对微生物引起腐蚀抑制美国田纳西研究.doc

美思国际 法国创新 Serving Industrial with TechnologyMMEXEL 432 美国 田纳西大学 应用微生物学研究所 报告THE UNIVERSITY OF TENNESSEE KNOXVILLE, U.S.A.微生物影响金属锈蚀之生物活动过程Microbiologically Influenced Corrosion (MIC)：l 以次氯酸钠、戊二醛及M.432三种抑制剂之作用比较、研究n 本文译自The University of tennessee Knoxville ReportA) Comparative study of the efficacy of three different compounds against corrosion of 316 L stainless steel in synthetic sea water mediumB) Study of the effect of MEXEL 432 on the behavior of 304 L stainless steel in the presence of bacterial monoculture” (completed on 1991)美国 田纳西大学 应用微生物学研究所 报告u 主题：A). 在海水环境中对抗不锈钢(316L)锈蚀作用三种不同成分抑制剂效力比较研究B). Mexel 432 对304L不锈钢在单一细菌培养作用下的效果研究C). Mexel 432 在单一细菌培养中的稳定性和效率之初步研究A). 在合成海水环境中对抗不锈钢(316L)锈蚀作用三种不同成分抑制剂效力比较研究一 绪言(Introduction)在微生物影响金属锈蚀作用microbially influence corrosion(MIC)的活动中，与海水和淡水环境里的金属表面有关连的细菌性生物附膜，扮演着极重要的角色。时常有若干锈蚀性的机制被认定是由于保护性H2所引起细菌阴极偏离(退极化)的效应，硫磺侵袭、有机酸的产生以及不同氧电池(cells)的产生等因素，可是MIC主要归因于细菌的细胞和下层基质发生了直接结合的关系。 MIC仰赖着三种因素：1).生物膜生长的因素及在大环境中活动的组成性质2).下层基质的本质3).组成生物膜的微生物如果能阻止微生物细胞接触到基质，或者它们在基质表层是处于非活性状态，或者把基质造成不易起化学变化，那么微生物的活动是不会影响锈蚀率的。大部份杀生物剂的效力作用，都以对浮游性生物能产生效果当作终止点。遗憾地说，这样的作用方式存在着两个明显的缺点：1). 使用化学及物理作用来阻止浮游性生物，是要比固着性微生物敏感很多。所以对阻止生物膜观点来说，这些作用很少被认为是一种灭生物的效力。2). 控制MIC可以不必要求生物膜(或浮游生物)细菌先处于不同形式的休止状态。用非杀菌界面活性剂来阻止MIC，而不需要添加任何有毒物质于微生物身上。从环境立场来说，这种抑制剂才是最能吸引人的。在本研究中，我们将二种很普遍用于处理生物性污塞和生物性腐蚀的，次氯酸钠以及戊二醛和获得专利权的界面活性剂MEXEL 432做比较。本实验的目的是要验证，M.432锈蚀抑制剂到底会不会影响以一个仿真污塞管路内316L不锈钢(SS)基质暴露在海水生物下之电化学和固着细菌总数的形成程度。系统设计的是仿真最恶劣的情况，以静止的状态让细菌和海水环境去接触所测试的不锈钢基质。这个仿真环境设计有U形弯角，形成只能缓慢流动的循环系统，停滞水区、分配系统中支流管的死角区，以及循回系统停止工作滞怠期等状况。