菲咪唑、罗丹明和香豆素衍生物的合成及在荧光探针中的应用_硕士学位论文.pdf

L 硕十学位论文 摘要 荧光探针具有高灵敏度、高选择性、能够实现开关操作、可用裸眼识别和 利用光纤远距离操控检测等优点。因此，本论文基于I C T 原理设计了菲咪唑的 C 1 0 。荧光比值探针；通过三异丙基硅的位阻来设计稳定性的非共轭罗丹明C u 2 + 的荧光探针；根据4 甲基香豆素光解保护基的机理，设计了香豆素光控罗丹明 荧光探针。 我们通过醛基能够被保护成肟，而C I O 。能够将肟基脱保护形成醛的机理， 设计并合成了基于I C T 的菲咪唑C 1 0 荧光比值探针。C I O 。加入到探针溶液中后， 能够使得探针中的肟基脱保护而形成醛基，而醛基的拉电子效应比肟基的强， 这样就促使探针结构中电子重新排布，因此最大发射波长红移。菲咪唑荧光探 针对C 1 0 具有很高的灵敏度和选择性，并且不会受到其他离子的影响。到目前 还没有C 1 0 。荧光比值探针的文献报道，因此，通过菲咪唑中连接基团的推拉电 子效应强度来设计C 1 0 。荧光比值探针是非常有意义的。 通过位阻来增强非共轭罗丹明的稳定性，我们设计并合成了罗丹明C u 2 + 荧光探针。随着C u 2 + 的加入，在5 8 0n m 处的荧光增强了1 0 0 倍。基于该探针 的灵敏性和选择性，我们将其应用在岳麓山山泉水，小牛血清和生物体系中对 C u 2 + 的检测。最后我们提出了罗丹明荧光探针与C u 2 + 反应机理可能是铜自身的 氧化还原反应引起的，这种原理对今后研究过渡金属媒介催化的适用生物环境 荧光探针是非常有价值的。 设计并合成了香豆素光控罗丹明荧光探针。这种通过香豆素染料来光控罗 丹明荧光染料荧光是首次提出的。我们依据文献4 甲基香豆素能够作为光保护 基来光控释放出被保护的物质，成功的设计并合成了该染料探针。而且该染料 探针在可见光的照射下，释放出罗丹明的荧光。将香豆素光控罗丹明荧光探针 定点的应用到了生物体系中。这种良好的光化学特征的光控探针( 能够与细胞形 成定位作用) 可以作为一种重要的化学工具去研究光控探针在各种生物中实时 定位反应动力学。 关键词：荧光探针；I C T ；菲咪唑；罗丹明；4 甲基香豆素：C u 2 + ；C 1 0 I I 菲咪唑、罗丹明和香豆素衍生物的合成及在荧光探针中的心用 A bs t r a c t T h ea d v a n t a g e so ff l u o r e s c e n c ec h e m o s e n s o r sa r eh i g hs e n s i t i v i t y , s e l e c t i v i t y ， “o n o f f s w i t c h a b i l i t y ，o b s e r v a t i o ni nt h en a k e de y e ，d e t e c t i o nb yu s i n go p t i c a l f i b r e sa n dS Oo n I nt h i ss t u d y , T h ep h e n a n t h r o i m i d a z o l er a t i o m e t r i cf l u o r e s c e n t h y p o c h l o r i t ep r o b e b a s e do nI C Th a sb e e n d e s i g n e d ；T h es t e a d y r o s a m i n e f l u o r e s c e n t C u z + p r o b eb a s e d o nt h eb u l k yi s o p r o p y ls i l a n eg r o u ph a sb e e n d e s i g n e d ；T h ec o u m a r i nc a g e dr o s a m i n ep r o b eb a s e do nt h ep h o t o l y s i so ft h e 4 - m e t h y l c o u m a r i nh a sa l s ob e e nd e s i g n e d T oo u rb e s tk n o w l e d g e ，a l d e h y d eg r o u p sc a nb ep r o t e c t e da so x i m e s ，w h i c h c a nr a p i d l yd e p r o t e c t e db yh y p o c h l o r i t eu n d e rm i l dc o n d i t i o n s S ow ed e s i g n e d a n ds y n t h e s i z e dp h e n a n t h r o i m i d a z o l er a t i o m e t r i cf l u o r e s c e n th y p o c h l o r i t ep r o b e b a s e do nI C T W h e nC I O 。