糖基转移酶和糖苷酶讲义.pdf

TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 第八章第八章 糖基转移酶和糖苷酶糖基转移酶和糖苷酶 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 第一节第一节 糖基转移酶糖基转移酶 ( (Glycosyltransferases) 糖基转移酶是一系列参与催化双糖、聚糖糖基转移酶是一系列参与催化双糖、聚糖 和糖复合物中糖链合成的一类酶。和糖复合物中糖链合成的一类酶。 负责将活性供体负责将活性供体( (通常是通常是NDPNDP- -糖糖) )的单糖转的单糖转 移到糖、蛋白质、脂类、核酸分子上，完移到糖、蛋白质、脂类、核酸分子上，完 成糖基化反应。成糖基化反应。 目前发现的糖基转移酶有目前发现的糖基转移酶有100100多种，其主要多种，其主要 分布在内质网和高尔基体。分布在内质网和高尔基体。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 一、糖基转移酶的命名与分类一、糖基转移酶的命名与分类 糖基转移酶的传统分类方法是根据其所转糖基转移酶的传统分类方法是根据其所转 移的单糖类型进行分类的。移的单糖类型进行分类的。 如半乳糖转移酶，唾液酸转移酶等。如半乳糖转移酶，唾液酸转移酶等。 另外一种方法是根据序列的同源性、底物另外一种方法是根据序列的同源性、底物/ / 产物立体化学异构性以及供体糖进行分类。产物立体化学异构性以及供体糖进行分类。 这种分类法糖基转移酶被分为这种分类法糖基转移酶被分为6666个家族及个家族及 一个未分类族。一个未分类族。 所有家族只采用两种折叠方式，形成了两所有家族只采用两种折叠方式，形成了两 个超家族，分别为个超家族，分别为GT-A和和GT-B超家族。超家族。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 糖基转移酶的命名糖基转移酶的命名 GlcNAc T-I的全称为：的全称为： UDP-N-乙酰葡糖胺乙酰葡糖胺: : -3-甘露糖基甘露糖基 - 1,2N-乙酰葡糖胺转移酶。乙酰葡糖胺转移酶。 GlcNAc T-II的全称为：的全称为： UDP-N-乙酰乙酰葡糖胺葡糖胺: : -6-甘露甘露糖基糖基 - 1,2N-乙酰葡糖胺转移酶。乙酰葡糖胺转移酶。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY -1,4-Galactosyltransferase Family TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY Fucosyltransferase Family TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY All members of the sialyltransferase genes cloned TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY The Evolutionary History of Glycosyltransferase Genes 后生动物后生动物 后口动物后口动物 脊椎动物脊椎动物 哺乳动物哺乳动物 原始昆虫原始昆虫 无脊椎动物无脊椎动物 非哺乳动物非哺乳动物 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 二、糖基转移酶特性二、糖基转移酶特性 一个基一个基因因 一种转移一种转移酶酶 一种连接键一种连接键 糖链的合成不是由基因编码合成的，而是由基因编糖链的合成不是由基因编码合成的，而是由基因编 码的糖基转移酶通过糖基化作用，将糖基由其供体码的糖基转移酶通过糖基化作用，将糖基由其供体 转移到受体上完成的。转移到受体上完成的。 每个糖基转移酶都有自己特异供体、受体和联接键，每个糖基转移酶都有自己特异供体、受体和联接键， 这就保证了在没有模板的情况下合成特异性的糖。这就保证了在没有模板的情况下合成特异性的糖。 糖链可以认为是基因的次级产物糖链可以认为是基因的次级产物, , 一个基因编码一一个基因编码一 个糖基转移酶个糖基转移酶, , 一个糖基转移酶专一地催化一个糖一个糖基转移酶专一地催化一个糖 苷键的合成，一条糖链的合成就需要一个多酶系统苷键的合成，一条糖链的合成就需要一个多酶系统, , 也就对应了一个基因组。也就对应了一个基因组。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 糖基转移酶特性糖基转移酶特性 糖基转移酶绝大部分是糖基转移酶绝大部分是II型膜结合蛋白，即型膜结合蛋白，即 较短的较短的N-端在胞浆，有一穿膜部分通过内端在胞浆，有一穿膜部分通过内 质网或高尔基体膜，长的质网或高尔基体膜，长的C-端在内质网或端在内质网或 高尔基体的管腔内。高尔基体的管腔内。 有少数糖基转移酶是有少数糖基转移酶是I型膜结合蛋白，其较型膜结合蛋白，其较 短的短的N-端在内质网腔，而很长的端在内质网腔，而很长的C-端则定端则定 位于胞浆。位于胞浆。