第八章真核生物的基因调控.doc

第八讲 真核生物的基因调控一、真核生物的基因结构特点 在真核细胞中，一条成熟的mRNA链只能翻译出一条多肽链，不存在原核生物中常见的多基因操纵子形式。 真核细胞DNA都与组蛋白和大量非组蛋白相结合，只有一小部分DNA是裸露的。 高等真核细胞DNA中很大部分是不转录的，大部分真核细胞的基因中间还存在不被翻译的内含子。 真核生物能够有序地根据生长发育阶段的需要进行DNA片段重排，还能在需要时增加细胞内某些基因的拷贝数。 在真核生物中，基因转录的调节区相对较大，它们可能远离启动子达几百个甚至上千个碱基对，这些调节区一般通过改变整个所控制基因5上游区DNA构型来影响它与RNA聚合酶的结合能力。在原核生物中，转录的调节区都很小，大都位于启动子上游不远处，调控蛋白结合到调节位点上可直接促进或抑RNA聚合酶与它的结合。 真核生物的RNA在细胞核中合成，只有经转运穿过核膜，到达细胞质后，才能被翻译成蛋白质，原核生物中不存在这样严格的空间间隔。 许多真核生物的基因只有经过复杂的成熟和剪接过程（maturation and splicing），才能顺利地翻译成蛋白质。二、真核生物的转录特点 原核生物中，密切相关的基因往往组成操纵子，并且以多顺反子mRNA的方式进行转录，整个体系置于一个启动子的控制之下。真核生物的DNA是单顺反子，很少有置于一个启动子的控制之下的操纵子。真核生物中许多相关的基因按功能成套组合，被称为基因家族（gene family）。1、基因家族一组功能相似且核苷酸序列具有同源性的基因。可能由某一共同祖先基因(ancestral gene)经重复(duplication)和突变产生。 基因家族的特点： 基因家族的成员可以串联排列在一起，形成基因簇(gene cluster)或串联重复基因(tandemly repeated genes)，它们可同时发挥作用，合成某些蛋白质，如rRNA、tRNA和组蛋白的基因； 有些基因家族的成员也可位于不同的染色体上，这些不同成员编码一组功能上紧密相关的蛋白质，如珠蛋白基因； 有些成员不产生有功能的基因产物，这种基因称为假基因 (Pseudogene)。假基因与有功能的基因同源，原来可能也是有功能的基因，但由于缺失，倒位或点突变等，使这一基因失去活性，成为无功能基因。与相应的正常基因相比，假基因往往缺少正常基因的内含子，两侧有顺向重复序列。人们推测，假基因的来源之一，可能是基因经过转录后生成的RNA前体通过剪接失去内含子形成mRNA，如果mRNA经反复转录产生cDNA，再整合到染色体DNA中去，便有可能成为假基因，因此该假基因是没有内含子的，在这个过程中，可能同时会发生缺失，倒位或点突变等变化，从而使假基因不能表达。 1） 简单基因家族2） 复杂基因家族海胆，5个基因组成串联单位，可以重复1000次。串联单位中的每个基因分别被转录成单顺反子RNA，这些RNA都没有内含子，而且各基因在同一条DNA链上按同一方向转录，每个基因的转录与翻译速度都受到调节。3） 发育调控的复杂基因家族在生物个体不同发育阶段，出现几种不同形式的和亚基。人的珠蛋白基因簇位于16号染色体短臂上，其中为胚胎期基因；珠蛋白基因簇位于11号染色体短臂上，其中为胚胎期基因，G和A为胎儿型基因，和为成人期基因。在每个基因家族中，基因排列的顺序就是它们在发育阶段的表达顺序。原始珠蛋白大约产生于8亿年前，由单基因编码，现代珠蛋白基因家族是由同一个原始基因通过一系列重复、突变和转位演变而成的。随着物种的进化，动物的体积相对变大，对氧的需求量越来越大，在进化压力下，血红蛋白基因通过自发突变产生杂合基因，编码出对氧的结合和释放能力要大大高于单分子血红蛋白的四聚体。在哺乳动物的进化中，链基因又发生突变和重复，形成了胎儿中的和型珠蛋白。胎儿血红蛋白对氧的亲和力比成人更大，因而利于胎儿得快速发育。4） 假基因 1977年，GJacp在对非洲爪赡5SrRNA基因簇的研究后提出了假基因的概念，这是一种核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同，但却不能合成出功能蛋白质的失活基因。假基因的发现是真核生物应用重组DNA技术和序列分析的结果。现已在大多数真核生物中发现了假基因，如Hb的假基因、干扰素、组蛋白、球蛋白和球蛋白、肌动蛋白及人的rRNA和tRNA基因均含有假基因。由于假基因不工作或无效工作，故有人认为假基因，相当人的痕迹器官，或作为后补基因。 除了多种多样的遗传缺陷外，大多数返座假基因具有以下4个较鲜明的特征：a) 完全缺失存在于功能基因中的间隔序列，即内含子序列；b) 假基因的序列只与功能基因转录产物的起点和终点之间的序列相似，而与其5端调控序列无关。但是鼠3-珠蛋白假基因7，鼠促皮质素-脂蛋白前体假基因8、人免疫球蛋白及1假基因9，10是其中的例外；c) 假基因的3末端紧接着有多聚腺嘌呤尾。以上3个特征明显提示这些序列是从成熟mRNA衍生而来，因此这类假基因又被称为处理后的假基因(图1)。d) 这类假基因的序列两端常被721bp的正向重复序列包围。这种正向重复序列也在snRNA假基因家族和Alu家族中被发现，提示正向重复序列的产生可能是一种共同的插入机制的结果。