a d d e dt ot h es o l u t i o no fp r o b e ，t h eo x i m eg r o u pc o u l db e r e m o v e db yC I O 。t og i v et h ea l d e h y d eg r o u p B e c a u s et h ee l e c t r o nw i t h d r a w i n g a b i l i t yo ft h ea l d e h y d eg r o u pi ss t r o n g e rt h a nt h a to ft h eo x i m eg r o u p ，w ed e t e c t e d t h a tt h ee m i s s i o no ft h ep r o b eh a v ear e d s h i f td u et ot h es t r o n g e rI C T T h eC 1 0 。 p r o b ea r eh i g hs e n s i t i v i t y ，s e l e c t i v i t ya n dn oi n t e r f e r e n c e ，S Op h e n a n t h r o i m i d a z o l e r a t i o m e t r i c f l u o r e s c e n th y p o c h l o r i t ep r o b eb a s e do nr e g u l a t i o no ft h ee l e c t r o n w i t h d r a w i n ga b i l i t yo ft h ee l e c t r o na c c e p t o ri nt h eI C Ts y s t e mi ss i g n i f i c a t i v e W ed e s i g n e da n ds y n t h e s i z e dt h er o s a m i n ef l u o r e s c e n tC u z + p r o b eb a s e do n t h eb u l k yi s o p r o p y ls i l a n eg r o u pc a nc o n t r i b u t et ot h es t a b i l i t y W h e np r o b ew a s t i t r a t e dw i t hi n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o n so fC u 2 + ，ad r a s t i ci n c r e a s ei nt h ef e a t u r e d e m i s s i o no fC O n j u g a t e dr o s a m i n e a r o u n d58 0 n mw a s o b s e r v e d ，a n dt h e f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t ye n h a n c e m e n tw a su pt o 10 0 一f o l d T h ep r o b eh a sb e e n e m p l o y e dt os e n s eC u 舯i nY u eL us p r i n g ，n e wb o r nc a l fs e r u m ，a n dt h el i v i n g s y s t e mb a s e do nt h es e n s i t i v i t yo ft h ep r o b e W ep r o p o s e dt h a tt h eu n p r e c e d e n t e d c o p p e r m e d i a t e dd i h y d r o r o s a m i n eo x o d a t i o nr e a c t i