生物传感器-1.ppt

生物传感器,中国科学院研究生院姚鑫,E-mail:yaox,学习这门课的目的通过本课程的学习，了解各类生物传感器的基本原理、特点、技术方法和应用。了解生物传感器的及发展趋势，为以后从事相关领域研究打好基础.参考书张先恩主编，生物传感器，化学工业出版社，北京，2006布莱恩R.埃金斯著，罗瑞贤等译，化学传感器与生物传感器，化学工业出版社，北京，2005,几个生物传感器的例子,DNA-表面等离子激元共振仪(SPR),多肽-电化学,DNA-电化学,PNA/DNA-SPR,葡糖淀粉酶,支链淀粉,酶-石英晶体微天平,Figure2.(A)TimecoursesoffrequencychangesoftheamylopectinimmobilizedQCM,respondingtotheadditionofglucoamylaseat(a)16,(b)27,(c)38,and(d)54nM.Thecurve(e)showsthehydrolysisofthepullulan-immobilizedQCMat540nMglucoamylase(25C,20mMacetatebuffer,pH4.8,0.1MNaCl).,传感器传感器:是一种装置,是检测或测量一种物理性质并进行记录,显示或以其他方式作出响应.,第一章绪论,分析生物技术的一个重要领域便是生物传感器(biosensor),它是一个典型的多学科交叉产物,结合了生命科学、分析化学、物理学和信息科学及其相关技术，能够对所需要检测的物质进行快速分析和追踪。生物的基本特征之一，是能够对外界的各种刺激作出反应。其所以能够如此，首先是由于生物能感受外界的各类刺激信号，并将这些信号转换成体内信息处理系统所能接收并处理的信号。例如，人能通过眼、耳、鼻、舌、身等感觉器官将外界的光、声、温度及其它各种化学和物理信号转换成人体内神经系统等信息处理系统能够接收和处理的信号。生物传感器的出现，是科学家的兴趣和科学技术发展及社会发展需求多方面双驱动的结果，经过30多年的发展，已经成为一个涉及内容广泛、多学科介入和交叉、充满创新活力的领域。,1.1生物传感器的发展历程,20世纪60年代酶法分析：专一性强、灵敏度高、操作简便，但是测定周期长。离子选择电极(ionselectiveelectrode,ISE)：操作简单，无需对样品进行欲处理无试剂分析(non-reagentalanalysis)，但是只能检测无机离子1956LelandC.ClarkJnr隔离式氧电极1962LelandC.ClarkJnr酶传感器(enzymetransducer)1967S.J.Updike葡萄糖酶电极1975YellowSpringsInstrument(YSI)葡萄糖测定仪1975C.Divis用完整活细胞取代纯酶制作传感器1977GA.Rechnitz用粪便链球菌完整活细胞与氨敏电极组合成测精氨酸的微生物电极1977IsoKarube和J.Janata测BOD的微生物传感器和测抗原的免疫传感器,随后出现了细胞器传感器、细胞传感器和组织切片传感器20世纪70年代中期到80年代，生物技术、生物电子和微电子学不断地渗透、融合，致使生物传感器不再局限于生物反应的电化学过程，而是根据生物学反应中产生的各种信息(如光效应、热效应、场效应和质量变化等)了设计各种精密的探测装置。1974K.Mosbach热生物传感器1974Janata酶场效应晶体管1980D.W.Lubbers和N.Optiz酶光纤传感器1983Giulbault压电晶体酶传感器1976A.H.Clemens等报道了以葡萄糖酶电极为基础的第一个人工肾脏，随后被Miles公司开发成生命稳定系统Biostator，用于重症糖尿病人床边监护。1983B.Liedberg利用表面等离子激元共振(SurfacePlasmonResonance)方法，能够适时的对生物亲和反应进行检测，在次基础上，瑞典Pharmacia公司在1990年推出商用仪器BIAcore，成为目前研究生物分子之间互相作用最优秀的实验工具。1984A.E.G.Cass首次建立了介体酶电极方法,利用化学介体戊二醛取代分子氧作为氧化还原酶酶促反应的电子受体,促成了1987年美国MediSene公司开发成功印刷酶电极.,发展迅速文章方面:webofscience中输入“biosensor”共检索到10035篇文章，约从1993-2006年。功能方面：活体(invivo)测定、多指标测定和联机在线(online)测定。检测对象：各种常见的生物化学物质，在临床、发酵、食品、化工和环保等方面均显示了广泛的应用前景。