生物化学实验课件-西南科技大学生命科学与工程学院首页.ppt

不同植物样品可溶性蛋白含量和多肽组分的差异,实验目的,掌握冷冻离心机的操作使用方法。掌握植物可溶性蛋白的提取方法和原理。掌握分光光度计的使用方法和原理。掌握可溶性蛋白的定量测定方法和原理。掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理和基本操作过程。,实验包括三个部分内容：一、不同植物样品可溶性蛋白的提取。二、植物可溶性蛋白含量的测定。三、聚丙烯凝胶电泳分离可溶性蛋白。,一、不同植物样品可溶性蛋白的提取,原理植物材料中通常含有两类蛋白，一种是易溶于水主要存在于细胞基质、叶绿体基质和线粒体等细胞器基质中的可溶性蛋白，另一类是难溶于水主要存在于各种细胞器膜上的膜结合蛋白。将植物材料在一定的提取缓冲液和04低温下充分研磨，可溶性蛋白将溶解在提取缓冲液里，通过离心将未破碎细胞器和膜蛋白去除，得到的离心上清夜就是可溶性蛋白的粗提物。,离心机基本原理,离心力（centrifugalforce，Fc）离心作用是根据在一定角度速度下作圆周运动的任何物体都受到一个向外的离心力进行的。离心力（Fc）的大小等于离心加速度2X与颗粒质量m的乘积，即：FCm2X其中是旋转角速度，以弧度/秒为单位；X是颗粒离开旋转中心的距离，以cm为单位；m是质量，以克为单位。,相对离心力（relativecentrifugalforce，RCF）由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力而受变化，因此在文献中常用“相对离心力”或“数字g”表示离心力，只要RCF值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。RCF就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。RCFF离心力/F重力m2X/mg=1.118105.N.XN（rpm）=RCF105/（1.18X）式中X为离心转子的半径距离，以cm为单位；g为地球重力加速度（980cm/sec2）；N为转子每分钟的转数（rpm）。,植物细胞破碎后通过差数离心形成的沉淀,实验注意事项：整个操作过程在04低温下进行；研磨必须充分；加蛋白酶抑止剂（PMSF苯甲基磺酸氟）或抗氧化剂；提取的蛋白一般需要分装后，在液氮或80低温下保存。,实验材料、试剂与仪器设备,（一）实验材料自选植物材料，至少三种以上处理，例如：1、不同植物的叶片；2、同一植物的根、茎、叶、花等不同组织器官；3、同一植物不同发育状态如嫩叶、成熟叶和老叶；4、或者叶片用不同的高温处理等等。,（二）试剂1提取缓冲液：0.125mol的Tris-HCl,pH7.0，称取12.5gTris于烧杯，用适量双蒸水溶解，HCl调pH至7.0,定容至1000ml。2聚乙烯吡咯烷酮（PVP）3-巯基乙醇（三）设备冷冻离心机，研钵，烧杯，量瓶，移液管，试管等,准确称取0.5g植物材料，加入2ml预冷的提取缓冲液，0.1g聚乙烯吡咯烷酮PVP和50l的-巯基乙醇，置冰浴研磨匀浆后,转移到10ml塑料离心管，用3ml提取液分两次洗涤研钵，提取液总体积5ml，10000g下离心10min，上清液为可溶性蛋白的粗提液。,操作步骤,二、植物可溶性蛋白含量的测定,原理考马斯亮蓝G-250（Coomassiebrilliantblue，G-250）法是利用蛋白质-染料结合的原理，定量地测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德瓦尔键结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。,蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质染料复合物发生聚合并沉淀出来。此法灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍），易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。,试剂与仪器设备,冷冻离心机，研钵，烧杯，离心管，（二）试剂1.标准蛋白质溶液（100gmL牛血清白蛋白）：称取牛血清蛋白25mg，加水溶解并定容至100mL，吸取上述溶液40mL，用蒸馏水稀释至100mL即可。2.考马斯亮蓝试剂：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90乙醇中，加入100mL85（WV）的磷酸，再用蒸馏水定容到1000mL，贮于棕色瓶中。