第七章 微生物的检验技术.ppt

微生物实验技术,第七章,微生物检验技术,微生物检验技术,实验7-1食品中细菌总数测定实验7-2食品中大肠菌群测定实验7-3食品中霉菌计数法实验7-4食品中金黄色葡萄球菌检验,实验7-1食品中细菌总数测定,一、实验目的了解食品中细菌的检测方法。二、实验原理菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后(如培基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等)，所得1mL(g)检样中所含菌落的总数。本方法规定的培养条件下所得结果，只包括一群在营养琼脂上生长发育的嗜中温性需氧的菌落总数。,实验7-1食品中细菌总数测定,三、实验材料1.器材恒温培养箱，冰箱，天平，电炉，恒温水浴锅，培养皿，lmL和l0mL吸管，500mL三角瓶，玻璃珠，培养皿，试管，酒精灯，试管架，灭菌刀或剪刀，灭菌镊子，酒精棉球。2.用品市售饮料，牛肉膏蛋白胨培养基，75乙醇，生理盐水或其它稀释液定量分装于三角瓶和试管内灭菌。,实验7-1食品中细菌总数测定,四、实验方法菌落总数的检验程序见图7-1所示。(一)检样稀释及培养1.以无菌操作，将饮料检样25mL放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)内，经充分振摇制成110的均匀稀释液（如为固体检样最好用均质器，以800010000r/min的速度处理1分钟，作成110的均匀稀释液）。2.用lmL灭菌吸管吸取110稀释液lmL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，作成1100的稀释液。,实验7-1食品中细菌总数测定,图7-1菌落总数检验程序,实验7-1食品中细菌总数测定,3.另取lmL灭菌吸管，按上项操作顺序，作10倍递增稀释，如此每递增稀释一次，即换用1支lmL灭菌吸管，直至稀释到所需浓度。4.根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择23个适宜稀释度分别用吸取该稀释度的吸管移lmL稀释液于灭菌皿内，每个稀释度作两个平皿。5.稀释液移入平皿后，应及时将凉至46营养琼脂培养基(可放置46水浴保温)注入平皿约15mL，并转动平皿混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有lmL灭菌水(不含样品)的灭菌平皿内作空白对照。6.待琼脂凝固后，翻转平板，置361温箱内培养242小时。,实验7-1食品中细菌总数测定,(二)菌落计数方法作平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏，在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数。(三)菌落计数的报告1.平板菌落数的选择选取菌落数在30300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板的平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2代表全皿菌落数。,实验7-1食品中细菌总数测定,2.稀释度的选择(1)应选择平均菌落数在30300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之(见表7-1中例1)。(2)若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30300之间，则视二者之比如何来决定，若比值小于2，应报告其平均数；若大于2，则报告其中较小的数字(见表7-1中例2及例3)。(3)若所有稀释度的平均菌落均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表7-1中例4)。(4)若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表7-1中例5)。,实验7-1食品中细菌总数测定,(5)若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之(见表7-1中例6)。(6)若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表7-1中例7)。3.菌落数的报告菌落数在100以内时，按其实有数报告；大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数，也可用10的指数来表示(见表7-1中“报告方式”栏)。五、实验报告用器皿图解的形式列出食品中菌落总数检验程序图。,实验7-1食品中细菌总数测定,表7-1稀释度选择及菌落式报告方式,返回,实验7-2饮料食品中大肠菌群测定,一、实验目的了解食品中大肠菌群的检测方法二、实验原理大肠菌群系指一群在37、24小时能发酵乳糖产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。