植物组织培养实验基本步骤.doc

植物组织培养实验基本步骤一、母液的配置1、MS大量元素母液的配制 将大量元素配制成10倍的母液，使用时再稀释10倍。按照配方表中用量依次分别称取扩大10倍的：NH4NO3 8.250g 、KNO3 9.500g 、KH2PO4 0.850g 、 MgSO47H2O 1.850g 、CaCl22H2O 2.20g，所有药品称取完毕后用蒸馏水逐个溶解，待全部溶解后，最后定容至500ml，转入500ml细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名，置于4冰箱中保存备用。2、MS微量元素母液的配制 将微量元素配制成100倍的母液，使用时再稀释100倍。按照配方表中用量分别依次称取：MnSO4 4H2O 1.1150g 、ZnSO47H2O 0.4300g 、 H3BO3 0.3100g 、KI 0.0415g 、CuSO45H2O 0.00125g、 CoCl26H2O 0.00125g，用蒸馏水逐个溶解，待全部溶解后，用容量瓶定容至500ml，转入500ml细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名，置于4冰箱中保存备用。3、MS铁盐母液配制 将铁盐配制成100倍的母液，使用时再稀释100倍。按照配方表中用量分别称取扩大100倍的：称 FeSO47H2O 1.390g和Na2EDTA 1.865g，把FeSO47H2O和 Na2EDTA2H2O分别置于200ml蒸馏水中，加热并不断搅拌使之溶解（磁力搅拌器，边加热，边搅拌）。保持加热，把FeSO4溶液慢慢倒入Na2EDTA溶液中并不断搅拌，接近沸腾时停止加热，待溶液冷却后加蒸馏水到最终容积500ml，置于棕色细口瓶中，用力振荡12min，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名。在室温下避光保存一段时间令其充分反应后，再置于4冰箱中保存备用。4、MS有机化合物母液的配制 将有机化合物配制成100倍的母液，使用时再稀释100倍。按照配方表中用量分别称取扩大100倍的：肌醇 5.000g 、维生素B1 0.025g 、烟酸 0.025g 、甘氨酸 0.100g 、维生素B6 0.005g 、蔗糖 15.000g ，用蒸馏水依次溶解并定容至500ml后，转入500ml细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于4冰箱中保存备用。二、植物激素的配置常见激素：二氯苯氧乙酸（2，4D）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚3丁酸（IBA）、激动素（6-糠氨基嘌呤、 KT）、6苄氨基嘌呤（6BA）、赤霉素（GA3）、1、生长素类： （1）、生长素类在组织培养中的主要作用是：诱导细胞的分裂和根的分化，诱导愈伤组织（2）、常见生长素：二氯苯氧乙酸（2，4D）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚3丁酸（IBA）。NAA、IAA、IBA被广泛用于生根，2，4D有利于愈伤组织的诱导和生长。IAA容易光解，注意用棕色试剂瓶保存，保存时间不要太久。 （3）、溶解方法：称25mg吲哚乙酸（IAA），用少量1mol/L NaOH或95酒精预溶解，再加蒸馏水定容至25ml，摇匀。 （4）、保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存2、细胞分裂素 组织培养中，细胞分裂素主要促进细胞分裂和由愈伤组织上或器官上分化不定芽。细胞分裂素常常与生长素相互配合，用以调节细胞分裂，细胞伸长，细胞分化和器官形成。 （1）、常用的细胞分裂素有： 6苄氨基嘌呤（6BA）、激动素（6-糠氨基嘌呤、 KT）、玉米素（ZT）、噻二唑苯基脲（TDZ ） （2）、溶解方法：称25mg 6苄氨基嘌呤（6BA），用少量（1ml）1mol/L HCL预溶解，再加蒸馏水定容25ml，摇匀。（3）、保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存3、赤霉素（GA3） （1）、溶解方法：用少量95酒精预溶解，再加蒸馏水定容。 （2）、保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存 （3）、赤霉素易溶于水，但溶于水后不稳定，容易分解 （4）、灭菌：高温易分解，要过滤灭菌4、脱落酸 （1）、溶解：易溶于NaHCO3溶液、氯仿或丙酮。 （2）、保存：具有热稳定性，但容易发生光解。配成一定浓度后，冰箱冷藏保存三、培养基的制备与灭菌（一）、培养基的制备1、将所需的各种母液和植物激素按顺序放好，将洁净的各种玻璃器皿等放在指定位置。2、取烧杯一个内盛200ml蒸馏水，按照培养基配方所需量依次取母液加入烧杯，搅拌，按相应培养基称量蔗糖和琼脂，并添加到烧杯中，在电炉上加热待琼脂完全融化后加蒸馏水定容至所需体积。3、充分混合后，用1mol/LNaOH和1mol/LHCl调节培养基的pH为5.6-5.8（可将其调为6.0），趁热把培养基分装到广口瓶中，封好瓶口，待灭菌。（二）、培养基的灭菌灭菌温度及灭菌时间：121（1.06kg/cm2）下灭菌20分钟。（如是实验所用菌材灭菌，如无菌水及器械，则是121（1.06kg/cm2）下灭菌30分钟），此时可将需要灭菌的实验仪器一起灭菌。1、检查灭菌锅外层锅内水位，水量过少时应加水。把分装好的培养基放入灭菌锅的消毒桶内。2、盖上锅盖，注意按照说明操作并确定已盖好，设置好温度和时间参数，开启电源加热灭菌。3、灭菌时间到后，先切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，待灭菌锅压力表指针降到0时，打开排气阀，旋松螺栓，开启锅盖，取出已灭菌的培养基。4、在培养基凝固之前加入一定量的植物激素后密封瓶口，放置在水平桌面上自然冷却。四、无菌操作技术和接种1、接种前，用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，将培养基及接种用具放入超净工作台台面，打开超净工作台紫外灯及接种房间紫外灯，照射约30min，然后关闭紫外灯。打开房间换气扇及微开超净工作台的玻璃挡板，通风20min后，即可进行无菌操作。（此步由专人统一负责）2、接种室灭菌过程中同时对外植体进行表面灭菌。先将接种材料在流动的自来水下涮洗干净，吸干水份后切成大约70mm长的片段放进500ml烧杯中，用蒸馏水冲洗2次，倒掉蒸馏水后倒入0.1%的升汞水消毒，将材料淹没浸泡约10分钟（期间用镊子搅拌几次）。3、把在消毒液中的接种材料转移到超净工作台上。用无菌镊子将已完成灭菌的接种材料转移到烧杯中，用无菌水清洗3次，每次不少于1分钟，洗时不断摇动烧杯以确保完全除去消毒液。最后一次清洗后转移到无菌托碟上，将接种材料切成一定大小（花托0.5cm2、茎段0.5-1cm）。4、取下培养瓶的盖子用火烧灼瓶口。用镊子将外植体轻轻插入到琼脂上，立即盖上盖子。5、操作完后将镊子等器械浸入75%酒精中。操作器械需要在每次使用前消毒一次。方法是将浸于酒精中的器械取出后置于酒精灯火焰上充分灼烧，待冷却后方可使用。6、将培养瓶放到培养箱里，在要求温度下培养，观察记录五、所需实验仪器及额外药品电子分析天平、PH测试仪器、电磁炉、高压蒸汽灭菌锅、药匙、玻璃棒、胶头滴管