二 实验用系统(Experimental System) 试片准备：所用试片是坚硬的316不锈钢圆筒(金属样品Munford，A1)，尺寸：6cm(直径)1.6cm(长度)。试片的一端使用磨轮、600细目砂、以手工磨成600细目亮度。 试片夹具：以一个3.8cm直径的聚乙烯螺丝钻孔来接合1.6cm的试片。在钻孔内凿有两个中心点凹槽，各贴塞了O环，以确定良好的密封效果。在试片边缘四周甚至也涂了硅胶，使表面层尽可能平顺。在聚乙烯螺丝内另有钻孔0.64cm系上带子便于取下材料。并且安装一条电线通过不锈钢栓延伸到激活电极。 个别仿真输送管路设计：试验用管路系统包括一系列5.1122cm，编号40的聚乙烯管子。 每支管子末端用盖子盖住，盖子本身是一种带头螺栓，可以连接管子。在底部边缘挖了八个均等间隔3.8cm的小孔，且塞入了接引栓。接引栓可使试料夹具很安全地扭紧到管路上。在其中的三支接引栓对面钻了2个小孔来装置参考电极和钛对照电极。 电极：试片本身就当作电极。在聚乙烯螺丝的正面有一不锈钢螺丝作为试片和电线之间的导体。另有圆状5.13.8cm断面，0.015cm厚度钛箔片当作计算电极用。将5.1cm长度钛线焊接在箔片上，然后插入管路中。钛线穿过一个AAA橡皮塞，塞进对面结合器小孔中的钛箔片适当的紧穿过管路的内径中。参考电极使用Ag/AgCl在KCl饱合溶液中。聚乙烯螺丝钻上一个0.4cm直径的孔并安置一个Vycor箍，当做盐桥。饱和的KCl当作导体。更注意的是，虽然本系统能够摘录间断性的电子化学阻抗测量，但这些分析并非是为了此间所叙述的工作。 测试系统：总计安装八套个别的管路系统，每一套系统都安装一部1.5马力电磁离心泵、流量计、10L聚乙烯盛瓶、流水阀以及足够连接用的硅质和聚乙烯管子。 直流电路电位(OCP)和电化学杂音骚动(ECN)追踪系统：OCP是使用Keithley 706扫描仪和Hewlett Packard 3458A多频仪。测量作业每间隔30分钟记录一次，共持续17天的测试期。每30分钟测量大约2000个OCP。所记录的噪声资料是用Fourier转换型式从时间领域转换成周率领域。ECN数据可推断管路中基质表面腐蚀运作动态和再钝化的周率。 测试化学物：MEXEL 432 (Societe MEXEL,法国) 戊二醛 (Sigma 25% 级) 次氯酸钠 (Clorox, 5.25%) 海中媒体物：ASTM D.1141 海水媒体的合成物(每个系统使用了八升的海水) ，在g.1 去离子水中的显示值列表如下： NaCl 24.53 MgCl2 * 6H2O 11.09 Na2SO4 0.09*CaCl2 * 2H2O 1.54 KCl 0.695 KBr 1.101 *NaHCO3 0.201 SrCl2 *6H2O 0.042 H3BO3 0.027 NaF 0.003 Yeast Extract 0.10*KH2PO4 0.05 NH4Cl 0.05 Na Lactate 0.93*Glucose 1.00 pH 7.88.0 (*表示：在压力锅添加处理后)三 测试过程(Test Procedures) 试验过程是依照下列步骤来作业的，媒体物和仿真管路维持在室温20以下。A. 八条管路中的每一条，都注入了无菌的ASTM海水媒体(D.1141)。B. 进行OCP测量，直到取得稳定的基础线为止。C. 向其中四条管路植入Deleya marina 菌种 ATCC25374。(5ml/7108细胞ml-1菌种)D. 每个容器和海水媒体，以体积流量计测定2 lmin-1比率，回转2分钟。E. 整个实验过程中，每30分钟进行OCP监测记录。F. 在植入菌种之前，以及在17天实验终止时，进行ECN的测量。G. 