o ne m p l o y e df o rt h ep r o b e d e v e l o p m e n tl i k e l yp r o c e e d sb yac o p p e rr e d o xm e c h a n i s m A n dt h eg e n e r a l m e t a l - m e d i a t e dr e d o x t i o n a p p r o a c h c o u l db e i m p o r t a n t i nt h e d e v e l o p b i o c o m p a t i b l ef l u o r e s c e n tp r o b ef o rv a r i o u sm e t a li o n s T h ec o u m a r i nc a g e dr o s a m i n ep r o b eh a sb e e nd e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d W e f i r s td e s i g n e dt h ep r o b ef o rr o s a m i n e sb a s e do nn e wp h o t o c a g i n gc h e m i s t r yt h a t 4 - m e t h y l c o u m a r i nc a g e dc o u l dr e l e a s et h er o s a m i n e T h ep r o b ec o u l dr e l e a s e 硕十学位论文 r o s a m i n e a n dc o u m a r i nf o r l i v i n g c e l lf l u o r e s c e n c e i m a g i n g u n d e rt h e p h o t o a e t i v a t i o nb yv i s i b l el i g h t ，a n dc a nb ee m p l o y e df o rs p a t i a lc o n t r o li m a g i n g i nt h el i v i n gc e l l s T h u s ，t h e s eh i g h l yf a v o r a b l ep h o t o c h e m i c a lp r o p e r t i e ss h o u l d r e n d e rt h en o v e lc a g e d p r o b e sa sp o w e r f u lc h e m i c a lt o o l s f o rs t u d i e so ft h e s p a t i o t e m p o r a ld y n a m i c so faw i d ev a r i e t yo fb i o l o g i c a lp r o c e s s e s K e y W o r d s ：f l u o r e s c e n t p r o b e ；I C T ；p h e n a n t h r o i m i d a z o l e ；r o s a m i n e ； 4 - m e t h y l c o u m a r i n ；C u 2 + ；C I O 。 I V _ 菲咪唑、罗丹明和香豆素衍生物的合成及在荧光探针中的应用 口三置 I = 1 封弋 学位论文原创性声明与位论文版权使用授权书I 摘要I I A b s t r a c t I I I 第1 章绪论1 1 1 咪唑类化合物1 1 1 1以咪唑作为母体进行修饰成咪唑类化合物l 1 1 2 多胺结构化合物关环形成咪唑类化合物2 1 1 3 酮结构化合物与胺合成的方法2 1 1 4 邻苯二胺合成的方法3 1 2 罗丹明类化合物3 1 2 1对羧基罗丹明的合成4 1 2 2罗丹明1 1 0 的合成4 1 2 3罗丹明5 7 5 和罗丹明6 G 异构体的合成4 1 2 4 其它罗丹明的合成5 1 3 香豆素类化合物5 1 3 1 3 取代香豆素的合成6 1 3 2 4 取代香豆素的合成7 1 4 荧光探针识别的I C T 原理8 1 5 香豆素光解保护基的光解机理8 1 6 本论文研究思想和内容9 第2 章菲咪唑荧光探针的合成及应用1 1 2 1 研究背景1 1 2 2 仪器和试剂1 1 2 2 1 仪器1l 2 2 2 试剂1 2 2 3 菲咪唑染料探针的合成j 1 3 2 3 1 4 - ( 菲并 9 ，l O - d 】一咪唑) 苯甲醛1 的合成1 3 2 3 2 4 一( 菲并【9 ，1 0 - d 】- 咪唑) 苯甲肟2 的合成1 3 2 3 3 2 对甲苯菲并 9 ，1 0 d - 咪唑3 的合成1 4 2 4 探针对离子识别的荧光紫外光谱检测1 5 2 4 1探针的紫外和发射光谱的检测1 5 V 硕十学位论文 2 4 2 探针的稳定性和对C l O 。