通过分析基因组序列发现，基因组中存在着与基因数量几乎相等的假基因，假基因是功能基因的缺陷拷贝。在过去的几十年中，假基因一直被认为是分子化石，是进化中基因突变的遗迹。而2003年5月日本学者Hirotsune的报导第一次揭示了假基因的功能。 Hirotsune等人将果蝇的sexlethal基因转移到小鼠体内，大多数小鼠表现正常，但有一个品系的小鼠在幼年期全部死亡。进一步研究发现，sexlethal基因插入到makorin1p1假基因中部，破坏了该假基因的转录。makorin1p1是makorin1基因的假基因。如果将假基因makorin1p1敲除，makorin1基因将被关闭。这说明，基因makorin1的表达受到其同源序列假基因的控制。2、DNA水平调控1）染色质结构影响基因转录 细胞分裂时染色体的大部分到间期时松开分散在核内，称为常染色质（euchromatin），染色质常常会在特定的区域被解旋松弛，形成自由的DNA，DNA本身局部结构发生变化，导致结构基因暴露，促进转录因子与启动区DNA的结合，诱发基因转录。松散的染色质中的基因可以转录。染色体中的某些区段到分裂期后不像其他部分解旋松开，仍保持紧凑折叠的结构，在间期核中可以看到其浓集的斑块，称为异染色质（hetrochromatin），其中从未见有基因转录表达。原本在常染色质中表达的基因如移到异染色质内也会停止表达；哺乳类雌体细胞2条X染色体，到间期一条变成异染色质者，这条X染色体上的基因就全部失活。可见紧密的染色质结构阻止基因表达。 常染色质(euchromatin) ：指间期核内染色质纤维折叠压缩程度低, 处于伸展状态（典型包装率750倍）, 用碱性染料染色时着色浅的那些染色质。常染色质是进行活跃转录的部位，呈疏松的环状，电镜下表现为浅染。并非所有基因都具有转录活性,常染色质状态只是基因转录的必要条件而非充分条件 异染色质(heterochromatin)：指间期细胞核中, 折叠压缩程度高, 处于聚缩状态，碱性染料染色时着色较深的染色质组分。类型结构异染色质（或组成型异染色质）(constitutive heterochromatin) 兼性异染色质(facultative heterochromatin) 结构异染色质，除复制期以外，在整个细胞周期均处于聚缩状态，形成多个染色中心。 结构异染色质的特征：在中期染色体上多定位于着丝粒区、端粒、次缢痕 及染色体臂的某些节段；由相对简单、高度重复的DNA序列构成, 如卫星DNA；具有显著的遗传惰性, 不转录也不编码蛋白质；在复制行为上与常染色质相比表现为晚复制早聚缩兼性异染色质在某些细胞类型或一定的发育阶段, 原来的常染色质聚缩, 并丧失基因转录活性, 变为异染色质，如X染色体随机失活。 异染色质化可能是关闭基因活性的一种途径。 DNase的敏感性和基因表达研究发现，活跃表达基因所在染色体上一般含有一个或数个DNA酶超敏感位点，超敏感位点的产生可能什染色质结构规律性变化的结果。正是这种变化，使DNA容易与RNA聚合酶和其它转录调控因子相结合，从而启动基因表达，同时更易于被核酸酶所降解。当一个基因成为转录活性状态时，含有这个基因的染色质区域对DNase（一种内切酶）降解的敏感性要比无转发活性区域高得多。这是由于此区域染色质的DNA蛋白质结构变得松散，DNase易于接触到DNA之故。一个很好的研究系统是鸡的珠蛋白和卵清蛋白系统。来自鸡胚红细胞的核中，珠蛋白的基因对DNase的降解是敏感的，而编码卵清蛋白的基因在红细胞中是不表达的，它对DNase的降解也是具有抗性的。相反，在母鸡输卵管细胞的核中，卵清蛋白的基因是具有转录活性的，但却不能产生珠蛋白的RNA，卵清蛋白基因的序列对DNase 的降解要比珠蛋白基因的序列敏感得多。很多实验得出的结论几乎都是有转录活性的基因对DNase的敏感性增加，DNase敏感区的范围随着基因序列的不同而变化，从基因周围几个Kb到两侧20Kb大小不等。仔细分析具有转录活性基因周围的DNA区域，表明有一个中心区域存在，称为超敏感区域（hypersensitive region）或超敏感位点（hypersensitive site），它对DNase是高敏感的。这些位点或区域将首先受到DNase的剪切。由于对DNase的敏感性反映了染色质中DNA的有效性，我们将这些位点描述为染色质中特殊DNA暴露区域，一般在转录起始点附近，即5端启动子区域，少部分位于其它部位如转录单元的下游。超敏感位点建立于转录起始之前，转录的诱导物除去后虽超敏感位点信然存在，但转录却很快停止，说明超敏感位点的存在是转录起始的必要条件，但不是充分条件。超敏感位点是一段长200bp左右的DNA序列，这些区域是低甲基化区；并可能有局部解链的存在；不存在核小体结构或结构不同寻常，此区因DNA的裸露易和多种酶或特异的蛋白质结合，也就是说易于和反式作用因子结合。2) DNA的甲基化和去甲基化A日常型甲基化酶 在甲基化的DNA模板指导下使新合成的链甲基化。特异性很强，对半甲基化的DNA有较高的亲和力，使新生的半甲基化DNA迅速甲基化，从而保证DNA复制及细胞分裂后甲基化模式不变。B 从头合成型甲基化酶 无需模板指导完成甲基化修饰。不需要母链指导，但速度很慢。