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY Biological Functions of a Soluble Form of N-acetylglucosaminyltransferase V (GnT-V) TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY Regulation of High Branching in N-linked Oligosaccharides TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 大鼠不同组织中三种大鼠不同组织中三种-乙酰葡糖胺基转移酶乙酰葡糖胺基转移酶( (GlcNAc T) ) 组织组织 活力活力(pmolmg蛋白蛋白h) GlcNAc T-II GlcNAc T-IV GlcNAc T-V 肾肾 1840 330 1.9 1.6 30 6 脑脑 660 48 8.7 0.7 38 1 胃胃 500 150 8.2 0.7 25 1 小肠小肠 280 99 17 1.5 68 11 肺肺 104 4.6 2.6 0.7 38 4 脾脾 100 2.5 20 8 21 2 睾丸睾丸 52 2.9 8.2 0.8 37 4 心心 11 1.1 9.4 1.4 10 1 肝肝 81 0.9 2.8 0.7 8.2 0.8 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 三、糖基转移酶的结构域三、糖基转移酶的结构域 属于属于II-型膜结合蛋白的糖基转移酶分成四型膜结合蛋白的糖基转移酶分成四 个结构域。个结构域。 氨基端的胞浆域，氨基端的胞浆域，一般少于一般少于2525个个( (最少最少4 4个个) ) 氨基酸，含正电荷的碱基氨基酸较多；氨基酸，含正电荷的碱基氨基酸较多； 穿膜域，穿膜域，有少量氨基酸残基，富含疏水氨有少量氨基酸残基，富含疏水氨 基酸；基酸； 颈区域，颈区域，位于内质网或高尔基体管腔内，位于内质网或高尔基体管腔内， 含甘氨酸和脯氨酸残基，有的带有含甘氨酸和脯氨酸残基，有的带有N-糖链。糖链。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 糖基转移酶的结构域糖基转移酶的结构域 催化域，催化域，为管腔中的最大结构域，呈球状，为管腔中的最大结构域，呈球状， 约含约含310310- -430430个个( (最长可达最长可达720720个左右个左右) )氨基氨基 酸残基，为糖基转移酶最重要的催化区域。酸残基，为糖基转移酶最重要的催化区域。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 克隆的哺乳动物糖基转移酶的结构域克隆的哺乳动物糖基转移酶的结构域 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 四、糖基转移酶的催化特性与功能四、糖基转移酶的催化特性与功能 (1)(1)底物专一性底物专一性 糖复合物中糖基的顺序和连接键是由糖基糖复合物中糖基的顺序和连接键是由糖基 转移酶的底物专一性和催化特性来决定的。转移酶的底物专一性和催化特性来决定的。 对对底物专一底物专一性，性，一个酶的产物常作为下一一个酶的产物常作为下一 个酶的底物，这样就保证了糖链中糖基的个酶的底物，这样就保证了糖链中糖基的 特定顺序。特定顺序。 因合成的产物结构不同或合成的部位不同，因合成的产物结构不同或合成的部位不同， 所用的供体和受体也不同。所用的供体和受体也不同。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 糖基转移酶的催化特性糖基转移酶的催化特性 合成糖原时，葡萄糖的供体是合成糖原时，葡萄糖的供体是UDP-Glc，合合 成淀粉时，则是成淀粉时，则是ADP-Glc，合成纤维素时是合成纤维素时是 GDP-Glc。 对受体的专一性对受体的专一性，在糖蛋白的在糖蛋白的N-糖苷糖苷键连键连 接的糖链的外周有接的糖链的外周有6 6种不同的方式连接的种不同的方式连接的N- 乙乙酰酰葡葡糖胺糖胺( (GIcNAc),GIcNAc),它们连接在不同甘露它们连接在不同甘露 糖基糖基( (Man)Man)的不同的不同糖糖基上基上，分别有分别有6 6个不同个不同 的的糖糖基转移酶负责基转移酶负责它它们的转移们的转移，每个酶又每个酶又 对应不同的受体对应不同的受体 。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 不同的糖基转移酶所催化的糖基转移反应不同不同的糖基转移酶所催化的糖基转移反应不同 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 人人B B血型的血型的 1-3半乳糖基转移酶对受体底物的专一性半乳糖基转移酶对受体底物的专一性 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 糖基转移酶的催化特性糖基转移酶的催化特性 唾液酸化唾液酸化Lewis X四糖抗原合成时，一四糖抗原合成时，一 般先生成唾液酸化的般先生成唾液酸化的N-乙酰乳糖胺，乙酰乳糖胺， 再由再由 -1,3Fuc T在在G1cNAc上加入上加入Fuc， 而不能先合成岩藻糖化的而不能先合成岩藻糖化的N-乙酰乳糖乙酰乳糖 胺后再加上胺后再加上NeuAc。因。因 -2,3 NeuAc T 不能以不能以 -1,3岩藻糖化糖链为底物。岩藻糖化糖链为底物。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 糖基转移酶的催化特性糖基转移酶的催化特性 糖基转移酶也可作用于人工底物，如参与糖基转移酶也可作用于人工底物，如参与 糖蛋白糖链合成的糖基转移酶也可利已除糖蛋白糖链合成的糖基转移酶也可利已除 去蛋白质而还原末端标记去蛋白质而还原末端标记( (荧光和放射性核荧光和放射性核 素素) )的底物。