植入菌种后24小时，将测试化学物添加到下列容器：容器1. D.marina菌10 ppm MEXEL 432容器2. D.marina菌10 ppm glutraldehyde(戊二醛)容器3. D.marina菌 3 ppm HClO3(残余量)容器4. D.marina菌，不添加测试化学物容器5. 无菌的10 ppm MEXEL 432容器6. 无菌的10 ppm glutraldehyde(戊二醛)容器7. 无菌的 3 ppm HClO3(残余量)容器8. 无菌的，不添加测试化学物H. 在每次添加测试化学物后，以2 1 min-1速率，回转二分钟。I. 前四天以相同的方式，添加三种杀菌剂。J. 每天都用Societe MEXEL测试套具和Hach(Loveland CO.) DPD余氯分析仪，分别测试M.432和HClO3的含量；同时也添加了一些剂量以维持原始的浓度。对戊二醛并未进行监测，在第四天以后就停止添加戊二醛。K. 测试容器是每天以2 1 min-1速率回转一次，约二分钟。L. 每隔一天从测试物中采取1ml aliguots，测试可培养数。aliguots置于75% 2216海水培养基(Difco, Detroit, M1)，于25下培养72小时。M. 实验完成后，将试片在无菌条件下，由管子里移出，定量抽取样品进行培养细胞计数以及Acridine orange直接计数法(AODC)，结果是以每cm2为基础的细胞附着量来做报告的。另外一组候补试片，先混合于2.5%的(V/V)EM级戊二醛，然后脱水和在临界点干化，再以电子扫描显微镜(SEM)观察。N. 实验总计进行17天的过程。四 结果和讨论(Results And Discussions)HClO3的残余量无法维持在0.2ppm以上。氯的需求量比较高，大约在510ppm之间波动着。然而，在整个实验过程当中，所监测的残余氯量平均大约在0.1ppm。经过17天的实验，在有培养基的容器中，(图1.)整体测试样品细菌总数(可培养总菌数)发现其下降了，这个减少的程度在含MEXEL 432的容器更加明显，十天之后在含有M.432的测试样品中，就检测出无细菌的存在。而从四个无植入菌瓶及无接种菌物的管子系统，亦无复原细菌可培养出。培养系统的AODC值是依照107细胞/cm2(图2.)的顺序。三种测试化学物和控制组的AODC值下降顺序是：MEXEL 432戊二醛次氯酸钠控制处理与未处理的管路之可培养总菌数是104细胞cm-2或者更低。在处理与未处理的管路之间的可培养总菌数看不出来有明显的不同。含培养菌管路的OCP结果显示于(图36.)。资料显示，测试化学物的添加在整体实验过程中，并没有明显的影响到OCP值。所有的电位都是在+20mV/SCE-80 mV/SCE的排列间。在四个无菌系统中，ECN资料(没有示图)并未显示出任何孔蚀再钝化的活动。(图710.)显示四个培养基容器OCP的结果。OCP的减少只有在含有戊二醛、次氯酸钠和只含细菌的管路才发现。因此从两种暴露在含有次氯酸钠或戊二醛培养基媒体的试片可以很明显看出其降低程度是超过300 mV/SCE。这样的OCP减少情形也可以在无任何化学物的培养基系统观察出来。这种减少现象可说是建议有可能已经开始在表面发生局部的锈蚀作用。在17天的测试期过后，在含M.432培养基管路系统内试片的OCP并未受到明显影响。至于那些没有培养基的管路，ECN资料(没有示图)并未显示四个培养基系统中的任何一个有任何腐蚀现象的真实证据。据了解，凡是残余氯高于0.1ppm，就会促使不锈钢起锈蚀作用，并导致金属样品的OCP接近孔蚀值。根据在无菌海水媒体观察到无增加的事实，证明它和相当低残余氯浓度有关。