C在一些不表达的基因中，启动区的甲基化程度很高，而处于活化状态的基因则甲基化程度较低。现以卵黄原蛋白基因为例来说明这个问题。卵黄蛋白并非在卵母细胞或受精卵中合成的，而是在成熟的雌性动物肝中先合成卵黄蛋白原（vetellogenin），然后分泌到血液中，再运送到卵巢。发育中的卵（卵母细胞）选择性地将卵巢中的卵黄蛋白原加以吸取，再切割，装配成卵黄蛋白。雄性动物也有卵黄蛋白原基因，但不能表达。这是因为缺乏雌激素之故。其分子机制仍和甲基化有关。鸡的卵黄蛋白原基因的5调节区有4个CpG位点（图18-43），C，D位点是雌二酮受体蛋白复合物的结合部位。在雌激素处理后，在-612（C）的Hpa位点处于低甲基化。在红细胞DNA的上面一股链上4个位点全部甲基化，下股链只有50%甲基化，但经雌二酮处理后数小时内甲基化的形式发生急剧变化，上股链中4个位点全部去甲基化，与卵黄蛋白原mRNA相吻合，而另一股键上4个位点滞后24小时才去甲基化，这就是在肝细胞中卵黄蛋白原基因中的5端调节区有部分半甲基化位点，而雌激素的处理只引起其中一条链迅速地去甲基化，另一条链暂时仍保持本甲基化状态，所以此基因在雄体中处于甲基化状态，没有活性。酶对CpG位点的甲基化是有选择的，例如小鼠-珠蛋白基因5侧翼有5个CpG位点，其中4个较集中。用纯化的DNA甲基转移酶在体外处理这段序列，结果各位点的甲基化程度各不相同，有的不发生甲基化，有的甲基化不明显，有的稍有甲基化，有的大量甲基化，无论是诱导的还是未诱导的细胞；无论是纯化酶，还是粗制酶都一样。表明还有其它的选择因素存在。甲基化可使基因失活，去甲基化又可使基因恢复活性。5-氮胞苷（图18-45）没有游离的5-H，因而不能接受甲基，若将它掺入DNA取代胞苷是可以改变基因的甲基化状态，而达到去甲基化。细胞DNA合成一般有两条途径。主途径是由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸作为重要的辅酶参与这一合成过程。另一辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）的催化作用合成DNA。细胞融合的选择培养基中有三种关键成分：次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨甲蝶呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T），所以取三者的字头称为HAT培养基。氨甲蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA，而融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的HGPRT细胞株，所以不能在该培养基中生长。只有融合细胞具有亲代双方的遗传性能，可在HAT培养基中长期存活与繁殖（图11-1）。Mohandas等将含有一条X染色体易位（X/11易位）的女人成纤维细胞和小鼠A9细胞（HPRT-）融合后用HAT（培养基中加入了次黄嘌呤(H)，氨基喋呤(A)和胸苷(T)，选择带有HPRT+基因的细胞，而人类X染色体的长臂上带有此基因，若X染色体失活，这个基因也没有活性。选择出的融合细胞中一部分带有2条人的X染色体，一条有活性，一条是失活的。随着培养的延续，杂种细胞将继续排斥人类的染色体，在这种情况下再用硫基鸟嘌呤进行反选择（back-selected），即硫代鸟嘌呤是有毒性的，HGPRT+的细胞可使其掺入DNA而导致死亡，而HGPRT-的细胞反而可以得以生存，选择出来的细胞只有一条正常的X染色体（如未易位），表明这条染色体是失活的，所以虽有HGPRT基因，但不表达。接着他们用5-氮胞苷未处理细胞，然后再在HAT培养基中克隆，结果细胞增加了100倍。（图18-46）表明原来失活的X染色体经5-氮胞苷处理后恢复了活性，HGPRT基因变成活性状态，这样才能在HAT培养基中分裂。这个实验说明HGPRT基因在失活染色体上重新被活化是由于5-氮胞苷起到去甲基化的作用，也说明莱昂化不是抑制因子的持续存在，而是一条染色体被选择性甲基化之故。D DNA甲基化抑制基因转录的机制 DNA甲基化抑制基因转录的直接机制 某些转录因子的结合位点内含有CpG序列，甲基化以后直接影响了蛋白质因子的结合活性，不能起始基因转录。 DNA甲基化抑制转录的间接机制 通过改变染色质的构象或者通过与甲基化CpG结合的蛋白因子（methylCpG-binding protein1）间接影响转录因子与DNA的结合。甲基化达到一定程度时会发生从常规的B-DNA向Z-DNA 的过渡。由于Z-DNA结构收缩，螺旋加深，使许多蛋白质因子赖于结合的元件缩入大沟而不利于基因转录的起始。 甲基化在DNA分子上并不是随机分布的，基因的5端和3端往往富含甲基化位点，而启动区DNA分子上的甲基化密度与基因转录受抑制的程度密切相关。对于弱启动子来说，稀少的甲基化就能使其完全失去转录活性。当这一类启动子被增强时，即使不去甲基化也可恢复其转录活性。若进一步提高甲基化密度，即使增强后的启动子仍无转录活性。因为甲基化对转录的抑制强度与MeCP1结合DNA的能力成正相关，甲基化CpG的密度和启动子强度之间的平衡决定了该启动子是否具有转录活性。