的底物。 不少糖基转移酶对底物的识别实际上只涉不少糖基转移酶对底物的识别实际上只涉 及受体底物中接受糖基邻近的少数糖基，及受体底物中接受糖基邻近的少数糖基， 故一些人工合成的寡糖衍生物也可作为这故一些人工合成的寡糖衍生物也可作为这 些酶的底物。些酶的底物。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 糖基转移酶的催化特性糖基转移酶的催化特性 (2)(2)二价金属离子的需求二价金属离子的需求 大多数的糖基转移酶都需二价金属离子作大多数的糖基转移酶都需二价金属离子作 为辅助因子，缺乏二价金属离子时为辅助因子，缺乏二价金属离子时( (如在如在 EDTA存在下存在下) )酶活力很低或丧失。酶活力很低或丧失。 二价金属离子中二价金属离子中Mn2+的激活作用最强，其的激活作用最强，其 次是次是Co2+,Mg2+,Ni 2+。 糖基转移酶糖基转移酶 T- -V不需要二价金属离子。不需要二价金属离子。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 五、糖基转移酶同源性和抗原性五、糖基转移酶同源性和抗原性 糖基转移酶在结构上的最大特点是不糖基转移酶在结构上的最大特点是不 同糖基转移酶一级结构之间的同源性同糖基转移酶一级结构之间的同源性 很少，即使转移相同糖基的糖基转移很少，即使转移相同糖基的糖基转移 酶也很少有同源性。酶也很少有同源性。 血型血型A抗原的抗原的GalNAc T和血型和血型B抗原抗原 的的Gal T同源性达同源性达9999，在，在353353个氨基个氨基 酸残基中只有酸残基中只有4 4个不同。个不同。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 糖基转移酶同源性和抗原性糖基转移酶同源性和抗原性 不同种属中同一糖基转移酶的同源性不同种属中同一糖基转移酶的同源性 极大，其催化结构域的同源性一般均极大，其催化结构域的同源性一般均 在在8080以上。以上。 如人、小鼠和兔中如人、小鼠和兔中 -1,2GlcNAc T-I四四 个结构域的同源性分别为个结构域的同源性分别为100%100%、90%90%、 80%80%和和95%95%。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 六、糖基转移酶和疾病六、糖基转移酶和疾病 -1,3 T的活性在人体内的重现会引发自身的活性在人体内的重现会引发自身 免疫反应。相反，如果人体内免疫反应。相反，如果人体内 -1,4半乳糖半乳糖 基转移酶的活性下降，致使正常的免疫球基转移酶的活性下降，致使正常的免疫球 蛋白蛋白G (IgG)分子中的糖链半乳糖含量降低。分子中的糖链半乳糖含量降低。 它能诱导抗体产生，从而也会出现自身免它能诱导抗体产生，从而也会出现自身免 疫，其症状是类风湿。疫，其症状是类风湿。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 糖基转移酶和疾病糖基转移酶和疾病 细胞癌变过程中常伴有糖链结构改变细胞癌变过程中常伴有糖链结构改变，如如 糖链分支末端出现重复糖链分支末端出现重复N-乙酰半乳糖胺结乙酰半乳糖胺结 构、唾液酸和岩藻糖含量增加，这些变化构、唾液酸和岩藻糖含量增加，这些变化 在临床上常用作肿瘤标记物。在临床上常用作肿瘤标记物。 糖基转移酶就是通过影响糖链的改变糖基转移酶就是通过影响糖链的改变，而而 间接关系到癌瘤发生和发展。间接关系到癌瘤发生和发展。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 糖基转移酶和疾病糖基转移酶和疾病 糖基转移酶的表达和细胞周期密切相关。糖基转移酶的表达和细胞周期密切相关。 在细胞分化阶段在细胞分化阶段，如果糖基转移酶在成熟如果糖基转移酶在成熟 细胞中活性很高细胞中活性很高，就会产生癌变就会产生癌变，同时出同时出 现早期的分化抗原。现早期的分化抗原。 多聚多聚N-乙酰半乳糖胺链的出现被看成是肿乙酰半乳糖胺链的出现被看成是肿 瘤的重要标志。瘤的重要标志。 这些糖链可以减低细胞与基质间的粘着，这些糖链可以减低细胞与基质间的粘着， 有利于癌细胞的进一步侵入。有利于癌细胞的进一步侵入。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 糖基转移酶和疾病糖基转移酶和疾病 与肝癌发生有关的糖基转移酶与肝癌发生有关的糖基转移酶 糖基转移酶在肝癌中活性有明显改变，如糖基转移酶在肝癌中活性有明显改变，如 GnT-、GnT-和和 -1, 6岩藻糖基转移酶。岩藻糖基转移酶。 GnT-和和GnT-能将一个能将一个N-乙酰葡糖胺转乙酰葡糖胺转 移至移至N-糖链五糖核心糖链五糖核心1, 3和和1, 6臂甘露糖上臂甘露糖上, 分别形成分别形成 -1,4和和1,6键，使键，使N-糖链天线数增糖链天线数增 多，多， -1, 6 FucT则将岩藻糖转移至糖链最内则将岩藻糖转移至糖链最内 侧侧( (与天冬酰胺相邻与天冬酰胺相邻) )的的N-乙酰葡糖胺上形乙酰葡糖胺上形 成核心岩藻糖。成核心岩藻糖。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 糖基转移酶和疾病糖基转移酶和疾病 这些结构异常的糖链出现在肿瘤细胞的糖这些结构异常的糖链出现在肿瘤细胞的糖 蛋白上蛋白上，使肿瘤细胞表面性质变化使肿瘤细胞表面性质变化，导致导致 细胞粘附、侵袭和迁移能力改变细胞粘附、侵袭和迁移能力改变，是造成是造成 肿瘤细胞具有侵袭性和转移能力的一个重肿瘤细胞具有侵袭性和转移能力的一个重 要原因。