常温下可保存一个月。（三）仪器设备分光光度计，烧杯，量瓶，移液管，试管等。,操作步骤,标准曲线的绘制取6支试管，按下表加入试剂，摇匀，向各管中加入5mL考马斯亮蓝试剂，摇匀，并放置5min左右，以0号试管为空白对照，在595nm下比色测定吸光度。以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。,2.样品测定吸取先前提取的可溶性蛋白提取液0.1mL（视蛋白质含量适当稀释），放入试管中（每个样品重复23次），加入0.9ml蒸馏水，加入5mL考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置2min后在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。,结果计算,样品中的蛋白质含量（CVT）/(VSWF1000)（mg/g）式中：C查标准曲线值，g。VT提取液总体积,mL。VS测定时加样量,mL。WF样品鲜重,g。,三、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离植物可溶性蛋白,电泳是指带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。,电泳基本原理：,电泳现象早在1808年就已经被发现,但电泳作为一种分离技术却是在1937年由瑞典科学家TiseliusA首先提出来的,并设计出世界上第一台自由电泳仪,建立了移界电泳分离模式.他用光学方法观察到在电泳迁移过程中血清蛋白质界面的移动,首先证明了血清是由白蛋白,1,2,和球蛋白组成的,为表彰他对电泳技术所做出的突出贡献,1948年他被授予诺贝尔奖.,COO-COO-COOH+H+H+PrPrPr+OH-+OH-NH2NH3+NH3+PHPIPH=PIPH纤维状（2）电场强度：E越大，V越大（3）缓冲液pH：pH决定Q，(pH-PI)越大，Q越多，V越大；成分：性质稳定，不易电解。,（4）缓冲液离子强度：最合适的离子强度应该在0.02-0.2M之间。缓冲液离子强度越大，样品电流减小，V变小；缓冲液离子强度越小，样品电流越大，V越大，但样品易扩散。,（5）电渗现象：液体对固体的相对移动，由缓冲液的水分子和支持介质的表面之间所产生的一种相关电荷所引起。电渗与电泳方向相同，V变大；反之变小。,（6）支持介质：惰性材料，有一定坚韧度，可以保存；吸附力要小；无电渗作用（7）温度：过高，由于产热增加、水分蒸发，对电泳不利。,电泳的分类,一、按分离的原理分类1、区带电泳不同的组分在均一的缓冲液系统中分离成独立的区带，可以用染色等方法显示出来，用光密度计扫描可得到一个个互相分离的峰。电泳的区带随时间延长和距离加大而扩散严重，影响分辨率。加不同的介质可减少扩散，特别是在凝胶中进行，它兼具分子筛的作用，分辨率大大提高，是应用最广泛的电泳技术。2、移界电泳把电场加在生物大分子溶液和缓冲溶液之间的界面上,带电颗粒的移动速度通过光学方法观察界面的移动。它只能起到部分分离的作用，如将浓度对距离作图，则得到一个个台阶状的图形，最前面的成分有部分是纯的，其他则互相重叠。其是Tiselius最早建立的电泳方法。,3、等速电泳在电泳达成平衡后，各区带相随，分成清晰的界面，以等速移动。按距离对浓度作图也是台阶状，但不同于上述移界电泳，它的区带没有重叠，而是分别保持。4、等电聚焦电泳由多种具有不同等电点的载体两性电解质在电场中自动形成PH梯度，被分离物则各自移动到其等电点而聚成很窄的区带，分辨率高。,二、按有无固体支持物分类1、自由电泳显微电泳移界电泳柱电泳自由流动幕电泳等速电泳,2、支持物电泳（1）无阻滞的支持物纸电泳醋酸纤维薄膜电泳薄层电泳（2）凝胶电泳淀粉凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳,1.连续电泳：缓冲液的离子成分、PH、凝胶浓度、电位梯度都相同，带电颗粒电泳时仅具有电荷效应、分子筛效应。2.不连续电泳：缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度、电位梯度不连续，带电颗粒电泳时具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。,三、根据电泳的过程的连续性分为,分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。