在一块大生物覆膜中，经过105小时观察后，得到OCP减少的事实，说明那是生物膜破裂现象，因而引起表面可能开始产生局部的锈蚀作用。在第七天，这些电位达到-300 mV/SCE之后，直到实验结束，最后的电位则达到了-150 mV/SCE。从七个管路系统中有代表性部位，所摄取的SEM显微照相图标展现在(图1 7.)(放大2000倍)。暴露于含细菌而无添加测试化学物的试片上可以观察出很明显的生物膜。用HClO3处理过的试片表面可以观察出典型的D.marina细胞，但同时却看不到有广泛生物膜的形成。很令人惊讶的是，在无细菌情况下，那些暴露在M.432的试片上却看不出生物膜的存在。而与下层基质有关联的机械痕迹就可以清楚证明没有成形的生物膜存在。暴露于M.432和戊二醛的试片上的生物膜有明显D.marina细胞体的存在。这二个状况中，细菌呈现陷入一层厚的有机膜中。而在次氯酸盐离子中就观察不出在任何试片上有明显的生物膜存在。五 结论(Conclusions)在无菌培养基状况下，测试化学物的添加量并不会很明显的影响OCP。在测试系统中可以观察到ECN的量，因此不能证明没有腐蚀活动发生。不锈钢试片上的D.marina生物膜导致OCP的减少。金属表面氧气的减少以及特定的物理及化学条件与细菌的新陈代谢是可以用来解释这种减少的原因。例如，不同氧细胞产生的生物膜本身就会引起裂缝型的锈蚀现象。MEXEL 432并不抑制D.marine形成菌落在不锈钢基质上，而维持OCP于一个稳定的程度，并且防止样品上产生任何局部的锈蚀作用。保持生物膜与基质界面间氧气和pH的稳定。以次氯酸钠和戊二醛所进行的实验导致OCP波动的现象，说明在不锈钢的表面曾有脱钝化/再钝化循环过程的可能。 B). MEXEL 432对304L不锈钢 在单一细菌培养作用的效果研究一 绪言(Introduction)先前的实验已经实际证明了在天然的海水中，MEXEL 432经由一种有机膜在表面的形成作用是可以当作海水锈蚀作用的抑制剂。另外，这些实验已经显示，附着在表面的细菌生物量有显著的减少。其机械能如何作业不很清楚，但是一种与新表面状况有关联的低pH值是能够解释所观察的结果。另外，进行了一组新的实验，其目的是为了能够对这些机械能有较深入的理解，同时也要研究MEXEL 432对处于合成海水媒体和在作细菌单一培养环境下对304L不锈钢变化的影响效果。 二 材料与方法(Materials And Method)所有实验电极用不锈钢片埋入一种环氧树酯。电极以磨光处理降低细目从120至1000、去油脂并以丙酮和酒精清洗。电极边缘用绝缘性环氧树酯涂层护盖着，暴露4cm2于外界情况。组合形式，试片先以环氧乙烷气体杀菌，然后注入1.2 1的合成海水媒体(D.1141)，并以每小时5%的流量经由容器继续不断的流动。以10ppm初始浓度的M.432抑制剂在一小时内添加到二个容器里。这里添加时间性的选择，是要让表面形成同质的薄膜。接着改以0.1ppm低残余浓度，持续保留在二个容器中，另外的二个容器则不添加M.432。整个实验过程中进行OCP的测定。每天都用MEXEL测试套具检测M.432的浓度。三 结果与讨论(Results And Discussions)OCP和时间的关系标绘于(图1.)作了区分。在未含M.432情况下，过了一天就可以观察出来两个试片的电位已经明显的降低。在实验阶段的最后几天中，观察到OCP的变化现象，这些变化说明表面已经开始产生局部性的锈蚀作用，这种现象是以一种钝化再钝化循环表述。在未处理的媒体方面，A、C阻抗图解显示出减少充电移转Rt.电阻的减少(资料未列出)。虽然如此，对MEXEL来说，这种减少现象很明显的是比较低。