DNA的甲基化还提高了该位点的突变频率。真核生物中5mC主要出现在5CpG-3序列中，5mC脱氨后生成的胸腺嘧啶（T），不易被识别和校正。因此，特定部位的5mC脱氨基反应，将在DNA分子中引入可遗传的转化，若位点突变发生在DNA功能区域，就可能造成基因表达的紊乱。E DNA甲基化与X染色体失活 雌性胎生哺乳类动物细胞中两条X染色体之一在发育早期随机失活，以确保其与只有一条X染色体的雄性个体内X染色体基因的剂量相同。一旦发生X染色体失活，使该细胞有丝分裂所产生的后代都保持同一条X染色体失活。 科学家发现，在X染色体上存在一个与X染色体失活有密切联系的核心部位称为X染色体失活中心（X-chromosome inactivation center，Xic），定位在Xq13区（正好是Barr氏小体浓缩部位）。Xi-specific transcript (Xist)基因只在失活的X染色体上表达，其产物是一功能性RNA，没有ORF却含有大量的终止密码子。实验证明，Xist RNA分子能可能与Xic位点相互作用，引起后者构象变化，易于结合各种蛋白因子，最终导致X染色体失活。有关资料X染色体失活是指哺乳动物二倍体细胞中除保持一个活性X染色体外，将其余的X染色体全部失活。X染色体失活牵涉到三个主要步骤：选择、起始与传播。在胚胎发育的早期，也就是当胚胎细胞从全能细胞开始分化的时候，X染色体失活的选择和起始过程就已经开始了。X染色体失活从X失活中心(X inactivation center,Xic)起始并双向传播至整个X染色体。Xist基因就定位于X失活中心，其特异转录物是一个剪接过的大分子非编码RNA，长约15kb，它在雌性体细胞的失活X染色体上特异地大量表达。Xist与X染色体失活的选择Xist基因表达的变化与X失活的选择密切相关。在即将发生X失活的胚胎细胞中，雄性细胞的单一X染色体和雌性细胞的两个X染色体上均可检测到Xist基因的转录。但是，这种Xist RNA并不稳定而且只能在转录位点检测到。当X失活起始时，从将要被失活的X染色体上转录而来的Xist RNA得到了稳定并且顺式传播，覆盖X染色体，完成X失活。然后，另一个有活性的X染色体上不稳定的Xist RNA的转录活动沉寂了。这样，X失活的选择以阻断活性X染色体上Xist RNA的稳定和传播的方式得到了表现。有人认为，在X失活的选择和起始过程中，有两种常染色体编码的蛋白因子起着重要作用，称为稳定因子(stabilizing factor)和阻断因子(blocking factor)4。稳定因子在失活X染色体上稳定Xist RNA并介导其与X染色体的作用，而阻断因子则与活性X染色体上的X失活中心作用并阻断Xist RNA的表达。通常，X失活在胚胎细胞系中是随机的，表明阻断因子在两个X失活中心的作用几率是相等的。但在鼠杂合体中，有一段称为X控制元件(X controlling element,Xce)的序列与Xist基因紧密相连，这段序列导致了X失活的偏向，这证明顺式作用元件能影响阻断因子与X失活中心的作用几率。X控制元件可能是通过调节XIST基因转录起作用的。Xce有强、弱两种。如果两个X染色体带有相同的Xce等位基因，那么X失活是随机的；如果一个X染色体带有弱Xce等位基因，而另一个X染色体带有强Xce等位基因，则X失活就会发生偏向，前者的X失活几率比后者的大。这可能是在Xce影响下Xic对于阻断因子的动力学竞争的结果(图1)。上述事实暗示：在一个细胞核内，所有的X失活中心竞争以获得与阻断因子相作用的机会，X失活中心与阻断因子的亲和性则是由胚胎细胞Xist转录的某些方面决定的。Xist基因中的一些序列也可以影响X失活的选择过程，有实验证实一段6kb的Xist序列在X染色体的失活选择中起到了决定性的作用。Xist与X染色体失活的起始 X染色体失活是由一系列Xist基因表达模式的改变所调节的。在未分化的雌性胚胎干细胞内，两个活性X染色体均能以低水平表达Xist，当细胞分化开始后，X失活也随之起始。X失活在胚胎细胞系中的起始早于囊胚期，约在胚胎发育的第5天左右。这时，两个Xist等位基因的表达也出现了差别，一个位点的Xist RNA出现了高表达并且与失活X染色体顺式相连，另一个位点的Xist基因表达量仍保持低水平，带有这个位点的X染色体就成为活性X染色体。最后，当胚胎细胞分化至8.5天以后，活性X染色体上的Xist启动子沉寂了，仅可检测到与失活X染色体相连的Xist RNA。也就是说，在胚胎细胞分化过程中，雌性细胞经历了一个低水平双等位Xist基因表达分化双等位Xist基因表达高水平单等位Xist基因表达的过程。在雄性胚胎干细胞和雌性成纤维细胞中均只有一个活性的X染色体，它们之间Xist RNA转录速率的比较结果证实：在Xist基因的低水平和高水平表达细胞之间，Xist RNA转录速率相差无几。另外，这两种细胞间的Xist RNA前体的数量和半衰期也基本相同。然而，这两种细胞间剪接后Xist RNA的积累和稳定程度却大不一样。这说明在Xist基因的低水平和高水平表达细胞之间最大的不同是剪接后Xist RNA的积累，是失活X染色体上的Xist RNA的转录后稳定过程导致了稳定的Xist RNA的增加。