光谱变化的时间曲线的检测1 5 2 4 3 探针对离子的选择性和不同浓度C l O 。的光谱检测一1 5 2 5 结果和讨论15 2 5 1 目标化合物的合成及其结构表征1 5 2 5 2 探针识别离子的紫外和荧光光谱1 6 2 6 小结19 第3 章罗丹明荧光探针的合成及应用一2 0 3 1 研究背景2 0 3 2 仪器与试剂2 1 3 2 1 仪器2 1 3 2 2 试剂2 1 3 3 中间体及目标化合物的合成2 2 3 3 1 化合物4 的合成2 2 3 3 2 化合物5 的合成2 4 3 3 3 化合物6 的合成2 4 3 4 探针对离子识别的荧光紫外光谱检测2 5 3 4 1 荧光量子产率的测定2 5 3 4 2不同C u 2 + 浓度对探针光谱变化的检测2 5 3 4 3探针对不同离子选择性的光谱检测2 5 3 4 4 加入C u 2 + 对探针光谱产生影响的机理研究2 5 3 4 5山泉水中C u 2 + 的检测实验2 6 3 4 6 小牛血清中C u 2 + 的检测实验2 6 3 4 7 细胞中的荧光成像2 6 3 5 结果和讨论2 6 3 5 1中间体和目标化合物的合成及其结构表征2 6 3 5 2 探针6 识别离子的光谱3 1 3 6 小结3 5 第4 章香豆素光控罗丹明荧光探针的合成及应用3 6 4 1 研究背景3 6 4 2 仪器与试剂3 7 4 2 1 仪器3 7 4 2 2 试剂3 8 4 3 中间体及目标化合物的合成3 8 4 3 1 7 二乙胺基( 4 羟甲基) 香豆素7 的合成3 8 4 3 2 7 羟基( 4 氯甲基) 香豆素8 的合成3 9 V l 菲咪唑、罗丹明和香豆素衍生物的合成及在荧光探针中的应用 4 3 - 3 7 甲氧基( 4 氯甲基) 香豆素9 的合成3 9 4 3 47 二乙胺基( 4 甲酰基) 香豆素1 0 的合成4 0 4 3 5 7 甲氧基( 4 甲酰基) 香豆素1 1 的合成一4 0 4 3 7 笼状化合物1 2 的合成4 l 4 3 8笼状化合物1 3 的合成一4 2 4 4 笼状化合物发生光解作用的光谱测定4 3 4 4 1 光解量子效率的检测4 3 4 4 2 光解过程光谱的检测和H P L C 的分析4 4 4 4 3 细胞的荧光成像4 4 4 5 结果和讨论4 4 4 5 1中间体和目标化合物的合成及其结构表征一4 4 4 5 2化合物1 2 和1 3 光解作用的光谱5 0 4 6 小结5 5 结论5 6 参考文献5 7 附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录一6 7 附录B 合成化合物一览图6 8 致 谢：7 0 V l I 硕L 学位论文 第1 章绪论 荧光染料是一种很重要的功能染料，广泛的应用于工业、农业、医药、轻纺、 能源、国防和基因生物等方面【1 1 。其中咪唑类【2 ，3 ，4 1 、香豆素类【5 ，6 1 、罗丹明类【7 ，8 1 、 荧光素类、菁染料、B O D I P Y 类【9 】和萘酰亚胺类【l o 】染料是染料中重要的品种，可 以作为荧光染料，激光染料，有机功能材料和荧光探针等应用于各种领域【1 1 1 。 咪唑类、香豆素类和罗丹明类荧光染料化合物都具有良好的光化学特征，因 此能够很好的应用到各种类型的荧光探针中。 1 1 咪唑类化合物 咪唑是含有两个氮原子的五元杂环化合物。一般咪唑类化合物都有着良好的 光学特性，因此能够广泛的用于荧光探针、医药和材料等。如5 羰基咪唑苯并吖 啶酮【1 2 1 可以用来识别胺类物质，新型脱氢松香基苯并咪唑类衍生物【1 3 1 能够识别氯 离子；咪唑安定1 1 4 】作为镇静剂可以应用在胃镜检查中，含有苯并眯唑结构片段【1 5 1 的化合物具有良好的抗高血压活性；P B I ( 聚苯并咪唑) 可以用作为防护材料。基于 咪唑类的广泛应用，眯唑类化合物的合成就有重要的意义。 咪唑类化合物的合成有多种非常经典的方法。咪唑化合物类合成有多种方法 其中主要的方法有以咪唑为母体进行修饰【1 6 】；多胺结构的物质自身关环【1 7 】；含有 酮结构化合物与胺类物质链接形成【”1 ；以邻苯二甲胺为原料与各种酸、酰氯、酯、 腈、醛的化合物反应，主要合成的是苯并咪唑类化合物【I 引。 