细胞培养箱消毒使用和维护.doc

_细胞室二氧化碳培养箱的消毒使用和维护体外培养的细胞和体内细胞一样，不仅需要营养物质，更需要一个稳定的生活环境，如温度、CO2浓度、湿度等，二氧化碳培养箱则是最佳选择。二氧化碳培养箱是在普通培养的基础上通过在培养箱箱体内模拟形成一个类似细胞在生物体内的生长环境，如合适的温度（37C）、恒定的CO2水平（常用5%）、稳定的酸碱度（pH值：7.2-7.4）、较高的相对饱和湿度（常用95%），来对细胞或组织进行体外培养的一种装置。其用途甚广，主要用来培养细胞、组织和某些特殊微生物，为它们提供一个良好的体外环境，广泛应用于细胞学实验、微生物学实验、组织学实验以及分子生物学实验。因此，CO2培养箱的消毒和维护尤为重要。1、二氧化碳培养箱的污染凡混入CO2培养箱(细胞培养环境)中，对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物都应视为污染。细胞持续在污染环境中生长时，轻者细胞生长缓慢，细胞分化变形，较重的细胞增殖停止，从瓶壁脱落，甚至死亡。不同的污染物对细胞的影响也有差别，有的影响是长期、缓慢和潜在的，而有的则能在很短的时间内抑制细胞生长或产生有毒物质杀害细胞。根据污染源不同主要可以分为：生物性污染、化学性污染、物理性污染和气溶胶污染。1.1 生物性污染：这是最常见也是危害最大的污染。如细菌、病毒、真菌，支原体等。这些污染源有可能是人为带入，或是细胞在放入培养箱前已经受污染，再或者是箱体本身没有消毒干净。体外培养的细胞自身没有抵抗污染的能力，而培养基中所加抗生素的抗微生物污染的能力也是有限的，因而细胞微生物污染一旦发生往往是无法挽救的。1.2 化学性污染：培养箱中许多化学物质都可以引起细胞污染。如细胞培养容器清洗过程中残留的洗涤剂、加湿器中未纯化的水、人为带入的液体或气体都可能成为化学性污染的来源。不同化学物质对细胞污染是不一样的，有的可能促进或抑制细胞生长，有的甚至杀死细胞。1.3 物理性污染：培养环境中的物理因素，如温度、放射线、振动、辐射(紫外线或荧光)会对细胞产生影响。物理性污染常常被人们所忽视或被笼统地归为化学性污染，其主要是在代谢水平或分子水平上，影响细胞正常的生理过程。1.4 气溶胶污染：气溶胶是液体或固体微粒均匀地悬浮在气体介质中的分散体系，当微粒是微生物时，就是微生物气溶胶，如果这种微生物是病原性的，就是病原微生物气溶胶。细菌、病毒等病原体通过气溶胶可在人与人、人与环境之间传播。微生物气溶胶可分为两大类：一类是飞沫核气溶胶，另一类是粉尘气溶胶。医学实验室内许多操作都可以产生气溶胶，并且大多可能是病原微生物形成的感染性气溶胶，由于其气溶胶分子小，漂浮在空气中、粘附于人身上，易在空气中扩散而污染实验室的空气。2、CO2培养箱污染防控措施2.1 CO2培养箱的选择：二氧化碳培养箱的制造商们设计了多种不同的装置去减少和防止污染的发生，其主要是防污染设计和消毒灭菌系统的改进，以达到消毒灭菌的目的。如带有紫外消毒功能的CO2培养箱、带HEPA过滤器的CO2培养箱，以及带高温消毒的CO2培养箱等，后者又分为高温干热和高温湿热两类。这些装置的灭菌能力各有千秋，紫外灯消毒范围有限，距离灯越远，消毒能力越差。HEPA过滤器的过滤膜孔径有限，无法去除病毒和一些微小细菌，并且容易损耗，也有其局限性。相比而言，高温消毒则是比较有效的方法。而高温干热和高温湿热也有所不同，由于蒸汽潜热大、穿透力强，容易使蛋白质变性或凝固，因此高温湿热的灭菌效率比干热灭菌法高。2.2 提高素质：人为因素和态度可以对环境、人和物起到一个正面或负面的影响。以安全为目的，实验室内的工作人员应明白自身的态度和人为因素对实验环境的重要性。因此，对实验室工作人员进行专业培训，特别是进实验室前的培训，并且定期进行考核检查是十分必要的。2.3 重视管理： 细胞室内的培养箱应由专人负责管理，定期对系统进行校正，至少每年一次。各项数值一旦固定后，不要随意调节，以免影响箱内温度、湿度、CO2浓度的波动，降低机器的灵敏度，同时还会影响培养箱内的细胞生产状态。使用前，对培养箱的各项指标进行系统校正，并且对箱体和内部进行消毒处理，等各项数值稳定一段时间后方可使用。一旦出现紧急问题，应及时上报，应由专业的人员进行操作，马上采取应对措施，以免造成不必要的损失。2.4 规范操作：培养箱的使用虽然很简单，但同样需要规范操作。进细胞室必须穿着实验服（白大褂），换上拖鞋或者穿一次性的鞋套。实验操作时必须带一次性手套，特别是打开培养箱前，必须先用75%的酒精喷壶喷洗双手再开培养箱，再取出细胞培养瓶或培养板。显微镜下查看细胞培养瓶或培养板后，再放回培养箱时，同样也要喷酒精消毒。