第十二章 印迹杂交技术.pdf

第十二章第十二章 印迹杂交印迹杂交技术技术 Molecular hybridizationMolecular hybridization 指将指将电泳分离的电泳分离的样品（核酸或蛋样品（核酸或蛋 白质白质）从凝胶转移到印迹膜上）从凝胶转移到印迹膜上，然后然后 与与标记探针进行杂交来检测样品标记探针进行杂交来检测样品的方的方 法法。 印迹技术印迹技术( (blot)blot) 印迹法分类：印迹法分类： Southern Blot DNA印迹印迹 Northern Blot RNA印迹印迹 Western Blot 蛋白质印迹（免疫印迹蛋白质印迹（免疫印迹） Eastern Blot Western Blot的一种变形的一种变形 第一节第一节 核酸杂交的核酸杂交的 基本概念基本概念 核酸变性：核酸变性：在在某些理化因素某些理化因素作用下，核作用下，核 酸分子互补双链之间氢键断裂，使双螺酸分子互补双链之间氢键断裂，使双螺 旋结构松散变成单链的过程。旋结构松散变成单链的过程。 温度、酸碱、有温度、酸碱、有 机溶剂、尿素等机溶剂、尿素等 DNA变性：变性：在在变性因素变性因素作用下，作用下，DNA分分 子互补双链之间氢键断裂，使双螺旋结子互补双链之间氢键断裂，使双螺旋结 构解开成两条单链的过程。构解开成两条单链的过程。 DNA复性（复性（renaturation）：）：在适当条在适当条 件下，变性件下，变性DNA的两条互补链可恢复天的两条互补链可恢复天 然的双螺旋构象。然的双螺旋构象。 退火（退火（annealing）：）：热变性的热变性的DNA经缓经缓 慢冷却后即可复性。慢冷却后即可复性。 DNADNA变性的本质是双链间氢键的断裂变性的本质是双链间氢键的断裂 变性引起紫外吸收值的改变变性引起紫外吸收值的改变 DNA的紫外吸收光谱的紫外吸收光谱 增色效应：核酸在变性过程中260nm 波长吸收值（ A260 ）增加 减色效应：核酸在复性过程中260nm 波长吸收值（ A260 ）减小 DNA加热加热 50%DNA 发生变性发生变性 此时的温度此时的温度解链温度解链温度 （melting temperature, Tm） G GC C百分含量与百分含量与TmTm的关系的关系 核酸分子杂交核酸分子杂交 单链的核酸分子在合适条件下，与具有碱单链的核酸分子在合适条件下，与具有碱 基基互补序列的异源核酸形成杂化双互补序列的异源核酸形成杂化双链的过链的过 程。程。 核酸分子杂交可在DNA与DNA、DNA与RNA、RNA 与RNA的两条单链间进行。 核酸分子杂交的体系核酸分子杂交的体系 液相杂交：液相杂交：待测核酸和探针均游离于溶液。 固相杂交（常用）固相杂交（常用）：将待测核酸（或探针）固 定于固相支持物，然后与溶液中的游离探针（或 待测核酸）进行杂交，形成的杂交体结合于固相 支持物上。 第二节第二节 核酸探针与核酸探针与 标记标记 探针探针(probe) 能与待测的分子发生特异性相互作用， 并可被特殊的方法探知的分子（带有标记 物）。 探针的检测对象：核酸、蛋白质、细胞结构等。 除核酸探针外，探针利用抗体-抗原、配体-受 体等相互作用的原理与靶分子结合。 一、核酸探针一、核酸探针 带有标记物且序列已知的核酸片段， 能与待测核酸中的特定序列特异杂交。 核酸探针是否合适是决定核酸杂交分析 能否成功的关键。 核酸杂交与分子探针核酸杂交与分子探针 核酸探针应具有的条件核酸探针应具有的条件 特异性高：特异性高：只与待测核酸样品中的 互补序列杂交。 带有带有标记物：标记物：标记物灵敏度高而稳 定，检测方便。 核酸探针的种类核酸探针的种类 基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针 基因组基因组DNADNA探针探针 直接从基因组文库中筛选后、酶切制备； 或用PCR扩增基因组中的目的基因制备。 注意：尽可能用基因的编码顺序（外 显子）作为探针。 优点：制备简便；不易降解；标记方法 成熟。 包含目的基因的全部序列或部分序列， 是最常用的DNA探针。 cDNAcDNA探针探针 优点： mRNA逆转录而来，不含内含子等 非编码区，特异性高；适用于研究基因表达。 