发生这种现象的可能原因是有一些蛋白因子与Xist RNA相作用并调节其与失活X染色体的联系5。X失活的过程含有三个调节Xist基因表达模式所必需的动作：失活X染色体上稳定因子对Xist RNA的稳定；将稳定因子限制于失活X染色体上；活性X染色体上Xist基因表达的沉寂。这三个动作是由多能胚胎细胞的分化所诱导的。Xist RNA稳定因子散布于细胞核，在已分化的雌性细胞中专一作用于一个X染色体。这种专一的作用可能是通过阻断稳定因子与活性X染色体的接近而完成的。Xist与X失活的传播和维持雌性体细胞中覆盖于失活X染色体上的Xist RNA外观呈簇集颗粒状，其功能不受DNase与RNase H的影响，这暗示Xist RNA并未与DNA接触。有学者认为，RNA-蛋白相互作用中介了Xist RNA和染色体之间的顺式传播与联系。在YAC转基因实验中，从常染色体上转录而来的Xist RNA可以传播并导致Xist基因连锁的常染色体序列的沉寂，表明X染色体特异元件在Xist的传播和异染色质化的过程中并不必需。在胎生和有袋类哺乳动物中，失活X染色体晚到S相才复制，并且组蛋白H4的乙酰化异构体数量也有所下降7，所以，Xist RNA的传播可能延迟了失活X染色体复制的起始。在雌性胚胎干细胞的分化过程中，X染色体复制延迟、Xist转录物得到稳定，这与X连锁基因表达的下调和低乙酰化X染色体的出现是一致的。Xist RNA可能是通过使失活X染色体在S相复制起作用的，这同时导致了在较晚复制的染色体上异染色质的形成。Xist RNA也可能在失活X染色体的组蛋白乙酰化调节中起作用，它可以阻碍组蛋白乙酰化转移酶的作用或召集组蛋白去乙酰化酶。XIST并不足以维持体细胞杂交体中X染色体的失活，同时，XIST也不是X失活的维持所必需的，在X失活的维持中起主要作用的是DNA的甲基化。尽管XIST/Xist在X染色体失活中的重要性不容质疑，但是细胞通过何种分子机理起始和传播X失活仍是一个迷。对于假说中的阻断因子和稳定因子的确认十分重要，将会极大地促进Xist RNA在X染色体上的集结机理的研究，也可能为X失活的生物化学机理研究提供进一步的证据。a. 亲本印记来源于父母本的一对等位基因表达不同。如源于父本的IGF- (胰岛素样生长因子)基因可表达，而源于母本的则不能表达。 此是由于卵母细胞中的IGF- 已被甲基化，而精子中的IGF-未被甲基化，所以这一对等位基因在合子中表现不同。目前在人类和鼠身上已辨明了20种印迹基因。大多数人类的印迹基因集中在三个簇中。在每个基因簇上都存在着特异的印记盒 (imprinting box)，能顺式调节印迹基因的亲本特异性表达，这些位点表现出亲本特异性的甲基化作用和去甲基化作用。基因印记是等位基因依赖双亲性别表达的不符合孟德尔遗传定律的特殊遗传现象。基因印记异常调节可引起一些遗传性疾病。在人类染色体11p15.5和15q11-13存在两个印记基因聚集区，两个区域的基因印记异常调节引起前者为贝-威综合征，后者为普-威综合征和安格尔曼综合征。高等动物的基因组为两倍体，受精卵从双亲中各继承了一套基因组。每一个常染色体均为双拷贝，父源和母源常染色体基因都能有均等的机会表达或受到抑制，这是孟德尔遗传定律的基本要素。上世纪90年代开始，发现了不符合这个定律的遗传现象。某些基因呈单等位基因表达，即父源与母源的基因拷贝不能同时表达，并且，父源或母源等位基因通过某种特异的基因修饰机制，特异性地抑制另一母源或父源染色体等位基因表达。例如：胰岛素样生长因子2基因（insulin-like growth factor 2, IGF2）只表达源自父亲的等位基因，母源等位基因被抑制。相反的例子，胰岛素样生长因子2受体基因（insulin-like growth factor 2 receptor, IGF2R）为源自父亲的等位基因不表达，只表达母源等位基因。这种现象可能是在父母受精卵形成过程中，特异性地对源自父亲或源自母亲的等位基因做一印记使其只表达父源或母源等位基因。这种现象被称作基因印记（gene imprinting）或基因组印记（genomic imprinting）。 临床上很早就发现父源和母源等位基因不均等表达的类似基因印记的现象，如睾丸性畸胎瘤和卵巢性畸胎瘤。睾丸性畸胎瘤细胞的两套基因组都是来自孤雌生殖发生的父源染色体，表现为肿瘤无胎儿成分。而卵巢性畸胎瘤细胞有两套雌核生殖发生的母源基因组，肿瘤有胎儿成分。这说明，人类在发育初期来自父母双方的基因组也不是均等的，也有基于父母性别的类似基因组印记现象的存在。 基因印记的机制现在还不完全了解，从到目前为止的研究成果看，与DNA的甲基化13，染色质构造的改变4，DNA复制时机的变化5和非编码RNA的调节作用6有关。 亲本的IGF-等位 基因在早期胚中被差异甲基化，在成体形成配子时仍保留原甲基化的模式。印记基因引起疾病主要表现在两个方面，一是印记等位基因的再活化，即印记丢失（loss of imprinting, LOI）；二是印记基因的另一拷贝等位基因异常造成该基因失活，而非印记基因是两等位基因同时失活引起疾病。 下列现象出现可怀疑其致病基因为印记基因。