菊黄上清含片抗流感病毒的研究.doc

菊黄上清含片抗流感病毒的研究 作者：骆勇，李翠兵，兰燕宇，左丽【摘要】 目的： 研究菊黄上清含片在小鼠体内的抗流感病毒作用。方法: 以流感病毒鼠肺适应株FM1滴鼻感染小鼠，用高、中、低浓度菊黄上清含片药液灌胃小鼠，观察小鼠的生存时间、死亡率、肺指数和肺组织病变程度。结果: 菊黄上清含片对流感病毒FM1致小鼠肺病变有明显抑制作用，对流感病毒FM1感染小鼠具有显著的保护作用，明显抑制小鼠体内流感病毒FM1的增殖。结论: 菊黄上清含具有明显的抗流感病毒作用。 【关键词】 病毒； 感冒； 菊黄上清含片； 死亡率； 肺炎，病毒性；病理学； 小鼠Abstract Objective: To study the effects of Juhuangshangqing buccal tablet against influenza virus. Methods: Mouse influenza infection model was established by nose dripping with stock FM4 of influenza virus which was adapted to mouse lung specially. Juhuangshangqing buccal tablets were given to the experimental mice with different amounts, and their survival time, mortality, lung index, and pathological change degree of lung tissue were observed. Results: Juhuangshangqing buccal showed obvious inhibitory effect to pulmonary pathological changes, and reduced virus multiplication and mortality of influenza virus infected mice. Conclusions: Juhuangshangqing buccal tablets have obvious effects against influenza virus.Key words viruses; common cold; Juhuangshangqing buccal；mortality; pneumonia, viral；pathology；mice 菊黄上清含片（JH）是由羊耳菊、甘草、黄芩、冰片四味药材经提取加工、用现代药物制剂手段研制成的口含片，具有疏风清热，解毒利咽之功效，适用于治疗热毒内蕴、挟风上扰所致咽痛、咽干灼热、吞咽不利、 舌边尖红等症。处方中甘草药材中的甘草酸类化合物（甘草酸、甘草次酸）和黄芩药材中的黄酮类化合物（黄芩苷）都有较好的抗病毒作用1,2。为了进一步为临床应用提供实验依据，对JH的体内抗流感病毒作用进行了实验研究。1 材料与方法1.1 药物JH干浸膏（批号20021016-1）由贵阳医学院药物研究开发中心提供；病毒唑，批号020705，由贵州光正制药有限公司生产；抗病毒颗粒，批号02121011，由四川光大制药有限公司生产；羊抗兔IgG荧光抗体，由晶美生物工程公司生产。1.2 动物昆明种小鼠，符合国家一级实验动物标准，体重1822 g，雌雄兼用，合格证号SCXK（黔）2002-0001，由贵阳医学院实验动物中心提供。1.3 病毒、流感病毒FM1毒株兔免疫血清流感病毒鼠肺适应株（FM1），由贵阳医学院免疫学教研室提供。用流感病毒FM110 ml免疫家兔，10 d后试血，血凝效价高于1640即取血，分离血清，小管分装，-80 冻存备用。1.4 JH对小鼠的急性毒性测定取小鼠40只，随机分成4组，每组10只。将JH用生理盐水稀释成2 g/ml、1 g/ml、0.5 g/ml浓度的药液，正常对照组灌胃等容积生理盐水，给药组每只小鼠给予高、中、低浓度JH药液0.4 ml/10 g，灌胃2次（间隔4 h），给药后观察小鼠的中毒症状及死亡情况，连续观察7 d，以不产生中毒及死亡的剂量为无毒剂量3。1.5 流感病毒FM1的LD50测定取小鼠40只，随机分成5组，每组8只，留一组作正常饲养对照组，其余各组动物在乙醚轻度麻醉下，用不同稀释度10-6、10-5、10-4、10-3的流感病毒FM1滴鼻感染小鼠，每只0.05ml。感染后每日观察记录小鼠死亡数，连续观察14 d，按Reed and Muench法4计算流感病毒FM1的LD50。1.6 JH对流感病毒FM1致小鼠肺炎的影响取小鼠70只，按表1随机分成7组，每组10只；除正常对照组外，其余小鼠用乙醚轻度麻醉，以15倍LD50的流感病毒FM1滴鼻，每只0.05 ml。