生物化学课件 第五章蛋白质的共价结构.ppt

第五章,蛋白质的共价结构,1952年丹麦人Linderstrom-Lang最早提出蛋白质的结构可以分成四个层次:primarystructure一级结构：氨基酸序列secondarystructure二级结构：螺旋，折叠tertiarystructure三级结构：所有原子空间位置quanternarystructure四级结构：蛋白质多聚体1969年正式将一级结构定义为氨基酸序列和双硫键的位置。介于二级结构和三级结构之间还存在超二级结构（二级结构的组合）和结构域（在空间上相对独立）这两个层次。,蛋白质的结构层次,蛋白质结构层次,肽基的C、O和N原子间的共振相互作用,共振产生的重要结果：限制绕肽键的自由旋转形成酰胺平面产生键的平均化肽键呈反式构型,sp2,sp2,sp2,sp3,共振杂化体,历史上第一个被确定氨基酸序列的蛋白质胰岛素insulin,胰岛素的历史第一个生化药物,最小的蛋白质，由A链(21AA)和B(30AA)组成；动物胰腺细胞分泌的一种激素,告诉细胞往里面运输糖、氨基酸、K+；1921年BantingXPro)嗜热菌蛋白酶（thermolysin）；木瓜蛋白酶（papain）；X-Y(X=R,K,Q,H,Y)胃蛋白酶（pepsin）；枯草杆菌碱性蛋白酶（subtilisin）专一酶：Lys-X;X-Lys;Arg-X;Glu-X;X-Asp;Pro-X;Asn-X,商品名：EndoproteinaseAsn-C,肽键的专一性水解(酶法),酶法专一性水解,氨基酸的鉴定、分离纯化,PTH-AA,氨基酸的确定,太短在多肽链中次序的决定,资料：N-末端残基H,C-末端残基S;第一套肽段第二套肽段OUSSEOPSWTOUEOVEVERLRLAAPSHOWTHO,借助重叠肽确定肽段次序：末端残基HS末端肽段HOWTAPS或OUS第一套肽段：HOWTOUSEOVERLAPS第二套肽段：HOWTOUSEOVERLAPS推断全序列:HOWTOUSEOVERLAPS,二硫键的断裂：几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。,二硫键的断裂,确定原多肽链重二硫键的位置：,一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将每个肽段进行组成及顺序分析，然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。,二硫键的切割与保护,1、过甲酸performicacid不可逆CH2SO3H2、还原烷基化不可逆巯基乙醇，DTT碘乙酸等S-CH2-COOH,二硫键的保护,1、为防止Cys跟Cys-Cys发生交换反应，先将自由SH基封闭;2、进行专一性部分水解;3、纸层析分离水解产物;4、气相过甲酸法切断S-S键，作第二相纸层析;5、将迁移率发生变化的多肽进行测序,经典的二硫键位置的确定法,二硫键位置确定,对角线电泳示意图,现用蛋白质一级结构分析方法,分离纯化蛋白质,酶切部分水解后分离短肽,对短肽进行测序,构建cDNA文库,根据序列设计探针,筛选cDNA文库,根据cDNA序列推测蛋白质的一级结构,N末端和C末端的测序除了用于未知蛋白质的一级结构的研究以外，最常用于基因工程表达产物的末端分析。,末端测序的用途,常利用蛋白质数据库,/www.espasy.ch/swissmod///pdb/,蛋白质氨基酸顺序与生物功能,研究蛋白质一级结构与功能的关系主要是：研究多肽链中不同部位的残基与生物功能的关系。进行这方面的研究常用的方法有：同源蛋白质氨基酸顺序相似性分析、氨基酸残基的化学修饰及切割实验等。例1镰刀形贫血病患者血红细胞合成了一种不正常的血红蛋白（Hb-S）它与正常的血红蛋白（Hb-A）的差别：仅仅在于链的N-末端第6位残基发生了变化（Hb-A）第6位残基是极性谷氨酸残基，（Hb-S）中换成了非极性的缬氨酸残基使血红蛋白细胞收缩成镰刀形，输氧能力下降，易发生溶血这说明了蛋白质分子结构与功能关系的高度统一性,蛋白质一级结构的个体差异,例2一级结构的局部断裂与蛋白质的激活体内的某些蛋白质分子初合成时，常带有抑制肽，呈无活性状态，称为蛋白质原.蛋白质原的部分肽链以特定的方式断裂后，才变为活性分子.例：胰岛素，在刚合成时，是一个比成熟的胰岛素分子大一倍多的单链多肽，称为前胰岛素原前胰岛素原的N-末端有一段肽链，称为信号肽.信号肽被切去，剩下的是胰岛素原。胰岛素原比胰岛素分子多一段C肽，只有当C肽被切除后才成为有51个残基，分A、B两条链的胰岛素分子单体.,例3同源蛋白同源蛋白：是指在不同有机体中实现同一功能的蛋白质.同源蛋白中的一级结构中有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称为不变残基；其他位置的氨基酸称可变残基.不同种属的可变残基有很大变化.可用于判断生物体间亲缘关系的远近.例：细胞色素C60个物种中，有27个位置上的氨基酸残基完全不变，是维持其构象中发挥特有功能所必要的部位，属于不变残基.可变残基可能随着进化而变异，而且不同种属的细胞色素C氨基酸差异数与种属之间的亲缘关系相关。亲缘关系相近者，氨基酸差异少，反之则多（进化树）.,黄色：不变残基（invariableresidues）蓝色：保守氨基酸（conservativeresidues）未标记：可变残基（variableresidues）,不同生物来源的细胞色素c中不变的AA残基,38个不变的AA残基，是CytC的生物功能所不可缺少的。其中有的可能参加维持分子构象；有的可能参与电子传递；有的