缺点：获取过程复杂，不易制备 RNARNA探针探针 是单链探针，所以不会自身退火，与待测 核酸的杂交效率较高，杂交体稳定性更好 不含高度重复序列，非特异性杂交也较少 杂交之后可以用Rnase将未杂交的游离RNA 探针降解，从而降低本底干扰 缺点：容易降解 寡核苷酸探针寡核苷酸探针 根据已知核酸序列人工合成的DNA探针； 或根据基因产物氨基酸序列推导合成。 复杂程度低，故杂交所需时间短； 是单链DNA探针，不会自身退火； 长度一般为1750 nt，只要其中有一 个碱基不配对就会影响杂交，可用于分 析点突变。 缺点：不如长的杂交核酸分子稳定。所 带标记物较少，特别是非放射性标记时， 灵敏度较低。因此当用于单拷贝基因的 Southern印迹杂交时，以采用较长的探 针为好。 核酸探针的选择核酸探针的选择 多数情况（DNA探针） 靶序列单个碱基改变，如SNP分析（寡 核苷酸探针） 复杂的靶核苷酸序列和病原体（特异性 较强的长的双链DNA探针） 组织原位杂交（寡核苷酸探针、短的 PCR标记探针（80150nt）易透过细 胞膜） 基因表达水平（长的核酸探针，可达 300nt） 二、核酸探针二、核酸探针标记物标记物 分类：放射性标记探针 非放射性标记探针 1.放射性同位素 应用广泛，以32P应用最普遍，放射 自显影；此外，还有3H、35S。 优点：灵敏度高； 缺点：放射性污染，半衰期短、不稳定等。 32P：产生产生 射线，灵敏度高，分辨率强，是最常用的放射性标记物，射线，灵敏度高，分辨率强，是最常用的放射性标记物， 但半衰期短（但半衰期短（14.3天）：天）： 位和位和 位标记。位标记。 35S：分辨率高、半衰期长（分辨率高、半衰期长（87.1天）敏感度低天）敏感度低 2.非放射性标记物 生物素： 一种小分子水溶性维生素，连接在碱基上 和抗生物素蛋白（avidin）特异结合 抗生物素蛋白上连接有显色物质(酶、荧光素等) 。 优点：无环境污染，可长时间贮存。 酶促显色：酶促显色： 碱性磷酸酶（ALP或AKP）：催化底物（5-溴-4-氯-4吲哚 磷酸，BCIP）和硝基蓝四氮唑（NBT），生成不溶性紫色 化合物二甲臜； 辣根过氧化物酶（HRP）：催化底物二氨基联苯胺（DAB） 生成红棕色沉淀物；或催化底物四氨基联苯胺（TMB）生 成蓝色沉淀物。 地高辛： 一种类固醇半抗原分子 可利用其抗体进行免疫检测 原理类似于生物素的检测。 核酸探针标记的选择核酸探针标记的选择 灵敏度高（放射性探针） 灵敏度要求不高（非放射性探针，如保 存时间长的生物素探针和比较稳定的碱 性磷酸酶显示系统） 常用的放射性同位素：3H标记探针半衰 期长、成像分辨率高、便于定位，但能 量低；35S标记探针活性高、成像分辨率 也好；32P能量过高，易使影像模糊，不 利于确定杂交位点。 浓度：过度会产生较高本底，一般不超 过100ng/ml。 三、核酸探针三、核酸探针的制备的制备 常将标记物连接到某种脱氧核糖核苷三磷 酸(dNTP)上，然后可通过切口平移法、随 机引物法、PCR标记法、末端标记法等标 记探针。 切口平移切口平移法法 反应成分：反应成分： Dnase I、E coli DNApol I， dATP、dGTP、dTTP、32P-dCTP， 待标记的待标记的DNA片段片段 标记结果：标记结果： 两条链都均匀标记两条链都均匀标记。 切口平移切口平移法法 限量DNase I在待标记的双连DNA的每一条连上产生若干个单连 缺口； 利用E.coli DNA DNApol I 的5-3外切酶活性和5-3聚合酶活性， 在缺口处5末端每切除一个核苷酸，则在3末端添加一个核苷酸， 以修补缺口。 随着缺口在5末端的移动修饰的核苷酸就掺入到新合成的DNA连 中。 随机寡核苷酸引物（random primer)： 含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段 （6-10nt）的混合物，可以与任意核酸序列 杂交，起到聚合酶反应引物的作用。 随机引物法（随机引物法（randomrandom priming )priming ) E.coli DNA聚合酶I的Klenow大片段（仅 具有5-3聚合酶的活性，而无外切酶的 活性） 随机引物法（随机引物法（randomrandom priming )priming ) 反应成分：随机聚核苷酸引物，待标记DNA模板，Klenow 片段，dNTP中一种带放射性标记。 