要原因。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 七、糖基转移酶的应用七、糖基转移酶的应用 糖基转移酶在肝癌研究中的应用糖基转移酶在肝癌研究中的应用 恶性肿瘤中糖基转移酶表达及活性改变所恶性肿瘤中糖基转移酶表达及活性改变所 致肿瘤细胞表面糖链结构的变化在肿瘤的致肿瘤细胞表面糖链结构的变化在肿瘤的 诊断、诊断、预防预防方面有重要意义方面有重要意义。 将糖基转移酶基因转染入肝癌细胞将糖基转移酶基因转染入肝癌细胞，过表过表 达的糖基转移酶使细胞内某些蛋白发生糖达的糖基转移酶使细胞内某些蛋白发生糖 基化基化, ,产生不同糖型产生不同糖型，通过双向电泳和凝集通过双向电泳和凝集 素免疫印迹相结合素免疫印迹相结合，比较转染组和非转染比较转染组和非转染 组糖蛋白改变组糖蛋白改变，从而确定蛋白质和糖基化从而确定蛋白质和糖基化 的功能关系的功能关系, ,研究研究为糖基化改变在肝癌发生为糖基化改变在肝癌发生 中的作用研究奠定了基础。中的作用研究奠定了基础。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 糖基转移酶的应用糖基转移酶的应用 采用同样技术路线研究与乳腺癌转移相关采用同样技术路线研究与乳腺癌转移相关 的糖基化改变的糖基化改变，并从结构上描述糖链并从结构上描述糖链，旨旨 在将其作为乳腺癌和其他实体肿瘤诊断工在将其作为乳腺癌和其他实体肿瘤诊断工 具和免疫治疗靶点具和免疫治疗靶点。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 糖基转移酶在糖基转移酶在糖糖类合成中的应用类合成中的应用 糖类药物在治疗炎症、用作肿瘤疫苗和抗糖类药物在治疗炎症、用作肿瘤疫苗和抗 病毒等方面都有其独特的功效。病毒等方面都有其独特的功效。 现在普遍使用的糖类合成方法有两种现在普遍使用的糖类合成方法有两种： 化学合成和酶促合成化学合成和酶促合成 化学合成近年来取得一些进展化学合成近年来取得一些进展，提出了一种提出了一种 全自动寡全自动寡糖糖合成法合成法，但在天然复合产物中以但在天然复合产物中以 一种糖代替另一种糖仍然困难。一种糖代替另一种糖仍然困难。 酶促合成酶促合成的的产量高、产物产量高、产物具有具有特异立体化学特异立体化学 异构性。异构性。 糖基转移酶的应用糖基转移酶的应用 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 糖基转移酶的应用糖基转移酶的应用 糖基转移酶可作为研究糖复合物工具糖基转移酶可作为研究糖复合物工具 如研究糖蛋白糖链的结构与功能的关系以如研究糖蛋白糖链的结构与功能的关系以 及细胞表面糖基化修饰等。及细胞表面糖基化修饰等。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 八、八、O-GlcNAc 糖基转移酶在原核糖基转移酶在原核 和真核细胞中的表达和提纯和真核细胞中的表达和提纯 南通医学院生物化学教研室与美国纽约州立基础研南通医学院生物化学教研室与美国纽约州立基础研 究所神经生化系合作。究所神经生化系合作。 O-GlcNAc 糖基化修饰起到调节蛋白质的活性糖基化修饰起到调节蛋白质的活性，在在 生命过程的许多方面起作用生命过程的许多方面起作用( (如核运输如核运输，基因转录基因转录 及翻译过程及翻译过程) )。 OGT 基因敲除实验表明蛋白质基因敲除实验表明蛋白质O-GlcNAc 糖基化糖基化 修饰是胚胎干细胞存活和个体发育所必需的。修饰是胚胎干细胞存活和个体发育所必需的。 蛋白质的蛋白质的O-GlcNAc 糖基化修饰还调节蛋白质磷酸糖基化修饰还调节蛋白质磷酸 化，蛋白质的化，蛋白质的O-GlcNAc 糖基化与磷酸化修饰间存糖基化与磷酸化修饰间存 在相互竞争、相互补充的关系。在相互竞争、相互补充的关系。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 细胞质和细胞核内的蛋白质细胞质和细胞核内的蛋白质O-GlcNAc糖基糖基 化和去糖基化分别由化和去糖基化分别由O-GlcNAc糖基转移酶糖基转移酶 ( (OGT) )和和O-GlcNAc 糖苷酶催化。糖苷酶催化。 蛋白质的蛋白质的O-GlcNAc糖基化修饰及其生物学糖基化修饰及其生物学 意义目前成了蛋白质翻译后修饰领域最热意义目前成了蛋白质翻译后修饰领域最热 门的课题之一。门的课题之一。 其研究目的：其研究目的： 用原核和真核细胞表达用原核和真核细胞表达OGT，并用不同的并用不同的 方法从这两个系统提纯重组方法从这两个系统提纯重组OGT，获得制获得制 备有活性的备有活性的OGT，用于进行用于进行O-GlcNAc糖基糖基 酶功能方面的研究。酶功能方面的研究。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 研究结果研究结果 用大肠杆菌和用大肠杆菌和Hi5 昆虫细胞表达并纯化具有昆虫细胞表达并纯化具有 活性的重组活性的重组OGT。 携带人携带人OGTcDNA的的PET 32a 质粒在大肠杆质粒在大肠杆 菌中表达出带有菌中表达出带有1个个S-Tag 的重组人的重组人OGT 融融 合蛋白，然后用与合蛋白，然后用与S-蛋白质偶联的琼脂糖凝蛋白质偶联的琼脂糖凝 胶颗粒从细菌裂解液中亲和层析纯化得到胶颗粒从细菌裂解液中亲和层析纯化得到 OGT 融合蛋白。