酶免疫测定技术PPT课件.ppt

酶免疫测定技术,1,何为酶免疫测定？,enzymeimmunoassay,EIA,抗原抗体反应的特异性,+,酶催化反应的高效性,2,酶免疫测定技术,均相酶免疫测定,异相酶免疫测定,液相酶免疫测定,固相酶免疫测定,ELISA,酶免疫增强测定技术EMIT,克隆酶供体免疫分析CEDIA,3,酶免疫增强技术EMIT,4,克隆酶供体免疫分析CEDIA,5,均相酶免疫测定,测定快速、准确、专一、灵敏试剂稳定操作过程简便数据处理简单,6,酶免疫测定技术,均相酶免疫测定,异相酶免疫测定,液相酶免疫测定,固相酶免疫测定,ELISA,酶免疫增强测定技术EMIT,克隆酶供体免疫分析CEDIA,7,酶免疫增强技术EMIT,8,根据检测目的和操作步骤不同：双抗体夹心法间接法竞争法捕获法,异相酶免疫测定类型,9,双抗体夹心法,此法常用于测定抗原，适用于多价大分子抗原的检测，而不能用于测定半抗原等小分子物质。,10,根据检测目的和操作步骤不同：双抗体夹心法间接法竞争法捕获法,异相酶免疫测定类型,11,间接法,此法是测定抗体最常用的方法。,12,根据检测目的和操作步骤不同：双抗体夹心法间接法竞争法捕获法,异相酶免疫测定类型,13,竟争法,此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。,14,根据检测目的和操作步骤不同：双抗体夹心法间接法竞争法捕获法,异相酶免疫测定类型,15,此法用于血清中某种抗体亚型成分测定。以IgM测定为例：,捕获法,抗人IgM链抗体,样本（IgM1、2）,抗人IgM链抗体,IgM1,特异抗原（Ag1）,抗人IgM链抗体,抗人IgM链抗体,IgM2,抗人IgM链抗体,IgM1,抗人IgM链抗体,IgM2,Ag1,Ab1*E,抗人IgM链抗体,IgM1,抗人IgM链抗体,IgM2,Ag1,Ab1*E,16,酶免疫测定技术的应用,均相法ELISA法,17,均相酶免疫测定主要应用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定。EMIT方法快速灵敏、准确、专一,适合临床上常规检验。药物滥用、药物中毒(包括误服与有意识服毒),吸毒酗酒、麻醉药成瘾，安眠药成瘾较严重,此外还有众多的精神病患者,因此各种类型的药物中毒是比较多的。除了医疗工作需要进行治疗药物监测之外,在急症及中毒治疗方面也要了解与掌握体内药物或毒物的品种和浓度。本方法能够适应上述的需要,除用于血药浓度测定之外,还有药物滥用与药物中毒的检测。,18,一、治疗药物监测一药物血浓度测定有地高辛、奎尼丁、利多卡因、双异丙、普鲁卡因酞胺、N一乙酞普鲁卡因酞胺(前者的有活性代谢物)、庆大霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、乙基西梭霉素、氨甲喋吟等。二、药物滥用的尿检验半定量分析有苯丙胺、巴比妥类、苯甲二氮草类、大麻类、可卡因、乙醇、美沙酮、安眠酮、阿片类、丙氧吩等。半定量分析是以阴性、低、中等三种浓度的标准品为三点制作一条标准曲线,测定样品的光吸收值变化率与标准曲线比较,可以计算样本中存在的药物与代谢物总量。三、血清三环类抗抑郁药的定性分析阿米替林、去甲替林、丙咪啧、去甲丙咪嗦、氯丙咪嗦、三甲丙咪嗓、多虑平、普鲁替林等及其4种代谢物。定性分析是应用一个一定浓度的标准品作对照,如样品的光吸收值变化率超过标准品,即为阳性;否则算作阴性。据此可作快速毒物鉴定。四、血清巴比妥类及苯甲二氮草类的半定量分析7种巴比妥类及13种苯甲二氮草类药物的半定量分析。测定方法亦系以阴性、低、中等三种浓度的标准品作对照比较,以测算样本中存在的药物量。