1 1 1以咪唑作为母体进行修饰成眯唑类化合物 肖翠【2 0 J 在咪唑的四氢呋喃溶液中，利用强碱氢化钠使得生成咪唑钠盐，这样 就大大的提高化合物的活性位点，在0 下与4 氟苯甲醛就能反应生成化合物 4 - ( 1 咪唑基) 苯甲醛( 式1 2 ) 。该化合物在抗生素【2 1 1 ，抗癌病药物【2 2 1 ，以及有机功 能材料的合成中有比较广的应用。因此对该化合物的合成方法研究也越来越备受 关注。 N 夕 X N N a U F - C 6 H 4 C H O c H 。 式( 1 2 ) L n a c i n i e t 等2 3 】首次应用咪唑做原料与硝酸根发生硝化反应合成了硝基咪唑 化合物( 式1 3 ) ，多硝基咪唑化合物的氮原子电负性高，具有对抗静电、抗摩擦和 热稳定性好的特征【2 4 1 ，是类新型良好的不敏感炸药，并也能广泛的应用在医药 H N 夕 ， 、 N 菲咪唑、罗丹明和香豆素衍生物的合成及在荧光探针中的应用 化学领域。 N H 4 N 0 3 - _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ I _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ - H 2 S 0 4 ( 9 5 ) + A 0 2 0 H N 0 3 ( 9 8 ) A C H + A C 2 0 1 1 2 多胺结构化合物关环形成咪唑类化合物 W a l l a c h 等【2 5 1 用草酸的N ，N 二烷基酰胺和P C I 5 或P B r 5 共热的条件下得到了 响R 5 一R t 民 1 1 3 酮结构化合物与胺合成的方法 能够形成丹参酮的咪唑环( 式1 5 ) 。而丹参酮对D N A 拓朴酶2 7 1 ，f a r n c s y l 蛋白转 + C H 3 N H 2 式( 1 5 ) 2 0 0 4 年，向双春课题组【2 9 1 用1 ，1 0 一邻菲罗啉二酮，对位取代苯甲醛和乙酸铵合 成了邻菲罗啉并咪唑类化合物( 式1 6 ) 。由于该咪唑化合物分子有较大的共轭体 系，因此它及其同系物被广泛的应用于发光材料和激光材料 3 0 , 3 1 1 等。 2 O N 一 N N N 一 N n N 廷 ON 2吼 一NN N 廷 O 、 U ， 一 N H N 打 硕十学位论文 三+ R o 塑半 R = H 。O H ，N ( C H 3 ) 2 卜R 式( 1 6 ) 1 1 4 邻苯-合成的方法 9 9 9 年，谢川课题组【3 2 】采用邻苯二胺与脂肪酸类合成了烷基苯并咪唑化合物 ( 式1 7 ) 。其中，2 烷基苯并咪唑是印制电路板用水溶性耐热予焊剂的重要成分， 在印制电路板制造中起了重要的作用【3 3 1 。 q 呦。H q H R R ；Y g C 5 - C 1 1 的直链烷基 式( 1 7 ) 1 取代2 芳基苯并咪唑衍生物是重要的化合物，能广泛的应用于药物和材料 等方面，因此这类型的化合物的合成研究是非常重要的。陈桧华课题组【3 4 1 采用邻 苯二胺与两分子的醛合成了1 取代2 芳基苯并咪唑化合物( 式1 8 ) 。 q o R c 2 H s O H r e f l u x R = H 。4 - C H 3 ，4 - C I ，4 - O C H 3 2 一O C H 3 4 - N 0 2 式( 1 8 ) 刘望课题组【3 5 1 以邻苯二胺和溴代乙酸乙酯为原料一步法合成了2 溴甲基苯 并咪唑( 式1 9 ) ，但是伴随着有3 ，4 - 二氢一1 H 喹喔啉一2 - 酮的副产物生成。 q 日。儿OB r 焉卜 1 2罗丹明类化合物 q 卜H 卧+ q 三N k 式( 1 - 9 ) 罗丹明化合物是由氧杂葸为母体的一种化合物( 式1 1 0 ) 。由图可知，氧杂葸 是刚性共平面的分子，其结构非常稳定，在光激发下能够产生强烈的荧光。由于 罗丹明其化合物的特殊结构以及相应的荧光特性( 发射波长一般在5 0 0 6 8 0n m ) ， 它已经广泛的应用在药理学、生理学、分子生物学、细胞生物学、单分子检测、 菲咪唑、罗丹明和香豆素衍生物的合成及在荧光探针中的应用 R R 2 R 1 R 1 = N ( C H 3 ) 2 N C H 2 C H 3 N ( C H 2 C H 3 ) 2 等 R 2 = 取代芳基等 式( 1 1 0 ) 荧光标记和激光染料等各个方面 3 6 , 3 7 , 3 8 1 。基于罗丹明类化合物的广泛应用，因此 对于它的合成的研究是非常重要的。 