融合蛋白。 其纯化的其纯化的OGT在电泳中显现单一条带并具在电泳中显现单一条带并具 有生物活性有生物活性，但其活性在洗脱后丧失。但其活性在洗脱后丧失。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY IPTG 诱导重组诱导重组OGT 在在BL 21 大肠杆菌中的表达大肠杆菌中的表达 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 大肠杆菌中表达的重组大肠杆菌中表达的重组OGT 经经S-蛋白质凝胶纯化蛋白质凝胶纯化 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 研究结果研究结果 在在Hi5 昆虫细胞中表达的鼠肝昆虫细胞中表达的鼠肝OGT，经镍离子螯合经镍离子螯合 柱纯化后柱纯化后, 其比活性达到其比活性达到0.88 nmolmin-1mg-1OGT。 Hi5 细胞中表达的重组细胞中表达的重组OGT 的纯化的纯化 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 甜菊糖基转移酶基因的克隆及序列分析甜菊糖基转移酶基因的克隆及序列分析 利用与植物次生代谢产物糖基化相关的利用与植物次生代谢产物糖基化相关的 UDPG糖基转移酶的特征性保守区域糖基转移酶的特征性保守区域，设计设计 了同源引物了同源引物。 以甜菊基因组以甜菊基因组DNA 为模板，为模板，PCR 扩增获得扩增获得 甜菊糖基转移酶基因片段甜菊糖基转移酶基因片段。 根据获得的基因片段设计引物根据获得的基因片段设计引物GSTr 和和 GSTf ，分别与分别与cDNA文库的文库的T3 和和T7 通用通用 引物扩增获得全长核苷酸序列的甜菊糖基引物扩增获得全长核苷酸序列的甜菊糖基 转移酶基因。转移酶基因。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY The level of expression of plant glycosyltransferases TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY Transgenic pigs with GnT-III TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY Recombinant plant glycosyltransferases reported recently (20012004) TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 葡糖基转移酶多肽疫苗葡糖基转移酶多肽疫苗 HDS免疫大鼠的实验研究免疫大鼠的实验研究 葡糖基转移酶葡糖基转移酶是致是致龋龋菌的重要致病因素之一菌的重要致病因素之一， 具有利用具有利用蔗糖蔗糖合成细胞外葡聚合成细胞外葡聚糖糖的催化活性的催化活性 和和结合结合葡聚糖的活性葡聚糖的活性，在细菌附着和菌斑形在细菌附着和菌斑形 成的过程中起着重要作用成的过程中起着重要作用。 抑制抑制GTF活性活性，减少葡聚糖的产生是控制菌减少葡聚糖的产生是控制菌 震斑预防震斑预防龋龋病的重要手段之一病的重要手段之一。 目的：目的： 动物体内研究葡糖基转移酶多肽疫苗动物体内研究葡糖基转移酶多肽疫苗HDS 免疫原性和防龋效果。免疫原性和防龋效果。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 葡糖基转移酶多肽疫苗葡糖基转移酶多肽疫苗 HDS免疫大鼠的实验研究免疫大鼠的实验研究 方法：方法： 构建大鼠人工龋模型，分别用人工抗原构建大鼠人工龋模型，分别用人工抗原 HDS-KLH，多肽抗原多肽抗原HDS，葡糖基转移酶葡糖基转移酶 ( (GTF) )免疫大鼠，酶联免疫吸附法检测大免疫大鼠，酶联免疫吸附法检测大 鼠血清和唾液中抗鼠血清和唾液中抗HDS、GTF抗体；体视抗体；体视 显微镜下观察各组大鼠磨牙龋坏情况，并用显微镜下观察各组大鼠磨牙龋坏情况，并用 Keyes计分法计分。计分法计分。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 葡糖基转移酶多肽疫苗葡糖基转移酶多肽疫苗 HDS免疫大鼠的实验研究免疫大鼠的实验研究 结果：结果： HDS-KLH免疫组大鼠唾液、血清中抗免疫组大鼠唾液、血清中抗HDS IgG和和IgA 水平均高于对照组水平均高于对照组(P 0.05)； HDS-KLH，HDS，GTF免疫组大鼠龋免疫组大鼠龋 Keyes 计分均低于对照组计分均低于对照组( P 0101)，光滑光滑 面防龋效果最为显著。面防龋效果最为显著。 结论：结论： 人工抗原人工抗原 HDS-KLH 能刺激机体产生针对能刺激机体产生针对 GTF 的保护性免疫的保护性免疫，并减少实验大鼠龋齿并减少实验大鼠龋齿 发生。发生。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 葡糖基转移酶抗体的制备与研究葡糖基转移酶抗体的制备与研究 以葡糖基转移酶免疫产蛋母鸡。以葡糖基转移酶免疫产蛋母鸡。 应用酶联免疫吸附测定法测定鸡蛋黄中免疫应用酶联免疫吸附测定法测定鸡蛋黄中免疫 球蛋白的活性。球蛋白的活性。 经葡糖基转移酶免疫后可以得到高效价的蛋经葡糖基转移酶免疫后可以得到高效价的蛋 黄抗体，其抗远援链球菌的效价约为一般黄抗体，其抗远援链球菌的效价约为一般 IgY的的1616倍。倍。 