寡核苷酸图谱分析.doc

寡核苷酸图谱分析 寡核苷酸图谱分析是指核酸或核酸片段经T1核酸酶切割后电泳，少数较大分子量的酶切核酸片段在聚丙烯酰胺凝胶上分布特点的比较。因为它是通过少数核酸片段来了解整个核酸的特征，如同根据指纹特点判断案情一样，因此又称为指纹图分析(Analysis of fingerprint map)。该法最大优点为比较简便，敏感性高，能显示出核酸间细小的差别，但缺点是无法对差别大的两条来源不同的核酸进行比较。目前该种方法已在病毒学研究中得到了广泛的应用，特别是对RNA病毒分类、鉴定病毒遗传变异等，在流行病学调查中具有重要意义。 (一) 原理提纯后的病毒核酸，通过适当的酶切，可产生大小不同的片段，经放射性同位素标记(或在病毒培养时标记)后，进行垂直双相电泳，再经放射自显影，可得到特征性的图谱，即寡核苷酸指纹图谱。所用的酶一般是T1核糖核酸酶，这种酶是一种RNA限制酶，特异性地作用于鸟嘌呤核苷酸的3磷酸基团，切割与其邻近核苷酸相连的5磷酯键，最终产物为带 3磷酸鸟嘌呤末端的寡核苷酸，即每断片的3末端为鸟嘌呤并带有磷酸，而5末端就暴露出羟基团。然后在T4多核苷酸激酶的作用下，用32PATP标记寡核苷酸的5末端，最后用饱和酚和酵母RNA混合液终止激酶的作用。在pH3.5条件下，从上到下进行第一相电泳，依片段所带电荷的不同将其分开，其后在pH8.2条件下，从右到左进行第二相电泳，可根据片段长短的不同将其分开，通过自显影，便可在底片上看到片段的位置和数目，借此对不同的病毒株的核酸进行分析比较。 在电泳中一般采用两种指示剂：一种为溴酚蓝(BPB)，它的大小相当于8-10个核苷酸，在pH3.5时呈绿色，在pH8.2时呈蓝色；另一种为联苯胺(Xylene Cyanol，简称XC)，其大小相当于25个核苷酸，在pH3.5时为蓝色，pH8.2时为绿色，它周围的点为重点观察区。由于 12-14个碱基以上的核苷酸片段特异性高，太短的片段特异性低，因此，图谱上部的斑点由于片段较小难以进行分析，多取图谱下端或整个图的下1/3处斑点进行比较，一般取50-70个斑点。 (二) 基本方法 1.病毒的增殖与核酸的提纯用适当的组织培养细胞繁殖病毒，有些病毒也可用鸡胚进行繁殖，以饱和酚法提纯病毒核酸。 2.核糖核酸酶切和同位素标记常用的酶是T1核糖核酸酶(故该技术又称为T1寡核苷酸指纹图谱)，将该酶与病毒 RNA以一定比例混合，置37消化30-40分钟。经消化后的核酸变为大小不等的片段，片段的大小与鸟苷酸的含量有关。消化步骤为：于Eppendorf管中加入1?l去离子水，加1?g病毒RNA，加1?l 2倍浓缩的消化缓冲液( 40m mol/L pH7.5 Tris-HCl，2m mol/L EDTA )，置沸水中煮60-90秒，快速置冰浴中冷却，加入2?l T1酶(5IU/?l)，混合后置37水浴30-40分钟。 标记的方法有两种：一是内标记，即在病毒培养液中加入32P正磷酸盐或32PATP，使增殖的病毒中带有32P。另一种方法是外标记(又称末端标记)，在经过消化后的核酸片段中加入32P-ATP和T4多核苷酸激酶，以标记片段5端。外标记方法为：于上述酶消化溶液中加入35?l激酶缓冲液(10m mol/ LTrisHCl，10m mol/ L Mg(OAC)2，1m mol/L DTT)，1?l T4多核苷酸激酶，10?l32P-ATP(比活性5000Ci/m mol)，混合后置37水浴30分钟。 3.反应终止及寡核苷酸的提取于上述反应物中加入100?l TSE饱和酚，混合，再加入中止混合物(用0.6mol/L醋酸氨配成2mg/ml的酵母RNA)终止激酶作用。 pH7.8的TSE缓冲液： Tris 2.42g 最终浓度0.02mol/L NaCl 8.77g 最终浓度0.15mol/L EDTA(Na2) 0.74g 最终浓度0.002mol/L 用1N HCl(约12ml)调pH至7.8，补无离子水至1 000ml，高压消毒。 将上述终止后的溶液，轻摇混合后，11 000r/min离心3分钟，取上层水相，加入2.5倍冷无水乙醇，混合置-20过夜或-7030分钟，用12 000r/min离心15分钟，弃上清，干燥沉淀物(即核酸)。 4.电泳及自显影 指示染料的配制：以10ml为例 溴酚兰 10mg 终浓度：0.1 联苯胺 10mg 0.1 尿 素 3.6g 6mol/L 蔗 糖 1g 10(W/V) EDTA 2mg 50m mol/L 酵母RNA 100mg 10mg/ml 加无离子水至10ml (1) 第相电泳将玻璃板(2039cm)及梳子清洗干净，用10丙烯酰胺，0.325甲叉双丙烯酰胺注胶，电泳缓冲液为25mmol/L柠檬酸，6mol/L尿素，pH3.5。