第十一章核酸的生物合成.ppt

第一节DNA的生物合成第二节RNA的生物合成,第十一章核酸的生物合成,中心法则涉及的几个概念复制：是亲代双链DNA按碱基配对原则，准确形成两个相同核苷酸序列的子代DNA分子的过程。两条DNA链都可作为复制的模板。转录：是以一条DNA链为模板，将DNA链上储存的遗传信息按碱基配对原则准确转换成互补的mRNA的过程。翻译：是以mRNA为模板，将mRNA上的遗传信息转换成蛋白质的氨基酸序列的过程。中心法则：遗传信息由DNAmRNAPRO的流动途径。,中心法则：遗传信息由DNAmRNAPRO的流动途径。,补充和完善之处：A：RNA作为遗传物质能自我复制，并作为mRNA指导PRO的合成。B：RNA能以逆转录的方式将遗传信息传递给DNA分子。,第一节DNA的生物合成,一、半保留复制,1、半保留复制的概念,DNA在复制时，两条链解开分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组成新的DNA分子。由于子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制。,2、DNA的半保留复制实验依据,1958年Meselson&stahl用同位素示踪标记加密度梯度离心技术实验,证明了DNA是采取半保留的方式进行复制.,15NDNA,14N-15NDNA,14NDNA,14N-15NDNA,Meselson-stahl实验（a）密度梯度离心的DNA带（b）对应于左侧DNA带的解释,3、生物学意义保持了物种的相对稳定性.这和DNA的遗传功能相吻合，但这种稳定性是相对的，因为DNA在代谢上不是完全惰性物质：（1）一定条件下，DNA会损伤，需要修复；（2）在复制和转录中，DNA会有消耗，需要更新；（3）在发育和分化中，DNA特定序列可能修饰、删除、扩增、重排。,4、遗传物质的条件：能储存自己的遗传信息；能准确将遗传信息传给后代；必须有能力在不损失亲代主要信息的前提下，做一些小的变化，即变异。,二、与DNA复制有关的酶和蛋白质（原核生物）,（一）DNA聚合酶1、DNA聚合酶pol(1)具53聚合酶活性将脱氧核糖核苷三磷酸dNTP逐个添加到具有3OH末端的多核苷酸链上形成3，5磷酸二酯键。特点：A：底物为dNTP；B：DNA模板(35)；C：引物：RNA引物（带3羟基）；D：方向53；F：产物DNA的性质与模板相同。,DNA聚合酶催化的链延长反应,子链,3,5,模板链,(2)具有35端核酸外切酶的活性有校对功能，能在3OH端将DNA链水解。以保证DNA复制的真实性。,DNA聚合酶的3-5外切酶水解位点,3,3,5,5,错配碱基,(3)具有53端核酸外切酶的活性由5端水解DNA链，主要是切去一小段DNA，包括RNA引物和损伤DNA部分。pol主要功能：用于修复DNA双螺旋区中的单链区，这些单链区是在DNA复制时或DNA受损伤后留下的。活性高。,DNA聚合酶5-3外切酶活力,5-3核酸外切酶水解位点,单链缺口,5,2、DNA聚合酶pol具有35端核酸外切酶的活性,主要负责DNA的修复，在一定程度上参与DNA复制。活性低。功能不十分清楚，是一种修复酶。,3、DNA聚合酶pol是使DNA链延长的主要聚合酶，目前已知全酶是由7种多肽形成的复合物，含有10种共22个亚基组分（22222222222）和Zn原子。,大肠杆菌DNA聚合酶全酶的结构和功能,延长因子,DNA聚合酶异二聚体,核心酶,校对,引物的结合和识别,促使核心酶二聚化,（1）亚基：具53端聚合酶活性（需模板和引物）；（2）亚基具35端核酸外切酶的活性。校对作用，以提高保真性；（3）、亚基相连形成核心酶pol，亚基起组建作用；（4）核心酶+亚基后成为二聚体，称为pol；（5）pol与、亚基结合，形成pol，、亚基可增强酶与模板的结合；（6）pol与亚基结合形成全酶，亚基犹如夹子，夹住DNA向前滑动，不脱离，提高持续合成能力。