体外模拟实验表明经远援链球菌免疫的蛋黄体外模拟实验表明经远援链球菌免疫的蛋黄 抗体确实有抗牙菌斑形成的能力，从而具备抗体确实有抗牙菌斑形成的能力，从而具备 防龋齿的功效。防龋齿的功效。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 第二节第二节 糖苷酶糖苷酶 糖糖苷苷酶酶( (G1ycosidase) )是一大类催化糖是一大类催化糖苷苷键键 水水解解的酶的酶类。类。 其主要分布在动物、植物、微生物体内，其主要分布在动物、植物、微生物体内， 担负着水解各种担负着水解各种糖糖苷苷、寡、寡糖糖、多、多糖糖、复杂、复杂 多糖以供机体多糖以供机体利利用的生物学功能用的生物学功能。 大多数糖苷酶水解典型大多数糖苷酶水解典型O-糖苷键糖苷键，也有部，也有部 分水解分水解N-糖苷键糖苷键，有一些糖苷酶水解，有一些糖苷酶水解S-糖苷糖苷 键键。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 一、一、糖苷酶的分类糖苷酶的分类 按照酶的作用方式和水解产物可把糖苷酶按照酶的作用方式和水解产物可把糖苷酶 分为两大类：分为两大类： 外切糖苷酶类（外切糖苷酶类（Exoglycosidases)： 它们的作用方式是从糖链的非还原端开始，它们的作用方式是从糖链的非还原端开始， 逐步将糖苷键切断，所得到的水解产物为逐步将糖苷键切断，所得到的水解产物为 单糖或双糖；单糖或双糖； 内切糖苷酶类（内切糖苷酶类（Endoglycosidases)： 它们从糖链的中间打断糖苷键，水解产物它们从糖链的中间打断糖苷键，水解产物 为分子量小于原来底物的寡糖。为分子量小于原来底物的寡糖。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY Exo-1-4-Beta-D-Glycanase TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 二、二、糖苷酶的分布糖苷酶的分布 糖苷酶在自然界有广泛分布，几乎所有动糖苷酶在自然界有广泛分布，几乎所有动 物、植物和微生物体内都能找到糖苷键。物、植物和微生物体内都能找到糖苷键。 在哺乳动物中，血清、血细胞、体液、各在哺乳动物中，血清、血细胞、体液、各 种组织器官中都有存在。种组织器官中都有存在。 许多软体动物也是糖苷酶的良好来源。许多软体动物也是糖苷酶的良好来源。 植物种子里有丰富的糖苷酶。植物种子里有丰富的糖苷酶。 一些细菌、酵母、霉菌的糖苷酶已有相当一些细菌、酵母、霉菌的糖苷酶已有相当 的研究报道。的研究报道。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 三、三、糖苷酶的命名糖苷酶的命名 糖苷酶的命名与它的底物专一性密切相关。糖苷酶的命名与它的底物专一性密切相关。 底物专一性包含：底物专一性包含： 糖基一侧的专一性；糖基一侧的专一性； 糖苷键的糖苷键的 - - - -异头专一性；异头专一性； 糖苷配基一侧的专一性。糖苷配基一侧的专一性。 糖苷酶的命名是根据糖基一侧的专一性和糖苷酶的命名是根据糖基一侧的专一性和 糖苷键的糖苷键的 - - - -异头专一性来命名的。异头专一性来命名的。 - -葡萄糖苷酶、葡萄糖苷酶、 - -葡萄糖苷酶、葡萄糖苷酶、 - -半乳糖半乳糖 苷酶、苷酶、 - -甘露甘露糖苷酶等。糖苷酶等。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY (1)(1)糖基一侧的专一性糖基一侧的专一性 (2)(2)糖苷键的糖苷键的 - - - -异头专一性异头专一性 (3)(3)糖基配基一侧的专一性糖基配基一侧的专一性 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 四、四、糖苷酶的生物学功能糖苷酶的生物学功能 (1)(1)分泌到细胞外的糖苷酶，参与营养物质的分泌到细胞外的糖苷酶，参与营养物质的 胞外消化吸收过程。胞外消化吸收过程。 (2)(2)细胞内的糖苷酶，如动物细胞内的溶酶体细胞内的糖苷酶，如动物细胞内的溶酶体 中有一系列糖苷酶，它们的功能是降解胞中有一系列糖苷酶，它们的功能是降解胞 内的糖复合物。内的糖复合物。 (3)(3)参与糖链的合成，如在糖蛋白生物合成过参与糖链的合成，如在糖蛋白生物合成过 程中，参加程中，参加N-型糖链的“剪枝”，型糖链的“剪枝”， “修剪”“修剪” 成较短分支成较短分支(Man3GlcNAc-Asn)结构，然后结构，然后 再由糖基转移酶加上新的糖基，形成不同再由糖基转移酶加上新的糖基，形成不同 结构的糖链。结构的糖链。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY Biological Roles of N-glycanase in Cells TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 五、一些常见的五、一些常见的糖苷酶糖苷酶 -D-甘露糖苷酶甘露糖苷酶 -D-甘露糖苷酶甘露糖苷酶 - D-木糖苷酶木糖苷酶 , -鼠李糖苷酶鼠李糖苷酶 -D-葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶 -D-葡萄糖苷酶：葡萄糖苷酶： 海藻糖酶、淀粉葡萄糖苷酶、葡聚糖蔗糖海藻糖酶、淀粉葡萄糖苷酶、葡聚糖蔗糖 酶、淀粉麦芽糖酶。酶、淀粉麦芽糖酶。 唾液酸酶唾液酸酶( (神经氨酸酶类神经氨酸酶类) )。