罗丹明类化合物的合成一般是通过氨基酚与各种醛、苯甲酸、苯酐、邻苯二 甲酸、邻苯二甲酸酐、磺基苯甲酸、磺基苯甲酸酐，在L e w i s 酸作为催化剂进行 缩合反应1 3 9 , 4 0 】。 1 2 1对羧基罗丹明的合成 彭孝军课题组【4 1 1 ，在2 0 0 4 年应用间二乙胺基苯酚和对羧基苯甲醛合成了对 羧基罗丹明( 式1 1 1 ) 。该合成方法通过一步缩合，和一步氧化的方法，得到了单 一的产率较高( 9 0 ) 的罗丹明化合物。 0 H C O O H 八审 夕 C H O F e 2 ( S O 式( 1 1 1 ) 1 2 2 罗丹明1 1O 的合成 史真课题组【4 2 1 通过问氨基苯酚与苯三甲酸酐合成了罗丹明1 1 0 的异构体( 式 1 1 2 ) ，并将其分离，也得到了较好的收率。该化合物的出现不但可以扩大罗丹明 荧光染料类化合物的应用，也可以提高它在标记生物大分子中的准确性和可靠性。 O H I H 0 0 C 叙毗+ O H 2 NN H 2 式( 1 1 2 ) 1 2 3罗丹明5 7 5 和罗丹明6 G 异构体的合成 冯震课题组【4 3 1 ，以对甲基苯磺酸为催化剂，乙烯酯和N 一乙基苯胺为原料，合 成的3 乙氨基5 甲基苯酚，再用氯化锌作为催化剂与邻苯二甲酸酐合成了罗丹明 1 2 4 其它罗丹明的合成 接上了两个 物在作为激 5 7 5 异构体) 【a ) ( b ) 式( 1 1 4 ) 1 9 9 9 年，刘竹兰课题组【4 5 】报道了罗丹明B 与水合肼直接反应，合成罗丹明 肼类化合物如式1 1 4 ( 化合物a ) 。而且利用该化合物可以与铜离子螯合然后水解， 释放出荧光物罗丹明B 。因此，罗丹明肼化合物可以用来作为铜离子的荧光探针。 张万斌课题组【4 6 1 ，在2 0 0 4 年报道了罗丹明B 与N 羟基琥珀酰亚胺在D C C 的作用下生成化合物b ( 式1 1 4 ) ，并将该化合物应用到氨基酸的标记中。 1 3 香豆素类化合物 香豆素( 式1 1 5 ) 又称l ，2 苯并吡喃酮、邻羟基肉桂酸内酯、邻氧萘酮等，是 一种用途极为广泛的重要香料，最早是在1 8 2 0 年用酒精从黑香豆上提取得到【4 7 】 的。到目前为止已经发现的香豆素类衍生物有8 0 0 多种【4 8 1 。 C 菲咪唑、罗丹明和香豆素衍生物的合成及在荧光探针中的应用 式( 1 1 4 ) 香豆素及其衍生物具有明显的生物活性，对人体具有抗氧化、降血糖、抗菌 和抗癌等多种药理作用，因此，香豆素类衍生物也是医药学中的一类重要中间体 【5 1 1 。香豆素类衍生物本身能够散发出芳香的气味，所以香豆素能够在食品和化妆 品领域中得到应用。除此之外，香豆素类的花椒毒素有毒，因而能够在香豆素的 基础上合成一些农药和杀鼠剂等【s 2 , s 3 1 。如抗凝血类杀鼠剂被广泛的应用，并且该 杀鼠剂不易引起二次中毒，具有特效解毒药，对人和畜比较安全，使用起来比较 方便。 由于香豆素荧光染料具有荧光量子产率高和S t o k e s 位移大等优点【4 9 1 ，因此， 成为了近几十年有机荧光染料研究的重点之一。由于其优点，香豆素还能够用于 阳离子、阴离子和中性分子的荧光传感器【5 0 1 。 基于香豆素类衍生物的良好应用，研究其合成方法也是非常重要的。香豆素 类化合物的合成方法有P e r k i n 法、K n o e v e n a g e l 法、P e c h m a n n 法和W i t t i g 法等各 种方法。大多数见到的香豆素类衍生物是3 ，4 或7 位各种不同取代基的香豆素， 因此，我们主要讨论3 和4 位取代基的香豆素的一些合成方法。 1 3 13 取代香豆素的合成 2 0 0 2 年，孙一峰课题组【5 4 】用水杨醛和甘氨酸甲酯合成了3 氨基香豆素( 式1 1 5 ) 等。该合成方法的出现，使得合成3 氨基香豆素的收率提高到了5 1 8 0 。其中该 方法的水解过程是通过L o s s e n 重排法而形成3 氨基香豆素和3 羟基香豆素。 H H 。+ H 2 N C H 2 C O O C H 3 半溅i 一吲m + 联H 式( 1 15 ) 张彦英课题组【5 5 1 通过P e r k i n 反应合成了3 溴苯基香豆素( 式1 1 6 ) 。在该位置 引入的共轭芳基，能够增大化合物的斯托克位移，从而使得应用性增强。 皤| 硕士学位论文 R 题二+ B 0 H 乙酸酐，吡啶 R B r R = H 。O H 式( 1 1 6 ) 通过3 取代基团可对化合物的光谱产生影响，王辉【5 6 1 等人采用K n o e v e n a g e l 改良后的反应，将2 ，4 二羟基苯甲醛分别与丙二酸二乙酯和乙腈乙酸乙酯反应合 O H 。