,大肠杆菌三种DNA聚合酶比较,DNA聚合酶,分子量每个细胞的分子统计数5-3聚合酶作用3-5核酸外切酶作用5-3核酸外切酶作用转化率,DNA聚合酶,109，000400+1,120，000100+-0.05,400，00010-20+-50,比较项目,DNA聚合酶,切除引物修复,修复,复制,功能,1999年发现聚合酶和，它们涉及DNA的错误倾向修复（erroounerepair）,pol不是DNA复制酶，理由：A、该酶合成DNA速度太慢，只是细胞内DNA复制速度的1%；B、持续合成能力较低，而细胞内DNA复制不会频繁中止；C、许多基因突变都会影响DNA复制，但都与pol无关。,4、DNA聚合酶polpol1999年发现，涉及DNA的错误损伤修复。能在DNA许多损伤部位继续复制，而正常的pol、pol、pol在此部位不能形成正确碱基配对而停止复制，在跨越损伤部位时造成错误倾向的复制。,真核生物的DNA聚合酶：有六种：在DNA复制中起主要作用，与随后链合成有关；：在DNA复制中起主要作用，与领头（前导）链合成有关，具有35端核酸外切酶的活性；：修复功能；：位于线粒体中，与线粒体DNA复制有关；：具35端核酸外切酶的活性；附属蛋白：具35端核酸外切酶的活性。,（二）解螺旋酶（helicase）使DNA双螺旋的两条链分开。条件：ATP提供能量，有单链DNA存在。随后链：解旋酶结合于它的模板上，移动方向是53；领头链：另一种解旋酶叫rep蛋白，移动方向是35。,（三）拓扑异构酶（DNA松弛酶）（topoisomerase）涉及超螺旋的松弛，复制后又涉及到它们的再次形成。正超螺旋（左）：双螺旋DNA处于拧紧状态时形成的超螺旋，使DNA解开双螺旋困难：负超螺旋（右）：双螺旋DNA处于拧松状态时形成的超螺旋。,拓扑异构酶对DNA的超螺旋进行精确调节，从而在DNA重组修复和DNA其它转变中起作用。分为两类：1、拓扑异构酶：可瞬时打开双螺旋的一条链，然后再连接。不需能量，同转录相关。2、拓扑异构酶；使DNA双链同时断裂，然后再连接。需能量ATP，同复制相关。拓扑异构酶可除去负超螺旋，拓扑异构酶可引入负超螺旋，消除复制前产生的正超螺旋，协同作用控制DNA拓扑结构，有利于DNA解开双螺旋。,（四）引发酶（引物合成酶）引物的合成由引发酶催化完成，这些酶在模板单链DNA上识别特殊序列，合成RNA引物。它本身没有活性，需要与“引发前体”结合在一起，形成“引发体”后才有活性。复制早期易发生碱基参入错误，用RNA较好，然后通过pol的53端核酸外切酶的活性切去，代之以dNMP，可消除最初阶段的错误。,（五）其它蛋白因子1、单链结合蛋白（single-strandbindingprotein，SSB）结合在单链DNA分子上，功能是稳定已被解开的DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。,2、引发前体由六种蛋白质组成（DnaB、DnaC、Dnan、Dnan、Dnan、Dnai），与RNA引物合成酶结合，组装成引发体（primosome）。功能：识别合成起始位点功能，可沿模板链方向移动，移动到一定位置即可引发RNA引物合成，从而合成领头链和冈崎片段。,引发体成分,（六）DNA连接酶催化子代双链DNA中的切口处的相邻3OH和5磷酰基之间形成磷酸二酯键。但不能将两条游离的DNA单链连接起来。同时该酶要求含有3OH和5磷酰基的DNA片段能以氢键与互补链结合。DNA3OHP5DNAATP（NAD+）DNA3OP5DNAAMPPPi（NMN）,E,coli连接酶催化下的连接机制,连接酶连接切口,Mg2+,连接酶,A,T,C,G,P,T,T,P,P,P,A,A,C,C,T,G,A,P,A,C,P,P,P,P,OH,T,G,G,A,T,C,G,P,T,T,P,P,P,A,A,C,C,T,G,A,P,A,C,P,P,P,T,G,G,P,缺口,3,3,5,5,5,5,3,3,模板链,模板链,三、DNA的复制过程（原核生物）DNA的合成是以四种脱氧核苷三磷酸即dATP、dGTP、dCTP、dTTP为前体，在DNA聚合酶的催化下，向DNA的3OH端添加脱氧核苷酸，在DNA的3OH与添加的脱氧核苷酸的5磷酰基间形成3，5磷酸二酯键，反应中脱去一个焦磷酸基团。合成方向：53添加到链上的每个核苷三磷酸是按照模板链的顺序由碱基互补配对原则选择的。