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 一些常见的一些常见的糖苷酶糖苷酶 -D-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 -D-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 -D-N-乙酰半乳糖胺酶乙酰半乳糖胺酶 -D-N-乙酰己糖胺酶乙酰己糖胺酶 -D-N-乙酰葡糖胺酶乙酰葡糖胺酶 -D-N-乙酰半乳糖胺酶乙酰半乳糖胺酶 -D-岩澡塘苷酶岩澡塘苷酶 -L-岩澡塘苷酶岩澡塘苷酶 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 水解不同类型糖苷键的糖苷酶水解不同类型糖苷键的糖苷酶 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 六、六、糖苷酶的制备方法糖苷酶的制备方法 黄芪皂苷糖苷酶产生菌的筛选黄芪皂苷糖苷酶产生菌的筛选 将筛选用将筛选用菌株菌株Absida sp. A9r 、A84r 、 A9r 、A8r 、A38r 、Arr进行培养制备酶进行培养制备酶 液液 以黄芪总皂苷为底物进行诱导以黄芪总皂苷为底物进行诱导 薄薄 层层析法层层析法检测水解结果检测水解结果。 结果：结果：A bsida sp. A3r 菌所产酶液能较好菌所产酶液能较好 的水解黄芪总皂苷中糖基较多的皂苷的水解黄芪总皂苷中糖基较多的皂苷，进进 而生成糖基较少的皂苷。而生成糖基较少的皂苷。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 绿色木霉产生的外切绿色木霉产生的外切- -葡聚糖苷酶葡聚糖苷酶 从潮湿的树皮及腐烂的木块上采集样本从潮湿的树皮及腐烂的木块上采集样本 加适量的无菌水温和搅拌加适量的无菌水温和搅拌取取1 ml 悬浊液悬浊液, , 分别涂于含有滤纸的固体筛选培养基上分别涂于含有滤纸的固体筛选培养基上 待长出若干菌落后，对生长良好的菌种进待长出若干菌落后，对生长良好的菌种进 行分离行分离以以羧甲基纤维素钠为底物分别测羧甲基纤维素钠为底物分别测 定其所产酶活性。定其所产酶活性。 菌培养液菌培养液过滤过滤上清液上清液硫酸铵沉淀硫酸铵沉淀 Sephadex 柱层析柱层析DEAE2纤维素纤维素52 阴离阴离 子交换柱层析子交换柱层析收集洗脱纯酶液。收集洗脱纯酶液。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 一株神经节苷脂内切糖苷酶产生菌的分离一株神经节苷脂内切糖苷酶产生菌的分离 采用神经节苷脂选择性培养基，从土壤微采用神经节苷脂选择性培养基，从土壤微 生物中筛选得到一株产神经节苷脂内切糖生物中筛选得到一株产神经节苷脂内切糖 苷酶的菌株苷酶的菌株YW2112，该酶能特异性水解该酶能特异性水解 神经节苷脂中连接神经酰胺和寡糖链之间神经节苷脂中连接神经酰胺和寡糖链之间 的糖苷键，是研究神经节苷脂结构与功能的糖苷键，是研究神经节苷脂结构与功能 的重要工具酶。的重要工具酶。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 人参糖苷酶提取人参糖苷酶提取 目的目的： 用于对人参皂苷进行改造的糖苷酶。用于对人参皂苷进行改造的糖苷酶。 方法：方法： 从鲜人参根中提取人参皂苷酶从鲜人参根中提取人参皂苷酶，乙醇沉淀乙醇沉淀， 离子交换层析纯化离子交换层析纯化，凝胶电泳分析凝胶电泳分析，薄层薄层 色谱法测酶活力。色谱法测酶活力。 结果：结果： 经离子交换层析得到人参皂苷经离子交换层析得到人参皂苷 -葡糖苷酶。葡糖苷酶。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 七、七、糖苷酶的分离、纯化和测定糖苷酶的分离、纯化和测定 糖苷酶的分离纯化，在原则和技术方法上糖苷酶的分离纯化，在原则和技术方法上 和一般的蛋白质或酶的分离纯化没有区别。和一般的蛋白质或酶的分离纯化没有区别。 常用的方法：常用的方法： 盐析盐析( (硫酸铵沉淀硫酸铵沉淀) )、柱层析、柱层析( (离子交换、离子交换、 凝胶过滤、亲和层析、吸附凝胶过滤、亲和层析、吸附)， 电泳等。电泳等。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 一些糖苷酶的分离纯化方法一些糖苷酶的分离纯化方法 来来 源源 酶的名称酶的名称 方方 法法 刀豆粉刀豆粉 -甘露糖苷酶甘露糖苷酶 乙醇沉淀、凝胶过滤、离子交换乙醇沉淀、凝胶过滤、离子交换 -N-乙酰己糖胺酶乙酰己糖胺酶 柱层析柱层析 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 无花果无花果 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 丙酮沉淀、凝胶过滤、离子交换丙酮沉淀、凝胶过滤、离子交换 柱层析、等电聚胶柱层析、等电聚胶 产气夹膜梭菌产气夹膜梭菌 -N-乙酰葡糖胺酶乙酰葡糖胺酶 -N-乙酰半乳糖胺酶乙酰半乳糖胺酶 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 硫酸铵沉淀、凝胶过滤、离子交硫酸铵沉淀、凝胶过滤、离子交 换柱层析、制备电泳换柱层析、制备电泳 猪肾猪肾 -甘露糖苷酶甘露糖苷酶 硫酸铵沉淀、丙酮沉淀、热处理硫酸铵沉淀、丙酮沉淀、热处理 ( (60C，15分钟分钟) )、吸附、吸附柱层析、凝柱层析、凝 