遗传形式和父母的性别有关，例如，胰岛素依赖性糖尿病是父源等位基因为致病基因的时候发病，异常源自母亲等位基因的时候不发病。原因可能是这个致病基因源自父亲的表达，源自母亲的不表达。父源二体型或母源二体型引起的疾患。例如：西拉综合征（Silver-Russell syndrome）为7号染色体父源二体型，就是说7号染色体的两条都是源自父亲，无源自母亲的7号染色体。所以，此病可能是由于源自母亲等位基因不能表达，而全无母亲等位基因表达产物所致。由遗传不均一性消失而偏向母源染色体增多或偏向父源染色体增多性癌症。例如：母源选择性11号染色体缺失所引起的小儿肿瘤，其原因可能为母源等位基因表达的抑癌基因不能表达而致肿瘤发生。目前发现许多疾病的发病与基因印记相关。本文重点介绍目前为止研究较充分的贝-威综合征，普-威综合征和安格尔曼综合征。 贝-威综合征（Beckwith-Wiedemann syndrome, BWS）: BWS是以巨大舌，脐膨出和生长过剩为三大主要特征的先天性疾病，同时伴有内脏肿大（主要为肝、肾和脾的肿大），出生时低血糖，单侧肥大（身体的一侧生长过剩）等生长异常。发病率为0.07%，无性别差异，85%为散在发病，15%为家族性遗传，符合常染色体显性遗传7。家族性遗传为母亲单侧遗传，因此显示了和基因印记有关8。BWS致病基因尚不完全清楚，已经知道BWS的致病基因位于第11号染色体短臂15.5区域（11p15.5）9，在这个基因组区域，IGF2、H19、INS、KvLQT1、LIT1和p57KIP2等印记基因聚集存在，其中IGF2、H19、p57KIP2和LIT1等基因与机体的发育和分化有关。有许多关于它们和BWS相关研究的报道，其中p57KIP2，LIT1作为其致病基因的可能性尤其引人注目。 目前，关于基因印记的研究已成为分子遗传学的一个重要领域，已有数十个印记基因被发现和克隆。已发现这些基因与机体发育的许多方面有关，如胎儿发育和胎盘生长，细胞分裂和个体行为。因此，正常印记模式的改变在临床上会引起许多疾病。本文介绍基因印记在人类遗传疾病发生中的作用的最新研究进展。 3）染色体丢失有的生物在个体发育的早期在体细胞中要丢失部分染色体，而在生殖细胞中保持全部的基因组，被丢失的染色体其上的遗传信息可能对体细胞来说没有什么意义，而对生殖细胞的发育也许是不可缺少的，现在我们来看下面的两个有名的例子。马蛔虫（Parascaris equoorum）受精卵细胞内只有一对染色体（2n =2）（另一亚种2n=4），但染色体上有多个着丝粒。在发育早期仅一个着位点发挥作用，保证正常有丝分裂的进行。发育后一阶段，在纵裂的细胞中染色体分成很多小片段，其中部分含着丝点，不含着丝点的片段在分裂中丢失。而在横裂的细胞中染色体并不丢失。第一次卵裂是横裂，产生上下两个子细胞，由于受精卵中含有的各种物质并不是匀一分布，而是从上到下呈一种梯度分布，也就是说上面的动物极和下面的植物极成分是不同的，它影响到分裂的方向和染色体的丢失。第二次卵裂时下面的子细胞仍进行横裂，保持着原有的基因组，而上面的子细胞却进行纵裂，丢失了部分染色体（图18-1）。长此下去最下面的子细胞总是保持了全套的基因组，将发育成生殖细胞，其余丢失了部分染色体片段的细胞分化为体细胞。此可能是由于在植物极中有特殊的物质的存在，这种物质具有保护染色体不受削减的功能。小表瘿蚊（Mayetiole destructor）受精卵的细胞核分裂，而受精卵不分裂，形成合胞体（syncytium）。当核第3次分裂后，有两核移向卵后端的一个特殊区域，叫做极细胞质，在极细胞质中的核保持了全套的染色体（2n =40），将来分化为生殖细胞。而在一般的细胞质中，染色丢失了32条，只保留8条，将来分化为体细胞。若在细胞核移向极质前，用细尼龙丝在极质处进行结扎，不让核移入极质或者用紫外线照射极质，结果所有的核中都只保留了8条染色体。极细胞质中有很多核糖体样的颗粒，可以保护染色体不被削减，当紫外线照射后破坏了其功能，染色体照样也会丢失，最终不能发育为生殖细胞。4）染色体的扩增染色体的扩增其本质是指细胞内特定基困拷贝数专一性大量增加的现象称为基因的扩增（amplification）。最为人们熟知的例子是两栖类和昆虫卵母细胞rRNA基因的扩增。非洲爪蟾的每条染色体上有约450拷贝编码18S r RNA和28S r RNA的DNA，它们成簇存在，重复串联在一起，形成核仁组织区。可是在卵母细胞中它们的拷贝数扩大了1000倍以上。卵母细胞十分特殊。它为胚胎的发育提供营养物质，直到发育成蝌蚪阶段。它的细胞质中也存在着翻译装置。此是实行分化时必须的。在卵子发生时，当内含物不断增加时，其体积也大大增加，形成了毗邻在一起的滋养细胞。（令人惊奇的是受精时卵中有很多核糖体，一个不带有18S和285RNA的纯合体也可以发育到蝌蚪阶段，然后死亡。）卵母细胞核为细胞的第一次减数分裂的前期提供必要的物质，但进一步的发育却被制止了。两栖类减数分裂的染色体是巨大的，在活性区域中有很多的侧环，形成灯刷染色体。在卵母细胞的核中有数以千计大小不等的核仁。每个核仁含有大小不同的环状rDNA，它是染色体上18S和28S rDNA的串联重复单位经滚环复制从染色体上释放出来的。DNA的这种扩增的过程尚不完全清楚。