,1984华盛顿召开的国际生物工程年会上将生物传感器列为当代生物工程的重要领域之一1985Elsevier科学出版公司创刊生物传感器国际学术期刊，1990更名为生物传感器和生物电子学(Biosensors2)凡是酶可以催化的反应,微生物也可以催化;3)催化速度接近,反应动力学模式近似.,微生物反应的特殊性:1)微生物细胞的膜系统为酶反应提供了天然的适宜环境,细胞可以在相当长的时间内保持一定的催化活性;2)在多底物反应时,微生物显然比单纯酶更适宜作催化剂;3)细胞本身能提供酶促反应所需要的各种辅助因子和能量;4)微生物细胞比酶的来源更方便、更便宜.微生物作为传感器分子识别元件时不利因素：1)微生物反应通常伴随细胞的生长和调亡，不易建立分析标准；2)细胞是多酶系统，许多代谢途径并存，难以排除不必要的反应；3)环境变化会引起微生物生理状态的复杂化,不适当的操作会导致代谢转换现象,出现不期望有的反应.,2.3.2微生物反应类型1)同化与异化(根据微生物代谢流向)同化作用(assimilation)或组成代谢:细胞将底物摄入并通过一系列生化反映转变成自身的组成物质,并储存能量.异化作用(disassimilation)或分解代谢:细胞将自身的组成物质分解以释放能量或排出体外.2)自养与异养(根据微生物对营养的要求)自养(autotrophic):自养微生物的CO2作为主要碳源,无机氮化物作为氮源,通过细菌的光合作用或化能合成作用获得能量.异样(heterotrophic):异养微生物以有机物做碳源,无机物或有机物作氮源,通过氧化有机物获得能量.绝大多数微生物种类都属于异养型.,3)好气性与厌气性(根据微生物反应对氧的需求与否)好氧(aerobic)性微生物:在有空气的环境中才易生长繁殖的微生物.厌氧(anaerobic)性微生物:必须在无分子氧的环境中生长繁殖的微生物.4)细胞能量的产生与转移微生物反应所产生的能量大部分转移为高能化合物.高能化合物是指含转移势高的基团的化合物,其中以ATP最为重要,它不仅潜能高,而且是生物体能量转移的关键物质,直接参与各种代谢反应的能量转移.有两类反应可以产生ATP.,2.3.3分析微生物学分析微生物学(analyticalmicrobiology)是利用微生物完成定量分析任务的学科.有些情况下,微生物测定法比化学方法更专一和灵敏,效率亦更高.细胞增殖和呼吸法最常用.,b,2.4免疫学反应免疫指机体对病原生物感染的抵抗能力.自然免疫是非特异性的,即能抵抗多种病原微生物的损害.获得性免疫是特异性的,在微生物等抗原物质刺激后才形成(免疫球蛋白等),并能与该抗原起特异性反应.2.4.1抗原1)抗原的定义:抗原(antigen)是能够刺激动物机体产生免疫反应的物质,但从广义的生物学观点看,凡是具有引起免疫反应性能的物质,都可称为抗原.抗原有两种性能:刺激机体产生免疫应答反应免疫原性(immunogenicity)完全抗原(completeantigen,Ag)与相应免疫反应产物发生特异性结合反应反应原性(reactionogenicity),半抗原(hapten),2)抗原的种类按抗原物质的来源,抗原分为三类:(1)天然抗原(2)人工抗原(3)合成抗原3)抗原的理化性质(1)物理性状分子质量对免疫原性的影响:分子质量越大抗原性越强,原因在于复杂的大分子物质表面抗原决定族较多,化学性质相对稳定,在体内存留时间长,降解和排除速率较慢,有利于持续刺激肌体免疫系统,产生免疫应答.抗原构型对免疫原性的影响:环壮构型直线构型聚合态分子单体分子(2)化学组成绝大多数为蛋白质,可为纯蛋白质,也可为结合蛋白质,4)抗原决定簇(antigendeterminant)抗原决定簇是抗原分子表面的特殊化学基团，抗原的特异性取决于抗原决定簇的性质、数目和空间排列。.4.2抗体抗体(antibody)是由抗原刺激机体产生的具有特异性免疫功能的球蛋白，又称免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。人类免疫球蛋白有五类，即IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。,图-免疫球蛋白(Ig)结构模式图,重链(heavychain,H链):分子质量较大,420-460个氨基酸组成轻链(lightchain,L链):分子质量较小,213-216个氨基酸组成,2.4.3抗原-抗体反应抗原抗体的相互作用是所有免疫化学技术的基础.它们之间的反应是指抗原与抗体之间发生的特异性结合反应.这种反应可发生于体内(invivo),也可发生在体外(invitro).