胶过滤、制备电泳胶过滤、制备电泳 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 亲和层析法分离纯化糖苷酶亲和层析法分离纯化糖苷酶 酶的名称酶的名称 所用的吸附剂所用的吸附剂 -N-乙酰己糖胺酶乙酰己糖胺酶 Sepharose-ConA(刀豆凝集素刀豆凝集素) -甘露糖苷酶甘露糖苷酶 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 葡萄糖醛酸苷酶葡萄糖醛酸苷酶 Sepharose- -氨基乙酰甘露糖胺氨基乙酰甘露糖胺 Sepharose-6-氨基乙基氨基乙基-1-硫硫- -D-吡喃半乳糖苷吡喃半乳糖苷 聚丙聚丙酰胺酰胺-对氨基苯基对氨基苯基-硫代硫代半乳糖苷半乳糖苷 琼脂糖琼脂糖- TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 糖苷酶活性测定糖苷酶活性测定 糖苷酶活性测定：糖苷酶活性测定： (1)(1)最常用的方法是以合成的对硝基苯酚糖苷化合物最常用的方法是以合成的对硝基苯酚糖苷化合物 作为底物，在酶作用下释放出的对硝基苯酚，在碱作为底物，在酶作用下释放出的对硝基苯酚，在碱 性条件下呈黄色，可用分光光度计法定量测定。性条件下呈黄色，可用分光光度计法定量测定。 (2)(2)把伞形酮类萤光化合物把伞形酮类萤光化合物(4(4- -Methyumbelliferone) )结结 合到神经氨酸的半缩醛羟基上，生成合到神经氨酸的半缩醛羟基上，生成4 4- -甲基伞形酮甲基伞形酮 基基N N- -乙酰神经氨酸苷，用做神经氨酸苷酸的底物。乙酰神经氨酸苷，用做神经氨酸苷酸的底物。 在酶作用下，释放出发萤光的在酶作用下，释放出发萤光的4 4- -甲基伞形酮，用甲基伞形酮，用 360360nmnm波长光作激发光，在波长光作激发光，在440440nmnm波长处测发射光，波长处测发射光， 可定量地测定释放的可定量地测定释放的4 4- -甲基伞形圈。甲基伞形圈。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 糖苷酶活性测定糖苷酶活性测定 (3)(3)需要以合成的或天然的双糖需要以合成的或天然的双糖、寡糖、糖肽寡糖、糖肽 甚至糖脂作为底物的方法。甚至糖脂作为底物的方法。 有两种情况：有两种情况： 一是测定糖苷酶作用下从非还原端释放的一是测定糖苷酶作用下从非还原端释放的 单糖。用双糖单糖。用双糖 - -O O- -2 2- -L L- -吡喃岩藻糖基吡喃岩藻糖基- -D- -半半 乳糖为底物。释放出来的岩藻糖，可以转乳糖为底物。释放出来的岩藻糖，可以转 变为三甲基硅醚衍生物，气相色谱上测定。变为三甲基硅醚衍生物，气相色谱上测定。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 糖苷酶活性测定糖苷酶活性测定 二是在酶作用下，非还原端的糖基释放后，二是在酶作用下，非还原端的糖基释放后， 测定其余下的部分。测定其余下的部分。 采用萤光化合物采用萤光化合物( ( - -氨基吡啶氨基吡啶, 5, 5- -二甲氨基二甲氨基 萘磺酰基等萘磺酰基等) )标记在底物糖链的还原末端，标记在底物糖链的还原末端， 结合使用高效液相色谱分离，用萤光分光结合使用高效液相色谱分离，用萤光分光 光度计检测酶活性。光度计检测酶活性。 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 八、八、糖苷酶的应用糖苷酶的应用 在糖链结构研究中的应用在糖链结构研究中的应用 作为工具酶的糖苷酶作为工具酶的糖苷酶 -D-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 -D-N-乙酰半乳糖胺酶乙酰半乳糖胺酶 -D-N-乙酰己糖胺酶乙酰己糖胺酶 -D-N-乙酰葡糖胺酶乙酰葡糖胺酶 -D-N-乙酰半乳糖胺酶乙酰半乳糖胺酶 -D-岩澡塘苷酶岩澡塘苷酶 -L-岩澡塘苷酶岩澡塘苷酶 TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY 1 1、作为工具酶的糖苷酶作为工具酶的糖苷酶 糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖等糖复合物在生糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖等糖复合物在生 物体内，尤其是在细胞表面携带着生物的物体内，尤其是在细胞表面携带着生物的 信息，在分子识别过程中起着重要作用。信息，在分子识别过程中起着重要作用。 研究其功能，首先要研究其结构。研究其功能，首先要研究其结构。 阐明一种糖复合物的糖链结构往往需要综阐明一种糖复合物的糖链结构往往需要综 合运用多种技术方法包括过碘酸氧化、甲合运用多种技术方法包括过碘酸氧化、甲 基化反应、红外光谱、核磁共振以及糖苷基化反应、红外光谱、核磁共振以及糖苷 酶作用等。酶作用等。 糖苷酶的使用在糖链结构研究主要体现在糖苷酶的使用在糖链结构研究主要体现在 以下几个方面：以下几个方面： TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY (1)(1)外切糖苷酶的作用特点和底物专一性外切糖苷酶的作用特点和底物专一性 通过糖苷酶水解，能切下非还原末端的一通过糖苷酶水解，能切下非还原末端的一 个单糖，同时提供关于糖基的组成、排列个单糖，同时提供关于糖基的组成、排列 顺序以及糖苷键的顺序以及糖苷键的 - -或或 - -异