聚合物在生物高分子分离中的应用.ppt

聚合物在蛋白质分离中的应用,蛋白质是由氨基酸通过酰胺键连接而成的高分子，两性，存在等电点，因其空间结构的复杂性，有亲水或疏水之分。,蛋白质在低于等电点时会带上正电荷，在高于等电点时带负电荷若缓冲溶液的pH值低于蛋白质等电点，蛋白质则吸附H而带正电荷，由于静电相互作用，蛋白质与管壁发生吸附。,（a）碱性蛋白质（pI8）所带电荷量随pH的变化曲线；（b）在pH4时，碱性蛋白质（pI8）与毛细管壁发生吸附,.极端pH值法,pH高于蛋白质的pI时，毛细管内壁对蛋白质产生静电排斥抑制吸附，但是，蛋白质存在的自然状态为pH410，高pH如11.0时，容易使蛋白质变性或者水解。pH小于1.5（熔融硅或石英的等电点）时，蛋白质的质子化导致其质荷比差别较小，分辨率难以提高。对等电点相近的蛋白质不易实现分离。一般认为，使蛋白质混合物分离的首选pH值应和蛋白质混合物的pKa值基本一致。,McManigillD.AnalChem,1986，58：166170.,2.添加小分子添加剂,表面活性剂：季铵盐和氟化的阳离子表面活性剂。中性盐：如磷酸盐，硫酸钾等。胺类：三乙醇胺、三乙胺、N-乙基二乙醇胺，N,N,N,N-四甲基-1,3-丁二胺（TMBD）等。有机溶剂：醇类、乙腈、丙酮、四氢呋喃、二甲亚砜等，其中最常用的是甲醇和乙腈。选用极端pH值或添加小分子添加剂的方法虽然能从一定程度上降低蛋白质吸附，但是容易导致蛋白质聚集和变性。目前最常用的方法是用聚合物对毛细管内壁进行改性处理。,何金兰等.高效毛细管电泳.北京：科学出版社，1996,7275.VerzolaB,GelfiC,RighettiPG.JChromatogrA，2000，868：8599.CorradiniD,CannarsaG,FabbriE,etal.JChromatogrA，1995，709：127134.CorradiniD,CannarsaG.Electrophoresis，1995，16：630635.,.聚合物涂覆毛细管内壁抑制蛋白质吸附,(1)化学键合的毛细管涂层,化学键合的交联的PVA涂层对4种碱性蛋白质实现第2次和第902次分离的电泳图谱样品浓度：50ug/mL的（1）细胞色素C，（2）溶解酵素，（3）胰蛋白酶原，（4）胰凝乳蛋白酶原。分离条件：毛细管，内径50m，总长48.5cm（有效长度40cm）；注入，3kV,5s；缓冲液，40mM磷酸钠；分离，309V/cm,(2)物理吸附的毛细管涂层,目前使用的聚合物：中性的聚合物已经广泛用于DNA和其它一些生物大分子的分析，但是由于蛋白质的吸附作用，使得对蛋白质的分析仍有一定难度。亲水性的聚合物如甲基纤维素，聚糖等不能很好的吸附在管壁上，稳定性差。带疏水基团的聚合物聚乙烯基吡咯烷酮，聚N,N-二甲基丙烯酰胺可以形成稳定的涂层，但是由于疏水基团与蛋白质之间的相互作用使得分离效率下降。,MadabhushiRS.Electrophoresis，1998，19：224230.VerzolaB,GelfiC,RighettiPG.JChromatogrA，2000，874：293303.,羟乙基纤维素的改性,Formationofthecat-HEC,Schematicdiagramofadsorptionofcat-HEContosilicasurface.,(1)Cat-HEC,PreparationandpropertiesofCat-HEC,ElectroosmoticflowasafunctionofpH.Comparisonbetweenabarefused-silicacapillary,HECandcat-HECcoatedcapillary,Electropherogramsofamixtureofstandardproteins.Separationswerecarriedoutusingcat-HEC-2coatedcapillary1=Lysozyme;2=CytochromeC;3=RibonucleaseA.,ElectropherogramsofamixtureofstandardproteinsatpH4.6.,Electrophoresis,2008,29,1460-1466.,ElectropherogramsofamixtureofstandardproteinsindifferentpH.Separationswerecarriedoutusingcat-HEC-2coatedcapillary1=Lysozyme;2=CytochromeC;3=RibonucleaseA.,Migrationtimereproducibility(n=3)andpeakefficiencyofproteinsseparatedinpolymer-coatedcapillariesatpH4.6,()HEC-g-P4VP,FormationoftheHEC-g-P4VP,ElectroosmoticflowasafunctionofpH.Comparisonbetweenabarefused-silicacapillary,HECandHEC-g-P4VPcoatedcapillary,Electropherogramsofamixtureofstandardproteins.Separationswerecarriedoutusingcat-HEC-g-P4VPcoatedcapillary.1=Lysozyme;2=CytochromeC;3=RibonucleaseA.,结构规整的聚合物,PEO-b-P4VP,a.MnofPEO-b-P4VPestimatedby1HNMR；b.MnofPEO-b-P4VPdeterminedbyGPC.,FormationofthePEO-b-P4VP,1HNMRandGPCdataofPEO-b-P4VPcopolymers,EffectofmolecularweightofP4VPblockontheseparationofbasicproteinsatpH4.6.1,lysozyme;2,cytochromec;3,ribonuclease.,(A)TypicalTEMimagesof(a)PEO113-b-P4VP45,(b)PEO113-b-P4VP90,(c)PEO113-b-P4VP113,and(d)PEO113-b-P4VP294;(B)Schematicillustrationofcopolymersofdifferentmorphologiescapillarycoatingprocedure(a)PEO113-b-P4VP45,(b)PEO113-b-P4VP90,(c)PEO113-b-P4VP113,and(d)PEO113-b-P4VP294,AnalysisofsalivasamplesbyPEO113-b-P4VP294coatedcapillary.Salivasamplesweredilutedto2-foldusingdeionizedwater.Samples(A)withoutand(B)withspikingof0.2mg/mLlysozymewereinjected.Separationconditions:40mMphosphate-citratebuffer,pH5.1;500V/cm;40cmcapillary(30cmtothedetector);temperature25.,EffectofbufferpHontheseparationofbasicproteins.separationsweretakeninPEO113-b-P4VP294coatedcapillary,Electropherogramsofplasmasampleinbarecapillary(A)andaPEO113-b-P4VP294coatedcapillary(B).Separationbuffer:19mMNaOH-Na2B4O7atpH9.7.HSA,humanserumalbumin;1-AT,1-antitrypsin;2-M,2-macroglobulin;-lp,-lipoprotein;Tf,transferrin;IgA,immunoglobulinA;IgG,immunoglobulinG.,Electrophoresis2008,29,2812-2819,3.多功能分离介质的合成及应用研究,(1)HEC-g-PDMA,研究背景能进行DNA、蛋白质、氨基酸、同分异构体等的分离,Separationof174/HaeIIIdigestbyCEwithHEC-g-PDMAat(a)1.0%w/v;(b)1.5%w/v;(c)2.0%w/v,EffectofpHvaluesonseparationsofbasicproteinsusingHEC-g-PDMAcoatedcapillary.1,lysozyme;2,cytochromec;3,ribonucleaseA.,Electrophoresis,2008,29,43514354.,(2)quasi-interpenetratingnetworkofLPAandPDMA,Propertiesofquasi-IPNcontainingLPAwithdifferentmolecularmasses,EOFasafunctionofpH.,Electropherogramsofamixtureofstandardproteins.,Separationof174/HaeIIIdigestbyCEwithquasi-IPN-3at(a)2%w/v;(b)3%w/v;(c)4%w/v;(d)4%w/v.Conditions:Separationelectricfieldstrengthof(a),(b),and(c)is6kV,separationelectricfieldstrengthof(d)is8kV.,Separationofbasicproteinsusingquasi-IPN-3coatedcapillaryatdiffer