反应的通式可写为：（NMP）n3OHdNTP（NMP）n13OHPPi,DNA聚合酶催化的链延长反应,子链,3,5,模板链,（一）双链的解开（起始）1、复制原点(ori或o)DNA分子复制的特定位置，是一段指示复制起始的序列，多富含A、T的区段。E.coli的复制原点由245个碱基对组成，关键是成串排列的3个13bp序列（GATCTNTTNTTTT）和间隔排列的4个9bp序列（TTATCCACA，是DnaA蛋白结合位点）,大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列,E.coli的oriC结构模式aOriC内富含A-T序列和4个9碱基对重复序列的分布b在oriC处复制起始模式,原核生物：只有一个复制原点。第二次复制可在第一次复制完成之前开始复制。真核生物；可在DNA链上的多个不同位点同时起始复制。所以真核生物的DNA复制速度比原核生物快些。,真核生物DNA的多起点复制,2、复制叉（replicationforks）复制叉：复制中的DNA分子，未复制的部分是亲代双螺旋，而复制好的部分是分开的，由两个子代双螺旋组成，复制正在进行的部分叫做复制叉。DnaA蛋白是关键成分，大约20个与复制原点的4个9bp序列结合，使DNA连续不断变性，启动解链过程复制子：基因组能独立进行复制的单位。每个复制子含有控制复制起始的起点，可能还有中止复制的终点。,果蝇胚胎中复制DNA的电子显微镜照片从图中可以看到大量的复制叉，左下角为照片的示意图,方向：复制叉从起始点出发，沿DNA移动，移动方向与前导链的延长方向相同。复制可能是单向的，也可能是双向的，两个方向的复制速度不一定相同。大多数是双向的。眼状结构：线状DNA分子上的正在复制的部分形成；结构：环状DNA分子上的正在复制的部分形成。,DNA的双向和单向复制,两种复制模式（a）单向复制模式（b）大肠杆菌染色体DNA双向复制模式,单向复制,i,双向复制,观察到的放射自显影图象,18%,质粒ColE1的单向复制示意图,单向复制,最早研究DNA复制起点和方向的是J.Cairns（1963年）。,型,DNAReplication,（二）RNA引物的合成引发酶与引发前体结合形成引发体，引发体在复制叉上移动，识别合成的起始点，引发RNA引物的合成，该过程需ATP提供能量。方向：以DNA为模板，53长度：几个至10个核苷酸，5端含3个磷酸残基，3端为游离羟基。,为什么需要RNA引物、而且最后要切除？1、DNA聚合酶有校正功能，每引入一个核苷酸都要复查一次，无误后方继续下去，它不能从无到有合成新的链，因为在未核实前一个核苷酸处于正确配对状态时是不会进行聚合反应的；2、RNA引物是从新开始合成的，错配的可能性大，在完成引物功能后即将它删除，而代之以高保真的DNA链。,（三）DNA链的延长在一个复制叉内两条链的复制方向、合成方式、复制速度是不同的。前导链（领头链）（leadingstrand)：以一条链（35）为模板时，子代链的合成方向是53，合成是连续的，合成速度较快。,随后链（后随链）（laggingstrand）；以另一条亲代链（53）为模板时，子代链的合成方向不能按照35方向进行，因为迄今没有发现这样的DNA聚合酶，因此只能合成方向为53方向的许多DNA小片段（约1000-2000dp，7-10S），为1968年日本人冈崎等人发现，叫冈崎片段，然后在DNA连接酶催化下，连接起来形成一条子代链。合成是不连续的，合成速度较慢。当一段新的冈崎片段合成后，pol行使53核酸外切酶活性切除引物，再合成一段DNA作为替换，缺口由DAN连接酶封口。,原核细胞DNA的半不连续复制复制过程,复制叉的移动方向,3,5,3,5,复制的起始,DNA链的延长,DNA链终止,大肠杆菌复制体结构示意图1,机制：后随链的模板在全酶上绕转180。形成一个小环，使冈崎片段合成方向与前导链合成方向一致，与复制叉移动方向一致，最后形成大环再释放，当然，每合成一个冈崎片段都需起始一次，由引物酶合成一个引物。