培养箱的两个门开关取（放）物要迅速，不可长时间开着，否则会影响CO2的浓度、温度和湿度，以及造成污染。尤其是不要忘了关好里层的玻璃门。切记开门时不要对着培养箱说活，大口呼吸甚至是打喷嚏。2.5 加强防护：如果实验人员生病而携带病菌，应带上口罩再进细胞室，病情严重的则不宜进行实验。女性同志实验时头发应梳起，防止皮屑污染及连带事件的发生。如果实验室条件允许，可以每人佩戴实验帽、手套和口罩，以防污染培养箱及对实验人员的自身的防护。2.6 注重保养：二氧化碳培养箱置于细胞室中，室内需保持干燥，环境温度不能超过30（建议：18-30）。培养箱放置在远离门窗、供暖设备和空调导管的地方，不能被阳光直接照射。培养箱的放置台面必须水平避震且非易燃材质，不能靠在墙壁或类似的建筑物上，其后部接电处和墙壁至少保留30cm的空间。一旦放好不宜再移动。2.7 校正处理：二氧化碳培养箱在放好后，再对箱体和内部进行消毒处理，并且对各项指标进行系统校正，等各项数值稳定一段时间后方可使用。因CO2气体对于健康是有害的，因此细胞室需安装足够的通风装置。空气中的粉尘气溶胶易造成培养箱的污染，需要一个流通的空气环境。将培养箱的管理任务分派给有经验的检查人员是十分重要的。如长期不使用二氧化碳时，应将CO2开关关闭，防止CO2调节器失灵。3、清洁、消毒、灭菌处理3.1 清洁：清洁是指去除灰尘、污垢和有机污渍。清洁方法包括刷、吸、干擦、洗涤或用浸泡肥皂水或清洁剂的湿布拖擦。粉尘、污物以及有机物是微生物的栖身之所，并可能影响除污染剂（抗菌剂、化学杀菌剂以及消毒剂）的作用。必须先经过清洁才能实现消毒和灭菌的目的，许多杀菌剂只对经过清洁过的物品才具有杀菌活性。清洁时必须使用与以后使用的消毒剂或杀菌剂化学性质上相容的试剂进行清洁、消毒。3.1.1清洁箱体表面：先拂去表面的灰尘，再用湿的海绵或软布清洗，再用软布擦干。如果有污物则用低浓度的清洁剂清洗，然后擦干。3.1.2清洗箱体内部：选择合适的消毒剂。所有的物件和表面必须彻底清洗，然后用无菌水冲洗，再擦干或晾干。3.1.3清洗玻璃门：清洗箱内的玻璃门时使用的清洁剂和清洗培养箱内部时使用的相同。然后用蒸馏水漂洗，从而清除残留的清洁剂，最后用软布把门擦干。3.2 消毒和灭菌消毒是指杀死微生物的物理或化学手段，但不一定杀死其孢子。灭菌是指杀死所有微生物，当培养箱内细胞受到污染时则需要采取灭菌措施。一般，在培养箱内细胞没有污染的情况下平均1-3个月彻底消毒一次。最常用的3种消毒灭菌的方式是：液体消毒剂、紫外和加热。3.2.1 液体消毒剂：选择对培养箱无腐蚀性的液体消毒剂，并且液体消毒剂的消毒效果好坏和很多因素有关。比如：场所的温度、接触时间、pH、穿透能力、有机物的反应。这些因素中的一些很小的变化可能会造成去污剂的效力上大的不同。因此甚至在很有利的情况下，当最终要求必须无菌时，液体去污剂也不是完全可信赖的去污方法。3.2.2 紫外消毒：一般先用蒸馏水清洗干净后，再用紫外灯照射(带紫外灯的培养箱)一天或者用手提式的紫外灯照射。3.2.3 加热：湿热和干热被认为是杀菌最有效的方法。在一般环境下，高压灭菌器加热到121快速产生蒸汽是最方便的方法。干热160-170，2-4小时在不具有渗透性、非有机体的物质（如玻璃）是可行的净化方法, 但是甚至在有机体或非有机体的浅层也不能被绝缘。除了以上几种方法外，还可以采用联合杀菌的方法，几种消毒灭菌的方法同时使用来达到彻底清洁的效果。3.3 细胞室内空气的消毒3.3.1 联合消毒法：可以联合使用液体和气体消毒剂来清除实验室空间、用具和设备的污染。清除表面污染时可以使用次氯酸钠溶液：浓度0.1溶液用于普通的环境卫生设备，而当处理高危环境时，建议使用高浓度（0.5）的溶液。在清除环境污染时，含有3过氧化氢的溶液也可以作为漂白剂的代用品。3.3.2 熏蒸法：通过加热多聚甲醛或煮沸福尔马林所产生的甲醛蒸汽熏蒸来清除房间和仪器的污染。这是一项需要由专门培训的专业人员来进行的、非常危险的操作。产生甲醛蒸汽前，房间的所有开口（如门窗等）都应用密封带或类似物加以密封。熏蒸应当在室温不低于21且相对湿度高于70的条件下进行。熏蒸法消毒时，气体需要与物体表面接触至少8小时，而熏蒸后，该区域必须彻底通风后才能允许人员进入。3.4 消毒注意事项：3.4.1 不要使用强碱和强腐蚀性的试剂以及含高含量次氯酸钠的漂白剂和消毒剂，虽然不锈钢有耐腐蚀性，但不是不受腐蚀。3.4.2 避免在CO2传感器上喷洒清洗剂，清洗之前要使传感器充分冷却。一般清洗用的水是蒸馏水或去离子水，不能用自来水。3.4.3 挥发性的甲醛有毒，易燃、易爆。如果在培养箱内残留甲醛的话，会影响细胞正常生长，甚至使细胞死亡。参考文献1苏丽东.不同消毒方法对