Q C H 2 ( C O O E t ) 2 六氢吡啶 H O 吼c o o E t 焉 。铡囝 苯甲酸H O 夕7 O 一OH 式( 1 17 ) 成3 位不同取代基团香豆素( 式1 1 7 ) ，并讨论了其结构与光电特征的关系。 1 3 2 4 取代香豆素的合成 辛秀兰【5 7 】课题组采用传统P e e h m a n n 的方法，使用不同的杂多酸( H P A ) 作为催 化剂，以间苯二酚和乙酰乙酸乙酯为原料合成了7 羟基( 4 甲基) 香豆素( 式1 1 8 ) 。 发现在反应温度较低时，多杂酸催化活性低，但是延长时间有利于产率的提高； 而反应温度较高时，反应时间长，会有较多的副产物生成而产率降低。 文H + 从入一H 。 式( 1 18 ) G u p t a 5 8 1 等人利用乙酰水杨酰氯和丙二酸二乙酯为原料，乙醇镁作为缩合剂， 并且每一步的中间体都不需要分离，合成了4 羟基香豆素( 式1 19 ) ，收率高达9 6 ， 几乎完成了定量转化。 K O H M e O H H 2 0 M g ( O C H 2 C H 3 ) 2 稀硫酸 式( 1 19 ) 菲咪唑、罗丹明和香豆素衍生物的合成及在荧光探针中的应用 S o n g 5 9 1 课题组报道了用传统的K n o c v c n a g e l 反应合成4 烷基香豆素3 羧酸。 他们以邻羟基苯甲酮与M e l d r u m 酸反应得到产物( 式1 2 0 ) 。该反应虽然它的收率 不高，但是他们在酮代替传统的醛类发生K n o c v c n a g c l 反应方面做出了有意义的 探索。 H E 而 R R = M e 。E t 。n - P r 2 一P h E t 1 4 荧光探针识别的I C T 原理 RO O H 式( 1 2 0 ) 荧光探针一般是由荧光团和识别基组成的，当识别基在与检测物作用时，荧 光团荧光能够发生显著的变化。识别基团一般决定了对检测物的选择专一性，荧 光团决定响应信号的灵敏度。荧光信号一般表现为荧光猝灭，增强和波长的移动。 荧光团的荧光强度和光谱波长与其结构有很大的关系。一般的具有大共轭体系刚 性平面结构的分子有着很强的荧光，而分子结构上连接的推拉电子基团( 如：O H ， N H 2 ，C H O ，N 0 2 等) 能够影响荧光的光谱强度以及波长。 一般荧光强度是用分子的荧光量子产率【6 0 , 6 1 】来衡量的。荧光量子产率也叫荧 光效率或量子产率，它代表了分子发射荧光的本领，一般是通过以下公式来表示： = 发射荧光的分子数激发分子总数 或西= 发射光量子数吸收光量子数 般基于分子内电荷转移( I C T ) 原理的荧光探针分子结构都是由推拉电子基 团与大共轭荧光团组成的。在基态显示为其中一端是缺电子，一端是富电子的1 6 引。 在受到激发时，基态与激发态的偶极不一样而导致了I C T 的发生。在与缺电子分 析物作用时，如果分析物与荧光探针供电子的一端形成配位时，破坏了荧光探针 推拉电子强度，就阻碍了I C T 的形成，导致荧光探针发射光谱蓝移；相反，如果 与荧光探针富电子一端结合时，就促进了I C T 的形成，导致光谱红移。因此，假 如分析物与I C T 荧光探针结合能改变了推拉电子的形态，分子就能够作为该物质 的基于I C T 的荧光传感器1 6 引。 1 5香豆素光解保护基的光解机理 光解保护基是光敏的发色基团。当受到光的激发时，能够释放出被保护的化 8 硕二 ：学位论文 合物。典型的光解保护基有邻硝基苄基类 6 4 , 6 5 】、喹啉类【6 6 1 、对羟基苯基类【6 7 1 和 4 甲基香豆素类6 8 1 等。其中邻硝基苄基类光解保护基应用比较广泛，但是至今已 逐渐被4 甲基香豆素类光解保护基所取代。4 羟甲基香豆素类光解保护基的光解 机理如图1 1 所示【6 9 】： R 2 H z C O - R 1 R 2 O R l R 2 H 2 C 一O - R 1 R 2 图1 1 4 羟甲基香豆素的光解机理 1 6本论文研究思想和内容 R 2 + R 1 0 H 根据荧光探针和香豆素保护基的基本原理，以及本实验室以前研究的经验， 本文设计了菲咪唑，罗丹明和香豆素光控罗丹明荧光探针，并对其性能进行了研 究。 菲咪唑类、罗丹明类和香豆素类荧光染料化合物都具有较大的摩尔消光系数、 较高的荧光量子产率、很好的光稳定性，而且大部分吸收在可见光区，不容易受 外界的干扰等。因此，我们选用这三类荧光染料来设计荧光探针。 醛类物质可以形成肟的方式来保护，而肟类物质可以用次氯酸根来脱保护成 醛。4 ( 菲并 9 ，1 0 d 】咪唑) 苯甲肟分子内存在电子推一拉的特征，如果肟基与次氯 酸根反应形成醛，就促进了I C T 的形成，从而改变化合物的荧光特征。