此DNA的环产生rRNA，组装成核糖体，储备在核仁中到减数分裂时再释放出来。另一种扩增的例子是在果蝇和其它双翅同昆虫的唾腺中。多线染色体（polytenne chromosomes）具有特异的膨松区，发现此是产生过量的DNA，而不是mRNA。eorge Rudkm 早在1960年就指出：果蝇唾腺的多线染色体其常染色质DNA可以特异扩增上千倍，而在异染区附近只可复制几次。加上细胞分裂时染色体的正常复制，在染色体存在着特殊的扩增位点，而其它的部分并不扩增。在大部分体细胞中基因组的内容是保持不变的，但是某些顺序相对比例有时会发生变化。最有特色的例子是昆虫的幼虫发育，在它们的基因组中特定的特殊序列会过量复制（coverreplication）或者复制不足（underrepliicaation）。复制不足发生在果蝇的多线染色体中。在此组织中，巨大染色体是由原来的二套染色体被多次复制而形成。黑腹果蝇。（D.melanogaster）的基因组约有1/4的区域是由异染色区构成的，形成染色体中心（chromocenaer），其大部分构成了卫星DNA序列。与二倍体细胞相比，在唾腺细胞中，异染色质的相对含量非常少。这是由于常染色质DNA顺序在多线化的过程中大量复制，而异染色体部分却不能大量复制。测定了卫星DNA的含量表明此序列不复制或很少复制，而常染色质在唾腺中复制9次。多线组织的 rRNA基因也是复制不足的，rDNA的区域虽有67次的复制，但实际上无论存在一个还是两个核仁形成区，最终达到的水平都是相同的。这种剂量控制形式可能仅特异于rDNA。黑腹果蝇的基因组在多线组织中可以分成三种类型控制复制区。一个很自然的假设是各类区域的复制原点控制起始的数量。卫星DNA中的起始区不易识别； rDNA中的起始区对r DNA基因的数量作出反馈性反应，停止其功能；一般的常染色质的起始区可持续起始直到结束。在昆虫中特殊蛋白的编码序列存在着不同的扩增。在Rhyncosciara 和其它昆虫的唾腺中产生DNA膨松（DNA puffs）。这种膨松表面上和双翅目中多线染色体存在的活性斑带相似，但膨松却含有局部的DNA扩增。此扩增的序列可能经过4次复制，使拷贝数增加了16倍。在黑腹果蝇的发育中，其卵壳基因提供了一种不同的扩增机制，卵壳蛋白是由多倍体的卵泡细胞合成和分泌的。昆虫的卵壳基因成簇排列，在黑腹果蝇中已鉴别出两组。在卵泡中其中一组位于X染色体上的基因在表达之前，经4次重复，扩增了16倍；另一组基因在第 染色体上，它们经6次重复，扩增了64倍。在这两组中，扩增区域延伸到卵壳基因另一侧约4550 Kb。扩增最多的区域是在卵壳基因周围约20Kb的区域。当扩增延伸到另一侧时，扩增显示出一个下降的斜率。是什么在控制这种扩增呢？下降的斜率表明在单个分子中扩增区域的端点是异源的。从图18-2中的横型中可能得到解释。双向复制的重复起始发生在这个区域的中心部分。复制叉相距1050Kb。这个模型认为整个的复制区是作为一个复制子。此复制区是否含有一个顺式一作用区负责复制呢？当这个区域的染色体发生突变时应不会出现扩增。在杂合子中，染色体的突变也会阻止扩增。若这区域被易位到别处的话。它本身的复制叉也会发起扩增。单眼缺乏（ocelliless）突变的性质和这种推测是符合的。这种突变导致了复杂的表型变化，它是约3个斑带区域的倒位，位于X染色体上，含有卵壳基因的区域。卵壳基因位于倒位左端3Kb的区域。这个倒位引起重要的改变是扩增横式的变化。图18-3将野生型和小眼缺失突变的扩增区域进行了比较，原来的扩增区在断裂点的左侧长40Kb；易位后扩增区在断裂点的右侧，长约50Kb。扩增的水平比原先有所减少，约是野生型极大值的一半（水平减少的原因尚不清楚）。结果表明复制原点能发起卵壳蛋白附近区域扩增。无论复制原点的位置发生什么变化，扩增区域的延伸仍保持不变。（1）基因组序列的选择性扩增真核基因组具有调节内、外源基因组附加序列的能力。外源序列是通过转染（transfection）传导入细胞的。内源序列是由某一存在序列通过扩增而产生的。在这两种情况下它们的共同特点是：附加序列有可能以串联排列的形式含有很多重复单位的拷贝。包涵在重复单位中的基因并不是每个拷贝都需要表达。但表达随着拷贝数趋向于增加。无论是由转染还是扩增而产生的多拷贝串联序列在细胞中可能以两种形式存在。若它形成染色体外的单位。则以一种不规则的方式遗传：在真核细胞分裂时，细菌的质粒是不能均等地分配到子细胞中，因此完整的单位很少存在。内源序列的扩增是由那些对一定的试剂敏感的选择细胞所发动的。最好的例子是在一定的细胞系中加入氨甲喋呤（ methotrexate） 结果导致扩增。此试剂是二氢叶酸还原酶(DHFR)的抑制剂，可阻断了叶酸盐的代谢。DHFR的突变，改变活性使其对氨甲喋呤产生抗性。酶本身的改变是作为一种选择，而酶量可以增加。酶量的增加是dhfr结构基因数目的扩增所致。扩增发生频率要比自发的点突变的频率多得多，一般的范围是10-410-6。像这样类似的基因扩增现已发现20种以上的其它基因。在这些系统中大部分存在着共同的特点，就是简单地一次加入试剂并不能获得高度抗性的细胞，而是逐步地增加有毒试剂的剂量，使细胞渐渐适应，从而产生抗性细胞。因此基因的扩增是需要一系列的步骤。