大肠菌群主要来自人或温血动物粪便，食品中检出大肠菌群则说明食品受到了人或动物粪便的污染，大肠菌群数量越多则表明粪便污染越严重，由此推测该食品存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁。,实验7-2饮料食品中大肠菌群测定,三、实验材料1.器材温箱，天平，显微镜，平皿，试管，吸管，载玻片，接种环。2.培养基和试剂乳糖胆盐发酵管，伊红美兰琼脂，乳糖发酵管，草酸铵结晶紫染液，卢戈氏碘液，95%酒精，番红染液。四、实验方法大肠菌群检验程序见图7-2所示。,实验7-2饮料食品中大肠菌群测定,图7-2大肠菌群检验程序,实验7-2饮料食品中大肠菌群测定,1.检样稀释(1)以无菌操作将饮料检样25mL放于含有225mL无菌生理盐水或其它稀释液的三角瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)内，经充分振摇制成110的均匀稀释液。(2)用lmL灭菌吸管吸取110稀释液lmL注入含有9mL灭菌生理盐水或其它稀释液的试管内，振摇试管混匀，作成1100的稀释液。(3)另取lmL灭菌吸管，按上项操作，依次作10倍递增稀释，每递增一次，换1支lmL灭菌吸管。(4)根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度每个稀释度接种3管。,实验7-2饮料食品中大肠菌群测定,2.乳糖发酵试验将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管；lmL及lmL以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置361温箱内培养242小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则报告为大肠菌群阴性，如有产气者则按下列程序进行。3.分离培养将产气的发酵管分别转接在伊红美兰琼脂平板上，置361温箱内培养1824小时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。,实验7-2饮料食品中大肠菌群测定,4.证实试验在上述平板上挑取可疑大肠菌群菌落12个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置361温箱内培养242小时，观察产气情况。凡乳糖管产气，革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。五、实验报告根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL大肠菌群的最可能数。,实验7-2饮料食品中大肠菌群测定,表7-2大肠菌群MPN检索表接种水样总量11.11mL(10、1、0.1、0.01mL各1份),实验7-2饮料食品中大肠菌群测定,其中:“”发酵阳性；“”发酵阴性。本表采用3个稀释度1mL(g)、0.1mL(g)和0.01mL(g)，每稀释度3管。表内所列检样量如改用10mL(g)、1mL(g)和0.1mL(g)时，表内数字应相应降低10倍1如改用0.1mL(g)、0.01mL(g)和0.001mL(g)时，则表内数字应相应增加10倍。其余可类推。,返回,实验7-3食品中霉菌计数法,一、实验目的1.了解霍华德(H。ward)霉菌计测装置。2.初步掌握番茄酱的霉菌计测方法。二、实验原理各种加工的水果和蔬菜制品在适宜条件下霉菌不仅能生长，还能繁殖。以番茄制品为例，在加工中若原料处理不当，产品中就会有霉菌残留。因此，利用霍华德霉菌计数法，可通过在一个标准计数玻片上计数含有霉菌菌丝的显微视野，知道番茄酱中霉菌残留的多少，对番茄制品质量的评定，具有一定参考价值。,实验7-3食品中霉菌计数法,三、实验材料1.样品番茄酱。2.器材计测装置，显微镜，折光仪或糖度计，烧杯，量筒，托盘天平等；计测装置(包括载玻片、盖玻片、测微计)结构如图7-3至图7-5所示。四、实验方法检验程序:取样称样稀释调节视野涂片观察记录计算。,实验7-3食品中霉菌计数法,图7-3载玻片正视图,实验7-3食品中霉菌计数法,图7-4载玻片侧视图图7-5测微器（配片）,实验7-3食品中霉菌计数法,1.取样抽样数量按每班成品5t以下取样1罐，产量每增加5t，取样量增加1罐。2.检样制备番茄汁和调味番茄酱可直接取样；番茄酱或番茄糊需加水稀释为固形物含量相当于20下折光指数为1.34471.3460的标准样液。（1）称样用小烧杯在托盘天平上称取10g(约28.5)番茄酱。（2）稀释向小烧杯中加入26mL蒸馏水，用玻棒搅拌均匀，即为折光指数1.34471.3460的标准样液。,实验7-3食品中霉菌计数法,3.标准视野的调节霍德华霉菌计测用的显微镜，要求物镜放大倍数为90125倍，其视野直径的实际长度为1.382mm，则该视野为标准视野。检查标准视野：将载玻片放在载物台上，配片置于目镜的光栏孔上，然后观察。标准视野要具备两个条件：载玻片上相距1.382mm的两条平行线与视野相切；配片(测微器)的大方格四边也与视野相切。如果发现上述两个条件，其中有一条不符合，需经校正后再使用。如图7-6所示。