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中国海洋大学 硕士学位论文 氨氧化细菌的分子生物学检测方法及应用 姓名：盛蕾蕾 申请学位级别：硕士 专业：环境科学 指导教师：白洁 20070601 氨氧化细菌的分子生物学检测方法及应用研究 摘要 自然状况下的化能无机自养氨氧化细菌具有生长速率低、生物量小和对环境 因子敏感等生理特点，因此传统的M P N - G r i e s s 计数法限制了对海洋氨氧化细菌 的进一步研究。本研究同时采用传统的M P N G r i e s s 计数法与新兴的分子生物学 定量检测方法F I S H 法与M P N P C R 法对胶州湾表层沉积物中氨氧化细菌数量进 行检测，旨在建立快速、准确的海洋氨氧化细菌数量研究的生物学测定方法。此 外，本实验采用已优化的F I S H 法与P C R D G G E 技术对长江口临近海域表层沉 积物中氨氧化细菌生态特征进行了研究。 为保证检测结果的准确性，本文首先通过正交实验筛选F I S H 法最佳实验条 件与P C R 扩增最佳的反应体系。研究显示荧光原位杂交( F I S H ) 技术在检测海 洋环境中氨氧化细菌的最佳实验条件为：热固定2 h ，乙醇脱水3 m i n ，杂交温度 4 6 。C ，杂交时间2 h ，洗脱液中N a C I 浓度为4 0 m m o l L 。P C R 扩增的最佳反应体 系确定为：模板D N A 2 9 l ，a m o A 基因引物0 9 9 m o l L ，d N T P s0 1 5 m m o l L ，M g C l 2 1 5 m m o l L ，T a g 酶1 5 U ，复兴温度5 5 。 比较M P N G r i e s s 法、F I S H 法与M P N P C R 法这三种定量检测法检测结果显示， 分子生物学方法比传统的M P N G r i e s s 法更快捷、准确。且F I S H 技术相对于 M P N P C R 法，更适宜近岸氨氧化细菌数量分布特征及环境作用研究，但由于F I S H 法在贫营养区不能准确检出氨氧化细菌数量，因此可以在这类海区采用以F I S H 法为主、M P N - P C R 法为辅的氨氧化细菌定量测定方法，以保证氨氧化细菌数量 检测结果的可靠性和完整性。 此外，本文采用现场调查与分子生物学检测技术( F I S H 与P C R - D G G E ) 相 结合的方法对长江口临近海域表层沉积物中氨氧化细菌生态特征进行了研究。研 究显示氨氧化细菌数量分布具有河口高，离岸低，沿长江入海口向外逐渐减少的 趋势。此外，长江口临近海域的氨氮浓度对氨氧化细菌有明显影响；该海区的氨 氧化细菌生物多样性指数平均为0 7 8 ，该指数与温度、盐度、N H 4 + - N 、N 0 3 N 以及硝化速率等均存在显著的相关性；结合长江口临近海域氨氧化细菌的同源性 与其它区域存在较大差异，表明不同种群的氨氧化细菌在氮循环中发挥的作用不 相同。 关键词：氨氧化细菌F I S HM P N P C RP C R - D G G E 长江口生物多样性 A p p l i c a t i o nS t u d yo f T h eM o l e c u l a rB i o l o g i c a lM e t h o d sf o r A m m o n i a - O x i d i z i n g B a c t e r i a A B S T R A C T C h e m o l i t h o a u t o t r o p h i ca m m o n i a - o x i d i n gb a c t e r i a h a v em a n yu n f a v o r a b l e p h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ，n a m e l y , s l o wg r o w t h ，s m a l lb i o m a s sa n ds u s c e p t i b l et o e n v i r o n m e n t a lf a c t o r s T r a d i t i o n a lm e t h o do f M P N G r i e s sr e s t r i e tt h es t u d yo f m a r i n e a m m o n i a - o x i d i n gb a c t e r i a I no r d e rt og a i nf l e e t l ya n de f f e c t i v e l ym e t h o df o r d e t e c t i n ga m m o n i a - o x i d i z i n gb a c t e r i aq u a n t i t yi nm a r i n es a m p l e , w e 嘴t h r e e m e t h o d so ft r a d i t i o n a lM P N G r i e s sa n dm o l e c u l a rb i o l o g i c a lm e t h o d so ff l u o r e s c e n c e i ns i t uh y b r i d i z a t i o n ( F I S H ) a n dM P N - P C Rd e t e c tt h ea m m o n i a - o x i d i n gb a c t e r i a ( A O B ) b i o m a s si ns e d i m e n t so fJ i a o z h o uB a y A n dw ea d o p tF I S Ha n dP C R - D G G Et o i n v e s t i g a t eC h a n g j i a n g A d j a c e n tS e aA r e aA O Bd i s t r i b u t i o na n db i o l o g yd i v e r s i t y I nt h i s s t u d yw ef i r s tu s eo r t h o g o n a lt e s tt oo p t i