基因，因 而卡那霉素( k a n ) 是一种常用的选择抗生素。k a n 对茶树愈伤组织的发生有一 定的抑制作用，一般超过5 0m g l 后，茶树很难再产生愈伤组织。因而实际中使 用的浓度在5 0m g l 左右( 骆颖颖等，2 0 0 0 ；奚彪，1 9 9 5 ) ，但也有高达2 0 0m g l ( m a t s u m o t oe ta 1 ，1 9 9 8 ) 。在很强的选择压条件下，可能会强烈抑制非转化组织 发育，减少后期的筛选工作。 在诱导芽分化时，较低的k a n 即可起到抑制茶树芽分化。而在诱导根分化 时，苗对k a n 的抗性有了较大的提高( 奚彪等，1 9 9 7 ) 。这种变化可能与培养材 料的生理状况有关。 1 - 2 2 农杆菌菌株对茶树遗传转化的影响 用于遗传转化的农杆菌一般分为根癌农杆菌和发根农杆菌，根癌农杆菌根据 其诱导植物细胞产生的冠瘿碱种类不同分为三种类型，即章鱼碱型( c o t o p i n e t y p e ) 、胭脂碱型( n o p a l i n et y p e ) 和农杆碱型( a b r o p i nt y p e ) 。 青岛洋一等( 1 9 9 8 ) 用e h a l o l 、l b a 4 4 0 4 、p c 2 7 6 0 、g v 3 1 0 1 和m p 9 等5 种农杆菌侵染茶树的子叶，结果发现e h a l 0 1 的侵染效果最好，g u s 的瞬间表 达率最高达到6 0 ，其次是p c 2 7 6 0 和l b a 4 4 0 4 ，g u s 瞬间表达分别为3 4 年e 1 2 8 ，而g v 3 1 0 1 较差，g u s 瞬间表达为4 左右，m p 9 几乎没有效果。 k o n w a r 等( 1 9 9 8 ) 用发根农杆菌侵染茶树幼茎后，在三种不同的培养基上 培养。经过3 2 4 5 天即可发根，且发根率在3 4 6 6 之间。由于在侵染时整个茎 均在溶液中，故在整个茎的表面都有根的生长。一般认为农杆菌的侵染过程是发 生于伤口处，但该试验结果与此有所不同。我们实验室( 奚彪等，1 9 9 7 ) 用几种 不同类型的发根农杆菌侵染茶树，发现不同菌株对侵染效果有一定的影响，并且 需要较强的侵染条件才能诱导毛状根的发生。 1 2 t 3 启动子的影响 启动子的强弱，直接决定了目标基因表达的强弱，及表达特点，因而表达载 体的不同，所带的启动子也就不同，从而会影响到农杆菌侵染的效果。青岛洋 等( 1 9 9 8 ) 用带有两种不同的启动子的载体进行试验，发现用 e 7 - p 3 5 s o 】嚣换 p 3 5 s 后，其g u s 瞬间表达可增加1 0 左右。不同的农杆菌，其促进的效果有所 差异。但对于g v 3 1 0 1 ，p 3 5 s 启动子优于 e 7 p 3 5 s q 1 o 从实验中的结果可以发 现启动子与农杆菌存在一定的相互关系。 1 2 4 光照的影响 试验发现光对某些植物的遗传转化有抑制作用，所以一般转化在共培养阶段 均是采用2 8 暗培养。在茶树的转化中，培养条件也是采用2 8 c 暗培养2 - 3 天 ( m a t s u m o t oe ta 1 ，1 9 9 8 ，骆颖颖等，2 0 0 0 ) ，均获得了较好的效果。 但也有研究表明，在1 6 小时光照的培养条件下，g u s 瞬间表达比在完全暗 培养条件下有较大的提高，其促进的幅度随试验材料的不同而有所不同，最高可 达到7 0 左右( 青岛洋一等，1 9 9 8 ) 。k o n w a r 等( 1 9 9 8 ) 用1 2 小时的光照也得 到了较好的效果。 1 2 5 乙酰丁香酮对茶树遗传转化的影响 乙酰丁香酮在农杆菌介导的遗传转化中起重要的作用，它能使农杆菌向伤口 处集中，促进侵染过程的发生。在根癌农杆菌侵染茶树的研究中( m a t s u m o t oe ta l ， 1 9 9 8 ) ，没有添加乙酰丁香酮的处理中，没有出现抗性愈伤组织。而乙酰丁香酮 在1 0u m 时，有1 5 的愈伤组织的生长指数为1 。乙酰丁香酮浓度增加到l o o g m 时，有3 5 的愈伤组织的生长指数为1 ，2 0 的愈伤组织的生长指数为2 。而当 乙酰丁香酮浓度增加到5 0 0 t m 时，愈伤组织中生长指数为1 的有4 5 ，生长指 数为2 的有l o ，而生长指数为3 的占2 5 。 