给药组按表1剂量，于感染前一天开始灌胃给药，每天1次，连续5 d，正常对照组同法给等容积生理盐水。感染第6天称体重（禁水8 h），处死动物，解剖取肺清洗，去除气管、肺门淋巴结等组织，用滤纸吸干水分，称重，肉眼观察肺部病变，计算肺指数和抑制率5。肺指数=肺重（g）/体重（g）100，肺指数抑制率（%）=（病毒对照组平均肺指数试验组平均肺指数）/病毒对照组平均肺指数100%。1.7 JH对流感病毒FM1感染小鼠的保护作用取小鼠140只，随机分成7组，每组20只。按表2剂量灌胃给药，每天1次，连续5 d，正常对照组给等容积生理盐水。给药后第2天各组小鼠用乙醚轻度麻醉，以30倍LD50流感病毒FM1滴鼻，每只0.05 ml。从感染病毒之日起连续观察14 d，逐日记录动物症状及死亡数。计算保护率（%）、延长生命率（%）6。贵阳医学院学报 34卷 6期骆 勇等 菊黄上清含片抗流感病毒的研究保护率（%）=（病毒对照组死亡率试验组死亡率）100%；延长生命率（%）=（试验组平均存活天数-病毒对照组平均存活天数）/病毒对照组平均存活天数100%。1.8 JH对小鼠体内流感病毒增殖的影响取小鼠50只，随机分为5组，每组10只，在乙醚轻度麻醉下，以1 000倍LD50流感病毒FM1感染小鼠，感染前1天，用不同浓度的受试药物和病毒唑溶液按表3剂量分别给小鼠灌胃。连续给药3 d，在感染48 h后，解剖取肺，固定，制成切片并脱蜡；用流感病毒FM1兔免疫血清37 作用30 min，0.01 mol/L PBS(pH7.4)轻洗3次，再加110的羊抗兔IgG荧光抗体37 15 min，0.01mol/L PBS(pH7.4)轻洗3次，吸干水分，荧光显微镜下计数各组小鼠细支气管内含特异性荧光抗体颗粒，用切片上的细支气管截面总数与腔内呈特异性荧光颗粒的细支气管截面数，计算各组小鼠的肺切片内的特异性荧光颗粒的百分率。特异性荧光比率（%）=（阳性细支气管截面数/细支气管截面总数）100%.1.9 统计方法试验数据以（xs）表示，计量资料采用Studentt检验，计数资料采用秩和检验。2 结果2.1 毒性作用JH对小鼠的最大无毒浓度为1 g/ml，相当于80 g/kg，即临床用量的200倍。2.2 流感病毒FM1的LD50流感病毒FM1的 LD50为10-4.86。2.3 JH对流感病毒FM1致小鼠肺炎的影响各给药组对流感病毒FM1株所致肺病变有明显抑制作用，与病毒对照组比较有显著性差异（P<0.05、P<0.01），见表1。表1 各组小鼠肺指数和肺指数抑制率（略）注：（1）与正常对照组比较，P<0.01；与病毒对照组比较，（2）P<0.05,（3）P<0.01。2.4 JH对流感病毒FM1感染小鼠的保护作用JH中剂量和高剂量组对流感病毒FM1感染小鼠具有保护作用，与病毒对照组比较，高、中剂量组平均存活天数、保护率和延长生命率有显著性差异（P<0.05、P<0.01），见表2。表2 各组小鼠死亡率比较（略）注：与病毒对照组比较，(1)P<0.05,(2)P<0.01。2.5 JH对小鼠体内流感病毒增殖的影响 各剂量给药组对流感病毒FM1在小鼠体内的增殖均有明显的抑制作用,与病毒对照组比较有显著性差异，（P<0. 05、P<0. 01）结果见表3。表3 各组小鼠体内人流感病毒增殖率比较（略）3 讨论 JH方中含有甘草和黄芩等药材。甘草药材中的甘草酸类化合物通过对多种病毒颗粒的直接作用和诱生干扰素作用，增强天然杀伤细胞和巨噬细胞的活性等活化宿主免疫功能，发挥广谱抗病毒作用。研究表明，甘草酸能破坏试管内的艾滋病病毒(HIV)，抑制体外HIV的增 殖作用。0.5 g/g的甘草酸对HIV增殖抑制率达98以上，50%病灶形成抑制浓度为0.125 g/L；用甘草甜素给艾滋病毒患者连续注射1个月，可使部分患者血清中病毒抗原浓度降至不能测出的水平，说明甘草甜素能抗 HIV的复制；0.5 g/L的甘草甜素可使98%以上HIV增殖受到抑制，具有预防艾滋病毒作用；甘草甜素还能直接抑制肝细胞中单纯疱I型病毒糖蛋白的合成，从而抑制病毒的复制；甘草次酸对单纯性疱疹病毒有特异性作用7。 Nagai8发现，黄芩黄酮F36可抗流感病毒A和B，通过抑制病毒膜与病毒感染周期前期红细胞浆质溶酶体膜溶合，抑制病毒在基质中释放及其与脂质体结合，抑制病毒在肺中的增殖。永井隆之9认为，黄芩黄酮F36对流感病毒(IFV)的唾液酸酶有特异的抑制活性，可较强地抑制小鼠感染IFV，并抑制IFV的膜融合及脱壳。赵晶10报道黄芩可抑制HIV1病毒逆转录酶(RT)和细胞病变(CPE)，抑制病毒荧光抗原(FA)、P24抗原和成人TCC白血病毒，抑制HIV1在 H9 细胞中生长。甲型肝炎病毒（HAV）抗原的体外活性抑制试验表明，黄芩甙对HAV的3种抗原( 表面抗原、e抗原、核心抗原) 有显著抑制作用11。 JH体内抗流感病毒实验