经过48小时后，可观察出来，含M.432方面的OCP会有缓慢减少情形。实验终了，这些电位在含与未含MEXEL的情况下，数据是-250 mV/SCE到-420 mV/SCE。当七天的实验终了，停止二个容器M.432的添加和搅动作业，设计此动作的用意是要使表面上形成一种厚的生物膜，以便将来能让厌气性细菌在生物膜里生长。未经处理的媒体OCP波动性很大。而含有M.432方面，这些电位则是维持在稳定状态。虽然如此AC抗图表在短期间内无法显示两种状况之间有任何明显的不同。 在整个实验过程中，执行pH测定说明处理过和未处理容器的个别pH值为4.8和4.5。在实验终了所执行挥发性脂肪酸分析结果显示，在二个容器中都有大量的醋酸和酪酸，这是一种细菌新陈代谢的结果。Vibrio natriegens是一生产细菌的粘质物，曾被证实会制造大量的挥发性脂肪酸。pH的减少会影响M.432的效率。在此合成物内所含二氨群和质子浓度的增加产生互动影响，就是因为减少pH所造成的结果。 Cl- R NH3H3O+ -R NH4+Cl-H2O当低分子量的胺在水中的溶解性很好时，高分子量的胺就会限制其水中溶解性。虽然如此，如果能有一种氯化铵盐的形成，那么这种不溶解于水的胺就能很快的分解了。如此，可以建议，在一个综合性海水媒体是有由细菌的新陈代谢和氯离子(20000ppm)所产生的酸性条件来导致可溶于水的胺盐的形成。可溶解性的增加也许就可以解释出先前所观察试片OCP的一致降低现象是和M.432从表面上逐渐分离和分解有关联。但是，也许有另外一种可能性是M.432可以成为浮游性和固着性细菌的有机物来源。在这个合成物里，有很明显的酒精(醇)浓度是可以用来当作细菌培养基的碳源。有需要做进一步的实验来支持这样的假设。因此,假设在两种容器中都有明显的细菌活动,是因为两者在大环境上(范围大到108细胞cm-2)的pH和细菌密度降低的结果,那么就可以建议说在无处理容器内24小时后所观察到的OCP降低现象就会和媒体内大量挥发性脂肪酸的产生有关了。以AODC的方法来确定总菌数是可以确认在两种媒体中都有大量细菌数存在。所发现两种状况的差异并不怎么明显。唯一的例外是在处理过媒体和未处理过媒体两者所减少的细菌活动关系。在M.432处理过的容器里所观察的减少活动率是有十倍之多。一旦将M.432添加和搅动作业停止下来后，所观察到的OCP波动现象就表示在表面上已产生了孔蚀作用的钝态去钝态过程的特性。从另外一方面来说，暴露在处理过媒体的表面上所有的残留有机物膜,就足以避免表面锈蚀作用的发生。四 结论(Conclusions)在自然的条件中显示M.432可以提供给软铁和不锈钢锈蚀保护。锈蚀作用的抑制效果确实是从接触表面细菌生物量的减少来获得。另外,也观察到活动的减少状况。 为能了解这种效力的机械能以及合成物是如何影响表面上生物膜的形成，就另外进行一组不锈钢表面的实验，即将不锈钢表面浸入以生产细菌的粘质物Vibrio natriegens，培养在一种综合性ASTM海水媒体里。从OCP的测定结果显示出经处理和未处理两者媒体之间是有很明显的不同。PH减少是细菌新陈代谢的结果，而有机酸的制造则是生物膜缓慢且渐进脱离表面的结果。在无MEXEL状况下，经过24小时后就观察到OCP快速减少的现象，这也说明表面所发生的孔蚀现象就像在实验终了所观察到一些试片所发生的一样。酸性条件会很严重的影响到锈蚀抑制剂的效力。这种酸性环境是可以在由海水环境所形成的生物膜里面发现。低于5的PH值曾经在自然条件所形成的生物膜中发现到。但是，海水的缓冲能量会像M.432一样能够抵消PH的减少。 但是，这些资料也指出了三个主要事实：a) .在实验室里做实验，对天然条件的插补法，务必要很小心的控制好。