体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用;体外反应则根据抗原的物质性状、抗体的类型及反应的特点而分为凝聚、沉淀、溶解反应等不同的类型。抗体与抗原的特异性结合点位于FabL链及H链的高变区(抗体活性中心),其构型取决于抗原决定簇的空间位置,两者可形成互补性构型.抗原、抗体结合时准确对位的两个条件：结合部位的形成要互补于抗原的形状抗体活性中心带有与抗原决定簇相反的电荷抗体的特异性是相对的，表现在：部分抗体不完全与抗原决定簇相对应即便是针对某一种半抗原的抗体，其化学结构也可能不一样抗原抗体结合在一定pH或离子强度下也是可逆的。,基于抗原-抗体反应的检测技术主要应于以下几个方面：1)用已知抗原检测未知抗体2)用已知抗体检测未知抗原3)定性或定量检测体内各种大分子物质4)用已知抗体检测某些药物、激素等各种半抗原物质影响抗原-抗体结合反应的因素1)抗原抗体的性质:抗原-抗体反应的整体强度受3个因素控制:抗体对表位的内在亲和力,抗原抗体的结合价以及参与反应成分的立体结构.2)电解质:抗原抗体发生特异性结合后,由亲水性胶体变为疏水性胶体,电极质的存在会使抗原-抗体复合物失去电荷而沉淀或凝集,出现可见反应.3)酸碱度:蛋白质具有两性电离的性质,抗原抗体的反应必须在合适的pH环境中进行.4)温度:一般在37,高温抗原抗体变性,低温反应太慢.,2.4.4免疫学分析免疫分析是利用抗体与抗原的特异性结合作用来选择性识别和测定可以作为抗体或抗原的待测物.抗原-抗体反应的特异性和专一性决定了免疫反应具有很高的选择性.1)沉淀法可溶性抗体与其相应的抗原在液相中相互接触,可形成不溶性抗原-抗体复合物而发生沉淀,包括扩散实验和电泳试验,此为经典的免疫学实验,灵敏度水平为g/ml.2)放射免疫测定法(radiationimmunoassay,RIA)利用放射性同位素示踪技术和免疫化学技术结合起来的方法,灵敏度高,特异性强,准确度高,重复性好;同位素危害,3)免疫荧光测定法(immunofluorescentassay)高度的特异性和敏感性,可定位,serumcarcinoembryonicantigen(CEA),4)酶联免疫测定法(enzymelinkedimmunoassay,ELISA)用酶促反应的放大作用来显示初级免疫学反应.灵敏度不高,但是特异性,重现性和准确性很好,成本低,稳定性好和操作安全等,应用最广.酶免疫分析主要有两种:夹心法和竞争法.夹心法要求抗原至少有两个结合点,不能用于检测半抗原,多用于测定大分子物质.产生的信号强度与结合在固相上的抗原量成比例关系.,夹心法测抗原示意图,竞争法产生的信号强度与结合在固相上的酶标抗体量成正比例关系,与样品中的抗原量成反比关系.主要用于测定小分子抗原.,竞争法测抗原示意图,5)电化学免疫分析(electrochemistryimmunoassay,ECIA)电化学免疫分析是将免疫技术和电化学检测相结合的一种标记免疫分析方法.用作电化学免疫分析的生物酶及反应体系须满足以下条件:酶具有高或性,可在短时间内将大量底物分子转化为产物;产物具有电化学或性;酶底物和酶在缓冲溶液中稳定;酶产物的副反应很少;容易与抗体或抗原结合,且不降低活性;在测定条件下体系底物非活性.,2.5核酸与核酸反应2.5.1核酸组成与结构1)核酸的组成成分核酸是所有生命体的遗传信息分子,包括脱氧核糖核酸(DNA,deoxyribonucleicacid)和核糖核酸(RNA,ribonucleicacid).两类核酸都是由单核苷酸(nucleotide)组成的多聚物.核酸分子中的核苷序列组成密码,其功能是储存和传输遗传信息,指导各类型蛋白质的合成.单核苷酸的组成:碱基,脱氧核糖或是核糖,磷酸基团,腺嘌呤(adenine,A),鸟嘌呤(guanine,G)胞嘧啶(cytosine,C),胸腺嘧啶(thymine,T),DNA的碱基组成Chargaff规则的内容.所有DNA：A=T、G=C，即A+G=T+C.DNA的碱基组成具有种的特异性，即不同种的DNA碱基组成不一样.对同一生物物种，DNA的碱基组成没有组织和器官的特异性.DNA的碱基组成不随年龄、营养状况及环境的改变而改变Chargaff规则的意义该规则为后来建立DNA双螺旋结构模型奠定的基础，并为阐明DNA的生物学功能提供了重要依据。,2)DNA结构一级结构:脱氧核苷酸在长链上的排列顺序二级结构:双螺旋链(碱基配对规则)氢键(最主要的力)维持双螺旋链稳定因素:碱基堆积力(vanderWaals)分子内部碱基对间的疏水键,Watson和Crick于1953年根据DNA晶体的X-射线衍射图谱和Chargaff规则等数据提出双螺旋结构。