PCRPCR标记法标记法 在PCR反应底物中，将一种dNTP换成标 记物标记的dNTP，这样标记的dNTP就 可在PCR反应的同时掺入到新合成的 DNA链上。 末端标记法末端标记法 DNA末端标记法只是将DNA片段的一端（5 端或3端）进行部分标记。 缺点：标记活性不高，标记物掺入率低， 一般极少用做核酸分子杂交探针标记。 第三节第三节 固相支持物与印迹固相支持物与印迹 DNA印迹杂交的主要步骤印迹杂交的主要步骤 待测待测DNA样品的制备、酶切样品的制备、酶切 待测待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 凝胶中凝胶中DNA的变性：碱变性的变性：碱变性 印迹（转膜）：印迹（转膜）： 硝酸纤维素硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜、尼龙膜膜 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 预杂交（封闭）预杂交（封闭） 探针的制备探针的制备 固相膜上杂交（控制温度）固相膜上杂交（控制温度） 洗膜：除去游离的探针洗膜：除去游离的探针 杂交信号的检测杂交信号的检测 固相支持物与有效的印迹方法是印 迹技术成败的关键。 常用固相支持物常用固相支持物 1）硝酸纤维素膜（）硝酸纤维素膜（nitrocellulose filter membrane） 优点：优点： 结合量大：结合量大：高盐吸附单链DNA和RNA达 80g/cm2 150g/cm2 应用广泛：应用广泛：DNA印迹、RNA印迹、蛋白质印 迹、菌落杂交、噬菌斑杂交、斑点杂交等 本底较低、操作简单本底较低、操作简单。 常用固相支持物常用固相支持物 1）硝酸纤维素膜（）硝酸纤维素膜（nitrocellulose filter membrane） 缺点：缺点： 不易洗膜：不易洗膜：真空烘干后，依靠疏水性相互作 用，因此亲和力低，杂交后漂洗时易被洗掉 （特别200nt的DNA片段、蛋白质印迹时）； 与核酸结合依赖高与核酸结合依赖高盐：盐：低盐结合不佳，不易 核酸电转； 碱性条件不能结合核酸；碱性条件不能结合核酸； 不易反复杂交：质地不易反复杂交：质地较脆，烘烤后更较脆，烘烤后更甚甚 2）尼龙膜（）尼龙膜（nylon membrane） 结合单链DNA和RNA的能力比NC膜强（达 350g/cm2 500 g/ cm2 ）。 真空烘干后或紫外线照射可强化结合（短波UV照射 后, 部分嘧啶碱基与其氨基交联，更加牢固）。 微波处理和碱处理也可促结合，从而使细菌裂解、 DNA变性与固定一步完成（菌落原位杂交）。 韧性较强，操作方便。 能结合小分子核酸。 低盐也能很好结合（可用于核酸电转移）。 可反复杂交和洗膜。 杂交本底较高；不能用于蛋白质印迹。 3）聚偏氟乙烯膜（）聚偏氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride， PVDF膜）膜） 常用于蛋白质印迹 膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低 分子量的蛋白结合就越牢固。 具有较高的机械强度，可进行多轮杂交。 缺点缺点：本底较高、不能用于荧光分析；使用时需要 甲醇或乙醇处理以活化膜上阳离子基团（易与带负电 的蛋白质结合）。 是指将是指将核酸、蛋白质核酸、蛋白质等等生物大分子从凝生物大分子从凝 胶转移到合适的印迹膜胶转移到合适的印迹膜上的过程上的过程。转移转移后各后各 待待测样品在印迹膜测样品在印迹膜上的相对位置和在凝胶上的相对位置和在凝胶中中 时一样时一样。 