,聚合酶III核心酶,大肠杆菌复制体结构示意图,聚合酶I,聚合酶III核心酶,滞后链,前导链,解螺旋酶,引物合成酶,RNA引物,引发体,拓扑异构酶II,-夹子,-聚体,-夹子,-复合物,RNA引物,单链结合蛋白（SSB）,复制叉处前导链和随后链同时合成的工作模型,参与DNA复制叉移动的蛋白质,前导链和滞后链的合成,半不连续复制：在DNA复制过程中，一条链的合成是连续的，另一条链的合成是不连续的。pol全酶同时负责前导链和后随链的合成。,（四）终止有终止子位点（22bp），有一种蛋白质称为终止利用基质与终止位点结合，抑制解螺旋酶的活性，阻止复制子通过终止位点。,大肠杆菌染色体复制的终止,复制叉2,复制叉1,终止复制叉2,终止复制叉1,复制叉1,复制叉2,完成复制,DNA拓扑异构酶,连锁染色体,1、前导链连续复制完毕后：（1）pol：切除引物，表现53核酸外切酶活性；（2）pol：催化合成一段DNA填补上，表现53聚合酶活性；（3）在DNA连接酶作用下，连接上述两种DNA片段。,2、后随链当新形成的冈崎片段延长至一定长度时：（1）pol：在DNA片段与引物RNA之间切断，表现53核酸外切酶活性；（2）pol：催化合成一段DNA填补上，表现53聚合酶活性；（3）连接修复：在DNA连接酶作用下，连接上述两种DNA片段。pol：修复错配碱基。,（五）复制后DNA再加工两组反应：1、起修饰作用的甲基化酶催化碱基甲基化，以防止DNA被限制性内切酶降解；2、由多种不同的DNA修复机制组成。,四、真核细胞DNA复制不十分清楚，与原核生物DNA复制比较：（一）一致：1、基本机制相似。如半保留复制、半不连续复制。2、所需酶相似。,（二）区别真核生物原核生物复制起始点多个一个复制方向双向单向复制速度较快较慢起始点是否连续复制不是催化DNA链延长的酶两种酶（pol、）一种酶（pol）引物酶的结合情况与DNA聚合酶与解旋酶,DNA复制具有高度的真实性，以保证遗传信息一代一代传递，物种不会改变。主要有三个因素：1、具有35核酸外切酶活性的pol、pol切除参入的错误碱基；2、复制体的组成。各种酶、蛋白质在性质、活性上相互依赖，形成网络，保证反应过程极高精确性；3、使用RNA引物而不是DNA引物，可消除初期容易发生的错误（错配碱基）。,DNA聚合酶的校对功能,聚合酶,错配硷基,复制方向,正确核苷酸,5,5,5,3,3,3,切除错配核苷酸,五、DNA的损伤修复（一）突变基因组DNA的碱基顺序发生突然而永久性的改变。1、点突变：指一个或几个碱基对被置换。有两种形式：转换：一个嘌呤碱基或一个嘧啶碱基转换为另一个嘌呤或嘧啶碱基。如TA被CG替换。颠换：嘌呤碱基变成嘧啶碱基或嘧啶碱基变成嘌呤碱基。如TA被AT替换。2、结构畸变DNA的大段碱基发生改变。包括：插入、缺失、倒位、易位。,DNA突变的类型,野生型基因,碱基对的置换(substitution),移码突变(framesshiftmutation),造成DNA损伤的原因可能是生物因素、物理因素或是化学因素；可能来自细胞内部，也可能来自细胞外部；受到破坏的可能是DNA的碱基、糖基或是磷酸二酯键。物理诱变剂：如紫外线、X射线等。生物诱变剂：如噬菌体、抗菌素等。化学诱变剂：直接作用于DNA模板的诱变剂，如亚硝酸、烷化剂等。碱基类似物：如5溴尿嘧啶。移码诱变剂：如普鲁黄。,（二）DNA的损伤修复系统1、直接修复（directrepair）对由紫外线引起的胸腺嘧啶二聚体的光复活作用是一种高度专一的直接修复方式，只作用于由紫外线引起的胸腺嘧啶二聚体。这种结构不能形成碱基配对，使DNA链丧失了模板的功能。用强的可见光照射受损伤的细胞，可见光将光裂合酶激活，此酶与二聚体结合并将其恢复成两个单独的嘧啶碱。,胸腺嘧啶的形成示意图,DNA紫外线损伤的光裂合酶修复,1、形成嘧啶二聚体,2、光复合酶结合于损伤部位,3、酶被可见光激活,4、修复后酶被释放,2、切除修复（excisionrepair）是在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤部分切除掉，并以完整的那一条链为模板，合成出切去的部分，然后使DNA恢复正常结构的过程。包括两个过程：一是由细胞内特异的酶找到DNA的损伤部位，切除含有损伤结构的核酸链；二是修复合成并连接。