电荷效应：电荷量不同，迁移率不同。浓缩效应：样品在电泳的过程中被浓缩成高浓度的薄层。,四、根据电压的高低分常压电泳（100500V）高压电泳（500V以上）五、根据电泳槽的形状分垂直电泳水平电泳柱状（圆盘）电泳毛细管电泳,原理：以醋酸纤维薄膜为支持物，在pH=8.6的巴比妥缓冲液中，血清蛋白的PI均小于8.6，带负电荷，电泳时向正极移动。由于迁移率不同而被分离。,一、醋酸纤维薄膜电泳（celluloseacetatemembraneelectrophoresis）,醋酸纤维薄膜是一种由醋酸纤维加工制成的一种细密且薄的微孔膜。广泛应用于医学临床中各种生物分子的分离分析中，如血清蛋白、血红蛋白、球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋白、类固醇及同工酶等。它具有简单快速等优点，电渗作用虽然较高但很均一，不影响样品的分离效果。不足之处是分辨率比聚丙烯酰胺凝胶电泳低，由于薄膜厚度小（约10100m），样品用量很少，不适于制备。,结果示意图：,21,清蛋白,（一）实验原理：聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，Nmethylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N，N四甲基乙二胺(N，N，N，Ntetramethylethylenediamine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammoniumpersulfate(NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribofavin即vitaminB2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE)。,二、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,Acr和Bis的浓度、交联度可以决定凝胶的密度、粘度、弹性、机械强度以及孔径大小。100ml凝胶溶液中含有的单体和交联剂总克数为凝胶浓度，用T%表示。凝胶溶液中交联剂占单体加交联剂总量的百分数称之为交联度，用C%表示。T%（a+b）100/mC%b100/(a+b)式中aAcr的质量（g）；bBis的质量（g）；m凝胶溶液总体积（ml）。在此，ab（W/W）是关键；ab10时，形成的凝胶脆、硬、呈乳白色；ab100时，即使5%的凝胶也呈糊状，易断裂。要制备透明而有弹性的凝胶，ab要控制在30左右。通常T=2%5%时，ab=20左右；T=5%10%时，ab=40左右；T=15%20%时，ab=125200左右。T在3%25%的范围内，凝胶易发生聚合。,聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：,(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；(3)对pH和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；,(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。,凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。下表是分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围适用的凝胶浓度/(%)蛋白质10420-301-410415-201-5104-110510-1511055-1051052-5核酸(RNA)10415201041055-10105-21062-2.6,聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如图2)，两者电泳原理完全相同。,图1聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面)(1)样品胶pH6.7(2)浓缩胶pH6.7(3)分离胶pH8.9(4)电极缓冲液pH8.3,圆盘电泳槽,图2夹心垂直板电泳槽示意图图3凝胶模示意图1.样品槽模板2.长玻璃板1.导线接头2.下贮槽3.凹形橡胶框4.样品槽模板5.固定螺丝6.上贮槽7.