b) .这种腐蚀抑制剂很肯定的影响了不锈钢的电化学作用，且在实验过程中主要的是避免了OCP的明显减少。c). 甚至在大量细菌生物量与在滞留情况下，表面上的残留有机膜和低于0.1ppm的M.432的残留浓度，两者都能防止不锈钢样品开始发生任何的锈蚀作用。 C). MEXEL 432在单一细菌培养中的稳定性和效率之初步研究一 绪言(Introduction)将MEXEL 432作为置放以通气3% NaCl溶液内的碳钢的腐蚀抑制剂，曾经显示几分的内容抑制性本质存在是会添加碳钢的碱性效力。这些本质是能够以臆测这种合成物有稳定氢气化物表面膜和吸附在金属暴露面，并参与两种状况表面熬合成形的能力来解释。不可质疑的，物理、化学和水动力学的条件是会严重影响到细菌对表面的附着性以及浮游的细菌生物量。当有化学性连结在金属表面时，两物体的接触面流动力学条件是会影响到抑制剂的效率的。众所周知，高速率对于细菌的附着性以及对添加到媒体的抑制剂效率是有负面影响的。遗憾的很，腐蚀抑制剂通常是在生物膜已经在表面形成之后才添加的。先前的实验也证实了细菌活动是能够很明显的影响包含在抑制剂内某些氨基的效率的。本研究的目的是要调查细菌生物量对事先就已有腐蚀抑制剂涂膜的表面效力。这些实验是用两种类型的钢铁，即低碳钢和316L不锈钢为对象来进行的。二 材料与方法(Materials And Methods)切断碳钢和不锈钢条材作为电极，并浸入在环氧树脂中覆膜。以砂纸磨光电极，从120细目减少到1000细目，然后用酒精和丙酮去脂、清洗。电极边缘用绝缘的环氧树脂层覆盖，并使4cm2范围暴露在不同条件下。这个组装系统以氧化乙烯气体灭菌，然后加入1.2L的合成海水媒体，并以每小时5%的流动率，不断地透过容器流动。将M.432抑制剂添加到含有碳钢和不锈钢材的四支容器，以10ppm浓度做为系统出口的残留浓度，当做开始的步骤。另外两个容器不添加抑制剂。一旦试片表面(二天)形成了同质的有机膜就将繁殖粘质物和酸的Vibrio natiegens单一细菌培养基添加到全部的容器里，包括未处理的容器。在两个处理的容器里，维持着M.432的低残留浓度，而另外两个则停止添加。在实验过程中都用Keithley 706扫描仪和Hewlett Pachard 3458A多波仪来进行OCP的监测。犹如先前实验作业所做的，在本实验过程中也同样进行了ECN和A.C.阻抗图表作业。三 结果(Results)在含M.432方面，碳钢和不锈钢两者的OCP显示二天过后各自的电位稳定性大约是-650m V/SCE和-100m V/SCE。在不含抑制剂方面，两者的电位是很明显的较低。观察在缺乏继续添加抑制剂，一旦在表面形成了有机抑制剂膜，SS试片上OCP缓慢的减少(图1.)。但是，在持续添加抑制剂的情况下，其OCP的稳定性就可维持到整个实验终了。就碳钢来说，在不持续注入M.432情况下(图2.)，其电位也是较低。再者，实验当中所做的PH测定，显示在两种条件下的原始PH值减少了。两种容器的PH值是在4.5左右。偏极曲线绘制于(图3.)。没有抑制剂，其动力学是完全仰赖着扩散作用，而腐蚀作用的流量密度可视为相当于溶氧化剂(例如:200 MA/cm2)所扩散的限制性流量。有抑制剂，其动力依赖活化作用。而其半对数描述的曲线绘制说明是属超过300mv(25MA /cm2)电位系列的Tafel线。在实验过程中所做的A.C.阻抗图表说明在腐蚀过程也有相同的倾向。在无抑制剂情形下,观察到了是与低电荷移转电组有关联的。高流量密度因时间而降低的现象。在具备调整膜几天后就观察出此减少现象，就说明了不是因有机膜起了化学变化，就是有部份的膜脱离的缘故。对材料进行显微镜检查可以很清