待凝胶凝聚后，进行垂直式电泳，方向为从上到下，在4预电泳30-60分钟后，将制备好的干燥核酸片段加20?l指示染料溶解混匀点样，电泳至溴酚蓝泳动20cm时停止电泳。此时可取下凝胶的一块玻璃板，用玻璃纸将胶包住、胶面朝上，于暗室中将X光底片放在胶面的玻璃纸上，在 X光底片上放一块比底片稍大的增强板，将另一块玻璃擦洗干净盖在增强板上，用黑纸包好以免透光，置4自显影1-2小时，然后于暗室取出底片冲洗，冲洗后底片上应见到从小到大的糖葫芦状黑点。 (2) 第相电泳将相的底片，根据所作记号与相凝胶对齐，沿着点的两边切出约 1cm宽的长条，长条长约20cm(从指示剂XC上端8cm，至下端12cm)，切下的胶条放在准备好的玻璃板上，摆直放平，用滤纸将胶条残余水吸干，摆好间条，放上另一准备好的玻璃板，固定两层玻板后即可灌胶。凝胶浓度为21.8丙烯酰胺，0.8甲叉双丙烯酰胺，电泳缓冲液为0.1mol/L Tris硼酸，2.5mmol/L EDTA，pH8.3。凝胶聚合后直接在室温下进行电泳，泳动方向为由相胶条端向另一端泳动，当溴酚蓝运行20cm时，停止电泳。取下凝胶进行自显影，方法与第相显影相同，显影时间取决于同位素强度和实验目的。最好使用分辨率较高的核子乳胶片。 (三) 结果分析在相胶自显影前先观察XC和BPB两个指示剂的距离(应与相胶条中一样)。如距离太小，有的点可能重叠，增长了，有的点可能从胶两旁跑掉。XC标记周围约5070个点为重点比较区，而BPB周围点一般仅作参考。为证实某一或某数点是否是某毒株核酸独有的，须进行混合电泳。即将两个毒株的32PATP标记核酸等量混合，与非混合样品同时进行电泳，进行比较，如某一点为两毒株共有的，就在相应位置上出现一个点，否则出现两个点。 两个或两个以上毒株比较时，常以其中一株为标准株，其余的为比较株。凡标准株寡核苷酸图中出现的点，而其他毒株没有，表示片段丢失；凡标准株没有的点，而其他毒株出现了，表示片段增加。最后统计出共增加了多少点，丢失了多少点。因此根据两个毒株的图谱中点的相似情况以及斑点消失和增加数目，可推测两毒株核酸的同源性。从理论上讲，点丢失的最高数与增加数是对等的，即大片段点增加是由小片段点改变而来。将丢失和增加点数相加除以2，乘以系数1.5(根据统计学假定，这种成对改变50是由于单一点改变而来，50可能是各自突变而来)，加上不成对的点数即成对后剩下的数，用以表示毒株的大致关系，如一个毒株与另一毒株相比时，丢失6个点，增加了4个点，那么它们之间鸟嘌呤碱基改变的最少数应为，41.528。 (四) 应用形态学和血清学的方法可用于鉴定病毒的血清型，在某些情况下可鉴定病毒亚型，但不能区别同一血清型或亚型的不同病毒株和分离物，而寡核苷酸指纹图谱技术可以进一步区别它们，这对在自然条件下容易变异的病毒是很有价值的。 Kusters，J.G.等对12株分离自荷兰的传染性支气管炎病毒进行寡核苷酸指纹图谱分析，结果将它们分为两组，并提出第一组中的3个分离株V1259 、V1385 、V1397是疫苗株H52和H120的突变株。70年代后期分离的6株在血清型上和基因型上都与疫苗株(H52和H120 )无关，说明是自然突变株。Clewley等对分离的13株传染性支气管炎病毒进行研究，泳出了11种不同的寡核苷酸指纹图谱。不同血清型的毒株，图谱明显不同，而同一血清型的不同毒株，指纹图谱也有差异，并发现某些分离物是疫苗株的突变种。Karaca等对3株分离自肠道的传染性支气管炎病毒进行研究后认为，尽管这3株毒株是从3个不同鸡群分离出的，但它们的寡核苷酸指纹图谱却几乎相同，且与Conn46株的指纹图谱很相似，故此认为这3株病毒是由Connecticut毒株的基因突变而来的，并且推测是决定血清型的S1蛋白基因突变所致。Hori等用该技术分析了19351984年从日本和泰国分离的12株日本脑炎病毒的核酸基因组。结果表明，所有的日本毒株都有某些共同的斑点，并且在相近的年份分离的毒株相似率更高。在同一年份、同一地区分离的毒株则极为相似。并发现在这两个地理位置上相隔较远的国家，日本脑炎病毒经历了各自不同的基因突变和选择过程。Rekik等对8株分离的禽呼肠孤病毒和1株S1133疫苗株进行寡核苷酸指纹图谱分析，结果表明，分离株之间基因组同源性较强，其中5株与疫苗株的图谱非常相似，但可以明显地区别开。从而可检查出自然界呼肠孤病毒基因组的变异情况和监测其进化程度。郭元吉等从我国猪群中分离到1株丙型流感病毒，用寡核苷酸指纹图谱分析证明，该株病毒可能是在我国猪群中存在的一种新的丙型流感病毒