冷凝系统,美国BioRad公司的小型垂直电泳槽,不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。,浓缩效应电荷效应分子筛效应,三大效应：,有效迁移率=迁移率解离度,（1）缓冲液离子成分、PH的不连续性：电极缓冲液的pH=8.3，甘氨酸的电离小，有效迁移率小，称为慢离子；浓缩胶中的氯离子完全电离，有效迁移率大，称为快离子；蛋白质在浓缩胶中介于二者之间。电泳开始后，氯离子跑得最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨酸离子追赶氯离子，当二者速度相等时，形成一个不断向正极移动的界面，蛋白质夹在中间而被压缩。（2）凝胶孔径的不连续性：在电场作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中阻力小，速度快，进小孔胶时，阻力大，速度慢，在两胶交界处，因迁移受阻而被压缩。,浓缩效应,单体：丙烯酰胺（Acr）；交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis）；催化剂：过硫酸胺或核黄素；加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）；产物：三维网状结构凝胶。,聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamidegel,PAG）的聚合反应：,操作步骤：,1.制备PAGE胶柱,封口灌分离胶，封水灌浓缩胶，封水,2.上样，电泳3.染色，观察结果,1过硫酸铵和四甲基乙二胺（TEMED）比例随温度改变进行调整。2制胶时，要充分摇匀，及时灌胶，及时冲洗玻璃滴管。3加注水层必须缓慢细流，量适中。4Acr和Bis有毒。5注意观察实验现象：分界面，浓缩效应6固体胶切忌倒入水池。,注意事项：,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(sodiumdodecylsulfate,简称SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。,97.4KD66.2KD45KD31KD21.5KD14.4KD,M25354045505560,SDS-PAGE电泳分离光合膜蛋白,聚丙烯酰胺圆盘绿胶电泳分离光合膜上的超分子复合体,2535404550,Mark2535404550,97.4KD66.2KD45KD31KD21.5KD14.4KD,SDS-PAGE电泳鉴定超分子复合体,三、琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖是从海藻中提取出来的一种杂聚多糖，是由D型和L型半乳糖以-1，3和-1，4糖苷键相连形成的线状高聚物（如下图所示）。琼脂糖遇冷水膨胀，溶于热水成溶胶，冷却后成为孔径范围从50nm到大于200nm的凝胶。,琼脂糖凝胶电泳是分离，鉴定和纯化核酸的常用技术。核酸是带均匀负电荷的生物大分子，在电场中向正极移动，不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。以适当浓度的凝胶介质作为电泳支持介质，具有分子筛效应，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到分离的目的。此为分离、鉴定、纯化核酸片段的标准方法。用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（EB）进行染色，可直接在紫外灯下确定核酸在凝胶中的位置。,影响核酸琼脂糖凝胶电泳的几个因素：1.核酸分子的大小：线性核酸分子的迁移率与其分子量的对数值成反比。2.琼脂糖浓度：一定大小的核酸片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率是不相同的。相反，在一定浓度的琼脂糖凝胶中，不同大小的核酸片段的迁移率也是不同的。若要有效地分离不同大小的核酸，应采用适当浓度的琼脂糖凝胶。,3.核酸分子的形态：在同一浓度的琼脂糖凝胶中，超螺旋DNA分子迁移率比线性DNA分子快，线性DNA分子比开环DNA分子快。4.电流强度：每厘米凝胶电压不超过5V，若电压过高分辨率会降低，只有在低电压时，线性核酸分子的电泳迁移率与所用电压成正比。,DNA片段的琼脂糖凝胶电泳,操作步骤：1.将凝胶成形模具两端用医用胶布封好，水平放置，将选好的梳子放好，梳子底部与模具之间留1mm空间。