,一级结构,不同构象只是螺距、直径、每圈含碱基数目不同,3)RNA结构RNA在细胞中主要以单链形式存在,可暂时形成双螺旋,或自折叠成双螺旋区域.,尿嘧啶(uracil,U),2.5.2DNA变性(denature),核酸的紫外吸收特性DNA在260nm处有最大的紫外吸收值因嘌呤碱和嘧啶碱对250280nm的光波有强的吸收作用，对260nm光波的吸收能力最大。当核苷酸摩尔数相同时，A260的大小有如下关系：单核苷酸单链DNA双链DNA从左到右称为减色效应(hypochromism),从右到左称为增色效应(hyperchromiceffect)。DNA的双螺旋结构比双螺旋松驰结构对紫外(260nm)的吸收要小，最大可降低约34%。因为DNA双螺旋结构中的碱基对彼此之间又形成了碱基堆积力，影响了碱基对260nm光的吸收。当DNA双螺旋松散后，所得的光吸收值几乎是其组成中所有碱基光吸收值的总和。,DNA的紫外吸收特性的应用估计核酸样品的纯度一般：A260/A2801.82.0，DNA纯度符合要求A260/A2802.0,提示DNA样品中含有RNA实质破坏了核酸的空间结构，但不涉及一级结构(共价键）的断裂。引起变性的因素加热（热变性）、介质中的pH过低或过高、加入有机溶剂、加入尿素等介质中的pH过酸或过碱对DNA双螺旋结构的影响：过量酸使A、G、C上的氮原子质子化，不利于氢键形成；过量碱使G、T上的氮原子去质子化，亦不利于氢键形成。高温时DNA双链会分离,称为解链(melting).当温度返回常温时,DNA或RNA能够重新回到天然结构,称为复性(annealing).当光吸收强度增加到最大值的一半时,所对应的温度称为解链温度(meltingtemperature),Tm.,2.5.3核酸分子杂交定义应用核酸分子的变性和复性的性质，使来源不同的DNA（或RNA）片断按碱基互补关系形成杂交双链分子，这一过程称为核酸的分子杂交。杂交的两条链一条是待测的单链的核酸分子，如克隆的基因片断、PCR产物、基因组DNA或细胞总RNA等。另一条可以是探针核酸探针是指特定的已知碱基序列的核酸片断，可以是DNA、cDNA、mRNA及RNA等。在现代分子生物学实验中，探针的制备和使用是与分子杂交相辅相成的技术手段。意义核酸杂交是核酸研究中一项最基本的实验技术。该技术在分子生物学研究领域中被广泛应用，如用于基因组中特定基因序列的定性和定量检测、基因突变分析以及某些遗传性疾病（如地中海贫血、血友病、苯丙酮酸尿症等）的诊断。,2.5.4核酸功能一、DNA功能:DNA是遗传信息的载体,其所携带的信息不仅是安全可靠的,还可以读取和利用,并代代稳定相传.DNA通过三个反应实现上述功能:自我复制(selfapplication)、自我修复(sefl-repair)和转录(transcription)成mRNA并随后被翻译(translation)成蛋白质。DNA自我复制发生在细胞分裂之前,分三个步骤:1)在螺旋酶(helicase)的作用下,一部分双链被打开;2)DNA聚合酶与DNA的一条链结合,并沿3端到5端移动,利用该链为模板,合成一段核酸引链(leadingstrand),该链重新形成双螺旋链.3)由于DNA合成只能按5端至3端方向进行,另一个DNA聚合酶也同时与另一条单链结合并进行DNA片段的合成,并有连接酶将这些片段连接起来,形成滞后链(laggingstrand).,上面的过程形成两个完全一样的DNA分子，称为复制(replication).复制的DNA分子被均等的分配到两个子细胞，使它们具有完全相同的遗传学信息。DNA分子的每一条链都是一个模板，所合成的链称为互补(complementary)链。如果复制过程中发生碱基错配(mismatch)，将发生基因点突变。细胞主要有两道防线防止突变的发生，一个是DNA聚合酶的校正(proofreading)功能，当发生一个碱基错配后，DNA聚合酶的一个亚基将识别并将以切除，以重新进行正确合成；另一个是DNA错配修复系统，有多种模式。它们在DNA复制完成以后，能够对DNA继续进行检查，识别出错配碱基，并将之切除修复。这样就保证了生物遗传的稳定性。,转录过程是将DNA所携带的遗传信息拷贝到短寿命的信使RNA(mRNA)上。步骤如下：1)DNA被转录部分解螺旋,RNA聚合酶与一条DNA的一条单链结合,该结合部位称为启动子区域(promoterregion).2)RNA聚合酶以所结合的DNA链为模板,合成延伸一段序列互补的RNA链.3)完全合成的RNA脱离RNA聚合酶/DNA复合物,并进入细胞质开始参与翻译.,2)RNA功能RNA有信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)