扩增也仅仅只发生在二个dhfr等位基因中的一个上。对氨甲喋呤抗性的增加是依靠这一基因座位扩增的程度来完成的。在抗氨甲喋呤细胞中dhfr基因数目的变化范围是40400拷贝，拷贝数的多少取决于选择的程度和单个细胞系本身。mtxr (metnotrexate 抗性) 细胞系分为稳定系和不稳定系两类，细胞在缺乏氨甲喋呤的条件下生长时除去原来的高水平DHFR活性的压力，它们的反应不同，二者的差别如图18-4所示。（1）在稳定系中搁增的基因得以保持，因为它们位于染色体上dhfr基因的位点上，而其内源染色体上的等位基仍保持正常的单个拷贝。（2）在不稳定系统中，当选择压力释放时，扩增的基因至少会部分丢失。但未丢失的是以染色体外的排列方式存在。基因扩增在染色体上有一个可见的效应。在稳定系统中，dhfr位座能形成一个均染色区（homogeneously staining region,HSR），例如图18-5所示的情况。称其为均染区是由于在染色体上存在着一条增加的区域。用分带技术来处理(如G带)后，这一区域不显示任何染色体带，表明带间的某一区域经历了一种扩增。在不稳定的细胞系中，看来常有dhfr基因的染色体没有什么明显的改变，但是可以看到很多染色体外的点状染色体，称为双微体(double-minute chromosomes)（图18-6）。在典型的细胞系中，每个双微体带有24 dhfr基因。双微体可以复制；但它们没有着丝粒，结果它们不能附着在有丝分裂的纺锤丝上，因此不能均等分离进入子细胞。虽然它的名字叫双微体，实际上可看作为染色体外的微小染色体。双微体的不规则遗传解释了在这个细胞系中氨甲喋呤抗性的不稳定性。在细胞分裂时双微体连续地丢失；在氨甲喋呤存在时，dhfr基因减少的细胞将会死亡。只有哪些保持足够数量双微体的细胞才能幸存下来。双微体的存在减少了增殖细胞的比例。当去除选择压力时，缺乏基因扩增的细胞便有了一种优势，它们可以迅速产生后代，在群体中占主导地位。这就解释了为什么这种扩增状态仅存在具有氨甲喋呤的环境中。由于双微体不均等分离，在分裂时受到选择的细胞中，其拷贝数能迅速增加。在培养条件中增加氨甲喋呤的水平，结果带有大量双微体的细胞也增加。双微体的行为解释了mtxr条件的逐步进化和不稳定细胞系中dhfr基因水平持续不断地波动。稳定和不稳定细胞系，两者都是在氨甲喋呤抗性长期选择之后产生的。基因扩增的最初阶段是由什么起始的呢？在短期选择之后，大部分或全部的抗性细胞都是不稳定的。很明显染色体外的拷贝的形成要多于在染色体内的扩增。在此过程的最早阶段，扩增的dhfr基因可能是作为小的染色体外的单位存在，这在双微体或其它染色体变化之前是可以检测出的。扩增的区域要比dhfr本身长一些。这个基因长约31Kb但在染色体的HSR中重复单位的平均长度是5001000Kb。扩增区域的延伸在各细胞系是不同的。在双微体中含有DNA的总量的范围是1001000Kb。染色体外的拷贝是怎样产生的呢？我们知道它们后代产生时并未丢失原来染色体的拷贝。这有两种可能：（1）复制的附加环可能在dhfr基因附近起始，然后通过dhfr拷贝之间的非同源重组而产生（图18-7）；（2）或是等位基因之间的非同源重组来起始这个过程。额外的拷贝可能是通过类似于重组的事件将其从染色体释放出来。根据这些事件的特点，不难推测，它可能会产生出一个含有单个或多个拷贝的DNA分子。若双微体含有环状DNA的话，在任何情况下它们之间的重组似乎是可以产生多体分子。一个不稳定的细胞系其扩增的基因编码了一个突变的DHFR酶，它提供了一些涉及到双微体得以永存的信息。在原来的二倍体细胞系中并不存在这种突变的酶，因此突变必然是在扩增某一时刻发生的。尽管扩增基因的数目不同，但这些细胞仅仅显示了突变酶。一旦染色体外的基因被扩增了，细胞状态的改变就由这些基因介导，而不由原来染色上的拷贝来控制。当除去后，此细胞系以通常的方式丢失了双微体。若再加氨基喋呤，正常的基因又被扩增，产生一个新的双微体群体。此表明没有一个突变基因的染色体外的拷贝整合入染色体。这些结果还表明突变系的双微体只带有突变基因。若每个双微体多于一个dhfr基因时，那么所存的双微体必定表现为突变型。这表明多拷贝双微体可能由单个的染色体外基因产生的。一个重要的问题是扩增的染色体拷贝是由整个核外染色体拷贝产生的，还是通过一种游离的机制。现在我们还不知道扩增的过程是染色体内的基因以重新合成的方式来进行还是通过染色体外的扩增作为介导。基因扩增的这种形式是取决于相关的特异基因座。有的细胞系趋向于产生双微体，而另一些细胞系较多的产生HSR。扩增的另外一些情况是由对氨甲酰基转移酶（trauscarbamylase）抑制物的抗性，它是通过CAD基因的扩增来实现的。（CAD是一种蛋白，它是UMP合成途经中三个酶中的第一个）。CAD DNA是扩增是在染色体中发现的。在此情况下，被扩增的基因是以分散的形式分布在扩增区域，常涉及到一条以上的染色体。：体积巨大（图12-26），比其它体细胞染色体长100-200倍，体积大1000-2000倍，这是由于核内有丝分裂的结果，即染色体多次复制而不分离。多线性，每条多线染色体由500-4000条解旋的染色体合并在一起形成。体细胞联会，同源染色体紧密配对，并合并成一个染色体。横带