2.称取DNA电泳用琼脂糖0.8g放入250ml的三角烧瓶中，加入100ml1TAE缓冲液，混匀后，将烧瓶置于电炉上，加热煮沸，直至琼脂糖完全溶解。3.关闭电炉，取下三角烧瓶，将其置室温下冷却至70左右(手握烧瓶可以耐受)，再加入溴化乙锭(10mg/ml)5l，混匀后，即将凝胶溶液倒入胶板铺板。本实验所用制胶板约需胶液100ml。,4.室温下待凝胶完全凝固，需时约30分钟，揭去二端胶布，拔出梳齿，将胶板放入电泳槽中。5.在电泳槽加入1TAE缓冲液，以高出凝胶表面2mm为宜,6.用加样器吸取样品。依序分别加入点样孔中，注意加样器吸头应恰好置于凝胶点样孔中，不可刺穿凝胶，也要防止将样品溢出孔外。7.接通电源，调节电压至50伏，电泳90分钟后，将凝胶板取出，在紫外灯下观察结果。,试剂与材料：1.琼脂糖2.6点样缓冲液：0.25%溴酚兰、40%蔗糖3.DNA分子量标准：DNA分子量标准：DNA/Hind4.50TAE电泳缓冲液贮存液配方：(50)每升242gTris57.1ml冰醋酸100ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)1缓冲液浓度：0.04mol/LTrisHAc、0.002mol/LEDTA5.0.8%琼脂糖：0.8g琼脂糖用100ml1TAE沸水浴溶解6.10mg/mlEB1.0g溴乙锭100ml三蒸水,凝胶成像系统,电泳的染色,一、蛋白质染色1、氨基黑10B染色法2、考马斯亮蓝R250染色法3、考马斯亮蓝G250染色法4、固绿染色法6、银染染色法7、广谱染料染色法,二、核酸的染色1、RNA染色法焦宁Y染色法甲苯胺蓝O染色法次甲基蓝染色法荧光染料溴化乙锭（ethidiumbromide，EB）染色法,2、DNA的染色EB染色法甲基绿染色法二苯胺染色法Feulgen染色法,器材,电泳仪一套（稳压电源，垂直电泳槽和相配套的凹槽玻璃）；真空泵及真空干燥器；台式高速离心机（10000rpm）；烧杯：50ml1、25ml1；三角瓶：100ml1；微量进样器：50l2；注射器：5ml1；穿刺针头；胶头滴管；刻度吸：10ml3、5ml2、0.1ml1；医用胶布；培养皿：20ml2（或用白瓷盘代替，染色用）。,试剂,130%丙烯酰胺（Acr，）；配制后需过滤21%甲叉双丙烯酰胺(Bis)；310%的过硫酸铵（AP冰箱贮藏，不得超过5天）；4N，N，N，N-甲基乙二胺（TEMED）；5.10%十二烷基磺酸钠SDS,称取1gSDS,定容至10ml；6分离胶缓冲贮备液（0.375mol/LTris-HClpH8.8）：称取4.543gTris,HCl调pH至8.8，定容至100ml；7浓缩胶缓冲贮备液（0.125mol/LTris-HClpH6.8）：称取0.6057gTris,HCl调pH=6.8，定容至40ml；8电极缓冲液（0.25mol/LTris，1.92mol/L甘氨酸，1SDS，pH8.3）：称取30.23gTris,144.134g甘氨酸，10gSDS，重蒸馏水定容至1000ml，用时稀释10倍。9样品增溶缓冲液：Tris0.1514g，SDS0.4g，-巯基乙醇1ml，甘油2ml，溴酚蓝0.1g，加水稀释到10ml。10固定液：乙醇500ml，醋酸100ml，水400ml。11染色液：R2500.29g，于250ml脱色液中。12脱色液：乙醇250ml，醋酸80ml，加水至1000ml。,实验步骤,1.凝胶制备：（1）取两块电泳玻板（其中一块有凹槽），用去污剂洗净，蒸馏水冲洗，直立干燥。洗净的玻板内面要避免手指触摸以防沾污。根据所需凝胶厚度选择0.75-3mm厚的玻璃或Teflon夹条，安装并用胶布将两侧封好。将板用铁夹固定于制胶架上，下部插入封胶琼脂小盒中。待模具安装好后，用电极缓冲液配制1.5%琼脂液（冬天1.5%，夏天2%），沸水浴加热至琼脂完全溶化后，用皮头滴管先沿板上部灌入两侧的封胶孔，再直接于琼脂盒将琼脂灌入，注意不要产生气泡。一旦用琼脂封板后，模具不应再挪动，以防产生裂缝。封好的模具应三面有连续琼脂封闭区。,丙烯酰胺凝胶配制表（分离胶30ml，浓缩胶10ml，可根据需要，按比例增减各成份的体积。）,（2）根据需要从表中选择适当浓度值，配制凝胶。一般同工酶可选择7.5%10%的胶（过氧化物酶和酯酶7.5%较合适，超氧化物岐化酶用10%，可溶性蛋白可根据需要配制，一般用15）。将配制好的凝胶液置真空干燥器中，抽气10min，再加入TEMED15l，混匀后用一细玻棒引流，沿无凹槽的玻板缓缓注入胶室中，注胶过程防止气泡产生。胶液加到离凹槽3c