,实验7-3食品中霉菌计数法,图7-6标准视野状态下两条标准平行线、配片大方格与视野外切的相互位置,实验7-3食品中霉菌计数法,4.涂片（1）检查玻片首先用擦镜纸或绸布沾酒精将载玻片和盖玻片擦净。（2）加样用滴管或玻棒取一大滴混合均匀的样液，均匀地涂布于载玻片中央的平坦面上，盖上盖玻片(盖玻片可直接盖上去，也可以从突肩边沿处吻合切入)。如果发现样液涂布不均匀，有气泡，或样液流人沟内、从盖玻片与突肩处流出等，应弃去不用，重新制作。涂好的制片，在计测室内，每个标准视野的样液体积为：,实验7-3食品中霉菌计数法,5.观察记录（1）观察视野数及分布对一般样品，每个涂片均检查50个视野(每1个样品至少应测25个视野，才能代表样品的各个部分。如果检查结果阳性视野低于30，则检查25个视野即可；如果在3040之间，须检查50个视野；如果在4050之间，须检查100个视野；如果在50以上或超过更多，则要继续检查，直至检查25个视野的结果与一系列计算结果无差异为止)。所检查的50个视野要均匀地分布在计测室上(图7-7)，可用显微镜载物台上带有标尺的推进器来控制，从上到下，或从左到右一行行有规律地进行观察。,实验7-3食品中霉菌计数法,图7-7计测室上50个视野的分布,实验7-3食品中霉菌计数法,（2）霉菌菌丝的鉴别霉菌菌丝往往与番茄组织难以区别，但能够很有把握地加以区别。在同一视野内霉菌菌丝的特征是：霉菌菌丝一般粗细均匀。霉菌菌丝体内含有颗粒，具有一定的透明度。有的霉菌菌丝有横隔。有的霉菌菌丝有分支。而番茄组织的细胞壁大多呈环状，粗细不均匀，细胞壁较厚，且透明度不一致。,实验7-3食品中霉菌计数法,（3）记录结果阳性视野与阴性视野的判断：在标准视野下，上下调节焦距发现有霉菌菌丝，其长度超过标准视野直径(1.382mm)的1/6(即一个小方格的边长)或3根菌丝总长度超过标准视野直径的1/6，这个视野称为阳性视野，否则称为阴性视野。有时在标准视野中出现极细的菌丝丛或小菌落，则以其直径来计算，超过视野直径1/6为阳性视野，否则为阴性视野。阳性视野用“+”表示；阴性视野用“”表示。,实验7-3食品中霉菌计数法,对初次学习霍德华霉菌计测法者，做记录前，先在记录纸上划出计测室上50个视野均匀分布的小格，观察一个标准视野，立即在相应的方格内作“+”或“”的记录，或“”以空格表示(如图7-8)。这种记录方法，在计测过程中，可减少重复或遗漏计数的现象，也可以从记录表格上“+”、“”视野的分布，了解涂片是否均匀。如果一个样品做2个片子，观察结果误差较大(超过6)，则应另取样涂片，观察测定至误差6时为止。,实验7-3食品中霉菌计数法,图7-8观察结果记录示意图,实验7-3食品中霉菌计数法,五、实验结果1.计算霍德华霉菌计测数值，又称霉菌数，用百分比表示。其含义如下：将0.15mm3标准样液，均匀地摊布成厚0.1mm，直径为1.382mm，其面积为1.5mm3的标准视野，在显微镜下检查。按100个视野数计算，其中发现有霉菌菌丝存在的视野数(即阳性视野数)。根据霉菌数含义，其计算公式如下：举例如图7-8：记录的阳性视野数，片1为15，片2为16，则样品的霉菌数为：,实验7-3食品中霉菌计数法,部颁(卫生部)标准为阳性视野不超过40，在国际贸易中，合同上无要求时按部颁标准执行，合同上有要求时按合同执行；每抽取1罐样品制2个片子，每片观察50个视野，如果超过标准指标，应该继续制片，但片子数量不得少于3片即150个视野，如果计测结果相近时，可取其平均值；如对抽样结果有异议，应加倍抽样；全部合格，作为合格处理，其中有1罐不合格，该批作为不合格处理。2.报告做好计测记录，按记录计算计测结果并写出报告。,返回,实验7-4食品中金黄色葡萄球菌检验,一、实验目的1.了解金黄色葡萄球菌检验原理；2.掌握金黄色葡萄球菌鉴定要点和检验方法。二、实验原理金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆凝固。多数金黄色葡萄球菌致病菌株能产生溶血毒素，使血琼脂平板菌落周围出现溶血环，在试管中出现溶血反应。这些是鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。,实验7-4食品中金黄色葡萄球菌检验,三、实验材料1.样品奶、肉、蛋、鱼制品和饮料等。2.菌种金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、藤黄八叠球菌（Sarcinalutea）。3.培养基与试剂7.5%氯化钠肉汤，血琼脂平板，Balrd-Parker氏培养基，无菌盐水，兔血浆，草酸铵结晶紫染液，卢戈氏碘液，95%酒精，番红染液。4.器材显微镜，温箱，离心机，无菌吸管，无菌试管，无菌平皿，均质器，载玻片，L型涂布棒，酒精灯，接种环等。,实验7-4食品中金黄色葡萄球菌检验,四、实验方法检验程序见图7-9。1.一般培养称取25g固体样品，加入225mL无菌生理盐水，制成混悬液（液体样品可不稀释）。吸取5mL上述混悬液，接种于7.5%氯化钠肉汤50mL培养基内，同时挑取混悬液或液体样品直接在血平板和Baird-Parker平板划线分离。同时将对照菌种在上述两种平板上做划线分离接种。置（361）温箱培养24h。,实验7-4食品中金黄色葡萄球菌检验,图7-9金黄色葡