,19,ELISA法,酶联免疫吸附法（ELISA）是1971年由Engvall等建立的一种生物活性物质微量测定新技术，以其灵敏度高，特异性好等优点，在生命科学各领域得到广泛应用，它已迈出医药、临床领域，步入农业、渔业、畜牧业和食品加工业。常规的ELISA测定法有：间接法、双抗体夹心法和抗原竞争法。在实际应用过程中，该技术常不断改进，形成了多种分析方法，并且在检测的灵敏度、特异性、操作简单化以及实时、高效等方面都有很大提高，可以说ELISA是当前应用最广、发展最快的一项微量测定技术。ELISA原则上用于检测抗原、抗体及半抗原，在实际应用中可作疾病临床诊断与监察、食品中有害成分残留的测定、与基因工程合并使用等，为保障人类健康发挥着巨大的医学与遗传学作用。,20,医学临床中的应用医学中，检测各种抗原和抗体，为临床疾病的辅助诊断和早期诊断提供了特异性，敏感性强的试验基础。ELISA广泛应用于内分泌、血液、肿瘤、传染病、免疫化学等方面，例如：用于检测雌性激素、胰岛素等，检查凝血因子、红细胞抗原等；用于检查甲胎蛋白，其敏感性已达到放射免疫试验相当的水平。ELISA在抗体检测中优势突出，尤其对病毒检测明显优于常规检测方法。例如：对流感病毒、腮腺炎病毒、脑炎病毒、狂犬病毒和脊髓灰质炎病毒等的检测。同时用作自身免疫病抗体测定以及对过敏的诊断，例如检测过敏原的抗体。乙型肝炎、原发性肝癌的血清学检测：用血清学方法检测肝炎病毒的抗原或抗体，一直受到高度重视。上述各种肝炎病毒抗原或抗体的检测方法，绝大多数都是ELISA法。80原发性肝细胞癌患者的，血清甲胎蛋白（AFP）含量增高。临床借助对AFP的检测作为对原发性肝细胞癌的辅助诊断。HIV抗体初筛：抗体测定必须区分初筛和确认两个步骤,目前常用的初筛实验方法为第3代ELISA试剂,其敏感性和特异性均可达99%以上。现已发展到抗原加抗体联合检测第四代试剂,包被和标记的分别是HIV1/2O抗原和HIV-lP24抗原的单克隆抗体,可同时检测HIV抗原和抗体,检出时间提前大约七天。,21,梅毒的早期诊断：检测梅毒螺旋体IgM抗体（TpIgM）在早期梅毒诊断中有重要的意义。采用ELISA法，进行血清/脑脊液的梅毒螺旋体IgM抗体的检测。在献血员中梅毒螺旋体抗体的筛查中也常用此法，有利于控制和减少梅毒的输血传播。定量检测内毒素：临床上，细菌感染的患者常发生内毒素血症，死亡率高达2030，检测标本中的LPS对早期诊断和防治有重要意义。食品中有害成分残留的测定检测食品中的毒素：采用辣根过氧化氢酶（HRP）标记高亲和力的黄曲霉毒素1(AFTB1)抗体，建立了直接竞争抑制ELISA快速筛选法。大大缩短了检测时间。一些蛋白质即使经过了加工处理，也是一种潜在的过敏原，会让某些人产生过敏反应。采用多克隆抗体间接竞争ELISA法和抗体夹心ELISA法，可测定食品中的痕量花生蛋白和榛子蛋白。组胺既是鱼类食物中毒的主要原因，也是“奶酪综合症”的病因。测食品中的残留农药：迄今为止，应用ELISA检测食品中的残留农药主要是除草剂、杀菌剂和杀虫剂。ELISA法测定农药残留以其特异性强、灵敏度高及快速准确而得到广泛的应用，尤其是现场控制水果、蔬菜、食品中的农药残留，对发展无污染农产品，保障人体健康起到积极作用。检测食品中的微生物：制备单克隆抗体分析食品中伤寒沙门氏菌，结果准确可靠，比常规方法缩短了34，而且与其它沙门氏菌交叉反应率很低，与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌无交叉反应。检测食品中其它成分：植物雌激素在植物中含量很低，但它能帮助治疗一些疾病。用ELISA分析植物雌激素。牡蛎蛋白是牡蛎精粉的主要活性成分，可采用斑点酶联免疫吸附法(Dot-ELISA)测定牡蛎蛋白的含量。另外，ELISA也可以用来检测食品加工过程中的酶(如磷酸丙糖异构酶、转谷氨酰胺酶)含量的变化。,22,ELISA的应用存在的问题ELIS