转膜（印迹，blotting） （1 1）电转移法电转移法 （2 2）物理吸物理吸印法印法（毛细（毛细虹吸、真空虹吸、真空抽吸抽吸） 1）电转移法电转移法 一般用尼龙膜作电转移的载体（NC膜不行） 单链DNA和RNA可进行转移，双链DNA先在原位进 行碱变性，随后中和，再转移 特点：转移快，2-3小时即可； 上行毛细管转移上行毛细管转移 凝胶凝胶 滤纸滤纸 玻璃板玻璃板 重物（重物（500g） 转移缓冲液转移缓冲液 滤纸滤纸 NC膜或尼龙膜膜或尼龙膜 吸水纸吸水纸 2）毛细管虹吸转移法毛细管虹吸转移法 下行毛细管转移下行毛细管转移 3）真空转移法真空转移法 使用真空转移装置，较毛细管转移更为有效，快捷 第四节第四节 常用核酸杂交技术常用核酸杂交技术 核酸杂交技术的核酸杂交技术的应用应用 研究DNA分子中某一种基因的位置 确定两种核酸分子间的序列相似性 检测某些专一序列在待检样品中存在与否 是基因芯片技术的基础 常用核酸杂交分类常用核酸杂交分类 Southern印迹印迹 检测经凝胶电泳分开的检测经凝胶电泳分开的DNA 分子分子,需转印到膜上需转印到膜上 Northern印迹印迹 检测经凝胶电泳分开的检测经凝胶电泳分开的RNA 分子分子,需转移到膜上需转移到膜上 斑点杂交斑点杂交 检测检测未经分离的未经分离的,固定在膜上的固定在膜上的 DNA或或RNA分子分子 菌落杂交和噬斑杂交菌落杂交和噬斑杂交 检测固定在膜上的检测固定在膜上的,经裂解后从经裂解后从 细菌和噬菌体中释放的细菌和噬菌体中释放的 DNA分子分子 原位杂交原位杂交 检测细胞或组织中的检测细胞或组织中的DNA或或 RNA分子分子 杂交方法杂交方法 适用范围适用范围 一、一、DNA印迹法（印迹法（Southern blot） 将电泳分离的待测将电泳分离的待测DNA片段转移并结片段转移并结 合到一定的固相支持物上，然后用标记的合到一定的固相支持物上，然后用标记的 DNA探针检测待测探针检测待测DNA的一种方法。的一种方法。 用途：用途：检测检测DNA（目的（目的DNA的存在、大小、的存在、大小、 多态性，及基因突拷贝数、突变、扩增等）多态性，及基因突拷贝数、突变、扩增等） DNA提取提取 DNA印迹印迹 放放 射射 自自 显显 影影 照照 片片 二、二、RNA印迹法（印迹法（Northern blot） 操作：与Southern印迹极为相似，但不需要酶切可直 接变性转移； RNA经变性后再电泳（可用甲酰胺、甲醛等 使RNA变性，不能用碱，易使RNA降解）； 电泳时不能加EB，影响RNA与膜结合； 严防RNase污染。 用途：检测RNA（定性或定量分析细胞内总RNA或 某一特定RNA，特别是分析mRNA的大小和含 量）研究基因插入缺失等突变、基因表达（金 标准）。 三、斑点杂交三、斑点杂交和狭缝杂交法和狭缝杂交法 操作：不做电泳分离，将DNA、RNA样品变 性后点在干的NC上，与探针杂交。 用途：检测DNA样品同源性、细胞内特定基 因拷贝数；mRNA的相对含量。 四、菌落四、菌落杂交法和噬菌斑杂交法杂交法和噬菌斑杂交法 操作： NC膜拓印培养的菌落 原位裂解菌落、释放DNA 预杂交、杂交、杂交结果分析 从原培养皿筛选含目的DNA的阳性菌落。 用途：筛选含有特异DNA序列的阳性菌落 或噬菌斑 菌落杂交菌落杂交 概念：用特定标记的已知序 列核酸作为探针与细胞或组 织切片中核酸进行杂交并对 其实行检测的方法，称为原 位杂交（in situ hybridization) 用途：研究核酸序列在染色 体中的精确定位； 研究细胞 特定基因表达水平；确定组 织有无病原体感染等。 五、原位杂交五、原位杂交 六、等位基因六、等位基因特异性寡核苷酸杂交法特异性寡核苷酸杂交法 （ASOH） 根据已知基因突变位点的核苷酸序列， 人工合成两种寡核苷酸探针： 纯合子纯合子 杂合子杂合子 正常正常 病变基因探针（病变基因探针（M） 正常基因探针（正常基因探针（N） 基因缺陷基因缺陷 ASOH检测苯丙酮酸尿症检测苯丙酮酸尿症 第五节第五节 蛋白质印迹蛋白质印迹 蛋白质印迹（western blotting）：又称免疫 印迹（immunoblotting），可对转移至膜上 的蛋白质进行连续分析。 常用于鉴定蛋白质样品中的目的蛋白，和 检测目的蛋白在不同组织细胞的相对含量。 蛋白质印迹法的基本步骤蛋白质印迹法的基本步骤 1. 蛋白质样本制备裂解细胞、沉淀并粗提样品蛋白 2. 电泳分离SDS-PAGE分离 3. 印迹电转移法（只能用该法）转至固相膜（NC 或PVDF） 4. 封闭（预杂交）用非特异性蛋白（如血清白蛋白、 酪蛋白）封闭印迹膜上未结合样品蛋白的吸附点。封闭 剂常用浓度5%过高影响目的蛋白与抗体的结合。 5. 检测分析常用抗原-抗体反应检测印迹膜上的目 的蛋白（常用的标记酶有辣根过氧化物酶或碱性磷酸