所以我们 合成了4 ( 菲并 9 ，1 0 d 卜咪唑) 苯甲肟，来研究对次氯酸根的光谱变化，并且通过 1 HN M R 和M S 表征。 罗丹明类荧光染料化合物是以氧杂葸为母体的碱性染料。氧杂蒽般可以存 在为非共轭( 无荧光) 和共轭的结构( 强荧光) ，而非共轭无荧光结构一般通过氧化可 以转变为共轭强荧光化合物。我们设计了非共轭罗丹明对铜离子荧光探针，并且 通过3 异丙基硅的位阻来使得非共轭罗丹明的稳定性增强。研究了探针对铜离子 的光谱变化，并且分子结构通过了光谱、1 HN M R 、1 3 CN M R 、H R M S ，以及X 一 射线单晶衍射的表征并将该探针应用到生物体系中。 4 甲基类香豆素荧光染料具有光保护的作用，我们设计合成了香豆素光控罗 丹明化合物。香豆素罗丹明化合物通过1 HN M R 、1 3 CN M R 、H R M S ，以及X 。射 菲咪唑、罗丹明和香豆素衍生物的合成及在荧光探针中的应用 线单晶衍射的表征，证明香豆素4 亚甲基分别与罗丹明的羟基和氧杂葸相连接的。 证明其结构后，我们研究了在光照下香豆素光控罗丹明探针的光谱变化，并且研 究了它在生物体系中的变化。 硕上学位论文 第2 章菲咪唑荧光探针的合成及应用 2 1研究背景 次氯酸根( c l o ) 是有机体内的重要的活性氧组分【7 们，它在免疫系统扮演着重 要的角色。体内的次氯酸根是由髓过氧物酶( M P O ) 催化氯离子发生过氧化反应形 成的，但是在M P O 中发生异常变化所产生过量的次氯酸根会导致一系列的疾病， 包括心脏血管的疾病【7 1 1 、神经元恶化【7 2 1 、关节炎【7 3 1 和毒瘤【7 4 1 等。因此，用高灵 敏，高选择性的荧光探针来检测次氯酸根是非常有意义的。虽然选择性检测次氯 酸根次氯酸的荧光探针最近已经报道了一些【7 引，但所有这些检测次氯酸根次氯 酸的荧光探针仅仅是荧光强度的变化。这些荧光强度变化的探针一般受环境的影 响而无法完成一些定量的检测【7 引。相反，比值荧光探针允许检测两个不同的发射 波长，避免了环境对探针的影响，从而也增加了荧光检测的动力学范围【_ 7 。丌。 至今，没有检测次氯酸根的荧光比值探针的文献报道。因此，我们设计了检 测C 1 0 。的菲咪唑荧光比值探针。分子内电荷转移( I C T ) 是设计比值荧光探针的一种 机理【_ 7 8 】。I C T 体系包括一个电子供体和一个电子受体。I C T 效率可以通过改变不 同的电子供体和电子受体来调节，我们通过I C T 的这个特征来设计了荧光比值探 针。 我们通过一个特殊的具有选择性的反应设计出了次氯酸根荧光比值探针1 7 引。 在有机合成中，醛基官能团可以保护成肟【8 0 l ，并能够在温和的条件下迅速的被次 氯酸根脱保护 9 1 1 ( 图2 1 ) 。 H R A = o H 2 N O H H C I ，E t 3 N = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = C I O 。 H 。声N O H K 图2 1 醛保护成肟和用C I O 。脱保护 虽然次氯酸根去肟化反应的机理并没有在文献中报道，但是我们可以把这个 脱保护反应作为次氯酸根荧光比值探针的一个平台。特别是去肟化反应之前并没 有应用在检测次氯酸根荧光探针的设计上。应用这个平台，我们第一次设计了化 合物1 作为检测次氯酸根的荧光比值探针。 2 2 仪器和试剂 2 2 1 仪器 菲咪唑、罗丹明和香豆素衍生物的合成及在荧光探针中的应用 表2 1 所用仪器 仪器及其型号生产厂家 7 8 H W 1 型恒温磁力搅拌器 C L 2 0 0 型加热磁力搅拌器 N 1 0 0 1 型旋转蒸发仪 S H B 3 型循环水多用真空泵 2 X 2 2 型旋片式真空泵 Z F 2 型三用紫外仪 1 0 1 2 型电热鼓风干燥箱 X T - 4 型双目显微熔点测定仪 液- 质联用仪Z Q - 4 0 0 0 核磁共振仪I N O V A 4 0 0 江苏省金坛市医疗仪器厂 巩义市英峪予华仪器厂 上海爱朗仪器有限公司 郑州杜甫仪器厂 浙江黄岩医疗器械厂 上海安亭电子仪器厂 天津市泰斯特仪器有限公司 北京泰克仪器有限公司 A g e l e n t 公司 美国V a r i a n 公司 元素分析仪V a r i oE lI I I E l e m e n t 公司 硕j ：学位论文 2 3菲眯唑染料探针的合成 2 3 1 4 ( 菲并【9 ，1 0 d 卜咪唑) 苯甲醛1 的合成 反应式： C H O 实验步骤： 称取对苯二甲醛( 3 2 1 6m g ，2 4r e t 0 0 1 ) ，9