在我们实验室的发根农杆菌转化茶树的研究中( 奚彪等，1 9 9 7 ) ，发现在1 0 0 m g l ( 约5 0 0i t m ) 乙酰丁香酮的条件下，仍然必须有较强的侵染条件才能诱导 毛状根的发生。对于大多数植物，乙酰丁香酮的工作浓度在0 1 - 1 0 0g m ，而茶树 所需的浓度大大超过这个范围，可能与茶树具有较强的次生代谢有关，如与茶树 中富含多酚类有关。 1 3 茶树基因克隆研究进展 伴随着生物学，尤其是分子生物学的发展，在对茶树的研究过程中，越来越 多的基因被克隆。这为进一步从分子生物学角度研究这些基因的功能、结构、调 控等打下了基础，为进一步通过基因工程来调控其表达提供了前提。 茶树主要特点之一是次生代谢较为复杂，有许多次生代谢产物如茶多酚、咖 啡碱等对人体有着一定的生理作用。由于对这些方面比较重视，基础的研究较多， 因而茶树中被克隆的基因多数是与次生代谢途径有关酶类。 目前茶树中已经克隆的基因在g e n b a n k 中登录的有九个，见表1 1 。 9 表1 1 已经克隆的茶树基因 t a b l e1 一g e n e c 1 o n e do f t e ap l a n t 基因名称登录号k 度作者登录时间 n a m ea c c e s sn o ：l e n g t ha u t h o rt i m e 5 二磷酸核酮糖羧化酶x 6 9 7 3 29 0 0 b p s a v o l a i n e ne ta l1 9 9 2 1 l 注：本表资料从g e n b a n k 中整理 从已经克隆的基因看，除了一个与光合作用有关的酶基因外，另外的6 种酶 基因均为参与和影响茶树的次生代谢途径的酶类基因。其中与茶叶的生理功能有 着重要关系的多酚氧化酶基因和咖啡碱合成酶基因均已被克隆，因而今后有可能 利用分子生物学手段调控这些基因在茶树体内相关代谢途径中的表达，使茶叶中 的多酚类和咖啡碱的含量得到控制，如生产无咖啡碱的茶叶，使之更加符合人类 的需要( k a t oe ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 茶树的种植历史很长，流传的地区很广，因而其相互之间的关系比较复杂。 利用传统的分类方法不能完全解决问题。因而分子系统学研究也进入了茶树的系 统学研究领域。基因尤其是在功能上起重要作用的綦因一般变异不会很大，所以 用这些基因进行系统学所得到的数据比较可靠。在茶树中已经利用二磷酸核酮糖 羧化酶( r b c l ) 基因( s a v o l a i n e ne ta 1 ，1 9 9 4 ) 和苯丙氨酸解氨酶( p a l ) 基因 ( m a t s u m o t oe ta 1 ，1 9 9 4 ) 进行了这方面的研究。 1 4 植物多酚氧化酶基因的研究进展 1 4 1 分布 植物多酚氧化酶( p p o s ) 是含铜的金属蛋白，是由细胞核基因编码的酶。 无论是被子植物的光合组织还是非光合组织质粒的膜上或膜腔中，多酚氧化酶均 有分z l i ( d u t r ye ta 1 ，1 9 9 l ，l a xe ta 1 ，1 9 8 4 ，s h e r m a ne ta 1 ，1 9 9 1o 有证据表明，多 酚氧化酶仅存在于质体中( m a y e r e ta 1 ，1 9 7 9 ，v a u g h ne ta 1 ，1 9 8 4 ) 。 在马铃薯( s o l a n u mt u b e r o s u m ) r o ( t h y g e s e n e ta 1 ，1 9 9 5 ) ，葡匐茎、芽和根的 多酚氧化酶活性最高，幼叶和成熟块茎中活性中等，而成熟叶和茎中活性最低。 在花中，多酚氧化酶活性在生殖器官( 雌蕊和雄蕊) 中较高，花瓣和萼片较低。 叶片中的多酚氧化酶活性在最幼嫩( 至。dvo豸芒d1旨苦竺00v缶艺i童芷垂兰嚣ha鼍 sdh菱h1i五u_吕口岂ai_9 山di芷王口oz呈zld_1lo乱)l三1)lol芷山卜k_一差工：i乱l暮参山_1zsdh歪ji舌|ooo|n0们il占山岩芒n至千ohni舌nd凸当午凸击芒茁dl墨。凸兰di至d-1芒凸皇兰立01|岳艺m墅亡vh之d19至上hs著苎nns歪岩。上凸上-ll凸上9。0w-dhso舌n了od-n0丕生odl量od上o|d1芒上dooi葛l岳艺1毫芒生：11i至言一山上lns至。譬h1上nvi凸。口上凸n_ii-dooo。on1a口口干d0hv舌臣d0d_nd上lvdi呈adi口孓至生1v长da三型