,DNA的损伤和切除修复,碱基丢失,碱基缺陷或错配,结构缺陷,切开,核酸内切酶,核酸外切酶,切除,DNA聚合酶,DNA连接酶,AP核酸内切酶,核酸外切酶,切开,切除,修复,连接,糖苷酶,插入酶,碱基取代,细胞含有的DNA糖基化酶能使不正确的碱基或发生改变的碱基的糖苷键断裂，切除碱基，产生一个只保留有脱氧核糖磷酸部分的位点。称为AP位点（无嘌呤或无嘧啶的位点）。一旦AP位点形成后，即有AP核酸内切酶在AP位点附近将DNA链切开。在AP位点必须切除若干核苷酸后才能进行修复合成，细胞内没有酶能在AP位点直接将碱基插入，因为DNA合成的前体物质是核苷酸而不是碱基。,3、错配修复（mismatchrepair）复制过程中，DNA多聚酶将不正确的碱基参入DNA链而形成一些非WatsonCrick配对形式。当DAN多聚酶和的校正功能不能纠正这种错误时，它可以通过错配修复机制来消除。,（4）错配修复（mismatchrepair）错配修复实际上是一种特殊的核苷酸切除修复，它专门用来修复在DNA复制中出现的新合成DNA链上的错配的碱基。但如何避免将DNA链上正确的碱基切除呢？这就需要将oldstrand和newstrand区分开来。,原核生物利用甲基化区分oldstrand和newstrand，因此原核细胞中的错配修复也称甲基化指导的错配修复（methyl-directedmismatchrepair）。原核细胞DNA的甲基化位点位于5GATC序列中腺嘌呤碱基的6位N原子上，催化甲基化的酶为Dam甲基化酶（Dammethylase），刚合成的DNA新链上的GATC序列还没有来得及甲基化，而作为模板的oldstrand早已被甲基化了，利用这种差别区分oldstrand和newstrand。,一旦发现错配碱基，即将未甲基化的链切除，并以甲基化的链为模板进行修复合成。,错配修复是一个非常耗能的过程。错配的碱基距离GATC序列越远，被切除的核苷酸就越多，重新合成新链所需要消耗的脱氧核苷三磷酸单体就越多。无论消耗多少dNTPs，目的都是为了修复一个错配的碱基，这说明机体为了维护遗传物质的稳定性可以说不惜一切代价。,错配修复机制是建立在DNA出现的甲基化的基础上，在复制过程中，含有所需要甲基化的碱基的亲代链充分甲基化。由于DNA甲基化滞后于DNA的合成，新的子代DNA链在合成的大部分时期里，保持着非甲基化。错配修复系统具有既能识别非甲基化序列又能识别新合成的子代链中的错配碱基对的能力。被识别的非甲基化序列就作为修复的目标链。修复过程包括切除一段含有错配碱基的非甲基化序列，然后重新合成一段正确的碱基序列来替换被切除的碱基序列。,4、重组修复有时在进行DNA修复之前，受损环的DNA链常常还能进行复制。在这种情况下，受损亲代链的复制受损坏碱基的干扰，跨过这段损坏序列后，此时在新的一个起点继续开始复制，此时新合成的子代链的碱基序列就有了一个缺口。这种缺口可以通过重组修复机制纠正。过程：从同源DNA的母链上将相应核苷酸序列片段以至子链缺口处，然后用再合成的序列来补上母链的空缺。在重组修复过程中，DNA链的损伤部位可能被切除，也可能未被切除。,DNA的重组修复,胸腺嘧啶二聚体,复制,核酸酶及重组蛋白,修复复制,DNA聚合酶,DNA连接酶,重组,5、应急反应（SOS）和易错修复SOS反应是细胞DNA受到损伤或复制受到抑制的紧急情况下，为求得生存而出现的应急效应。DNA聚合酶具有35核酸外切酶活性而表现出校对功能，它在DNA损伤部位进行复制时，由于新合成链的核苷酸不能和模板链的碱基配对而被切除，再次引入的核苷酸如还不能配对仍将被切除，这样DNA聚合酶就会在原地打转而不前进，或是脱落下来使DNA链的合成终止。这时，SOS基因表达的产物都是与DNA修复有关的酶类，使这些酶在细胞内的含量升高，这些基因称为DNA紧急修复基因。,SOS反应的机制,未诱导的细胞,靶基因,lexA基因被LexA蛋白质部分阻遏,recA基因被LexA蛋白质部分阻遏,（40个不同的位点被阻遏）,LexA(阻遏物),RecA(辅蛋白酶),易错修复：在SOS修复中，可以诱导产生校对功能低的DNA聚合酶和，合成的新的DNA链是不忠实的，有许多不配对的碱基，而复制仍可进行。往往导致突变的产生，但对细胞来说，比