m i z ec o n d i t i o n so fm o l e c u l a r b i o l o g i c a lm e t h o df l u o r e s c e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o na n dP C Rr e a c t i o n s T h e F I S Ho r t h o g o n a lt e s ts h o wt h a tt h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o r s a m p l e p r e p a r a t i o na r eh e a t f i x i n gt i m eo f2 ha n de t h a n o l d e h y d r a t i o nt i m eo f3 m i n T h e o p t i m i z e dc o n d i t i o n sf o rd e t e c t i n ga m m o n i a - o x i d i z i n gb a c t e r i ai n c l u d eah y b r i d i z e d t e m p e r a t u r eo f 4 6 C ，ah y b r i d i z e dt i m eo f 2 h , a n dc o n c e n t r a t i o no f 4 0 m m o l L N a C Ii n h y b r i d i z e ds o l u t i o n A n dt h eo p t i m a lP C Rr e a t i o n sa r e2 u lD N A t e m p l a t e , 0 9 r a Mp r i m e r , 0 1 5 r a M d N T P s ，1 5 m M M g C l 2 ，1 5 U T a g D N A p o l y m e r a s e a n dr e - d e n a t u r a t i o n t e m p e r a t u r e 5 5 。 C o m p a r e i n gt h e s et w om o l e c u l a rb i o l o g i c a lm e t h o d s ，M P N - P c Rm e t h o dh a v e o p e r a t i n gf u s s i l ya n du n f l t i n gf o rm a n ys a m p l e ss y n c h r o n o u s l ya n a l y s i s S ot h e m e t h o do ff l u o r e s c e n c ei n s i t uh y b r i d i z a t i o ni ss u i t a b l ef o rm a r i n ea m m o n i a - o x i d i n g b a c t e r i aq u a n t i t yd e t e c t i n gi nA d j a c e n tS e aA r e ab a c t e r i ad i s t r i b u t i o na n a y s i s I nt h i ss t u d yw ea d o p ts p o ts u r v e ya n dm o l e c u l a rb i o l o g i c a lm e t h o d ( F I S Ha n d P C R D G G E ) t oi n v e s t i g a t eC h a n g j i a n gA d j a c e n tS e aA r e aA O Bd i s t r i b u t i o na n d i i i b i o l o g yd i v e r s i t y T h es t u d ys h o wt h a ta m m o n i a - o x i d i n gb a c t e r i aq u a n t i t yd i s t r i b u t i o n i nC h a n g j i a n gA d j a c e n tS e aA r e ah a v ed e c r e a s i n gt e n d e n c yf r o m 嚣R l a l yt oo u t s i d e N I - - h + - Na n dn i t r i f y i n gv e l o c i t yh a v eo b v i o u s l yi n f l u e n c e A m m o n i a - o x i d i n gb a c t e r i a K e y w o r d s ：A m m o n t a - o x i d i n gB a c t e r i a F I S HM P N - P C RP C R - D G G E C h a n g j i a n gE s t u a r yB i o d i v e r s i t y 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 适；壅旦邃直墓位置薹赞剔直盟的! 查拦互窒2 或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：蝣蚕签字同期：刁年苫月，闩 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后 适用本授权书) 学位论文作者签名；菇着菩 导师签字： 签字日期：寸年彳月，I ：J 签字同期； 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 佃西 诹6 月，f 同 电话； 邮编 氨氧化细菌的分子生物学检测方法及应用研究 0 前言 近几十年来，氮富营养化以及由此引发的赤潮问题是海洋尤其是近岸和河口 区域面临的主要环境问题之一。氨氮是海水中重要的污染物，许多氨氮复合物对 鱼类和某些水生生物具有毒害作用“。硝化细菌中的氨氧化细菌经氨氧化作用将 水相和沉积物中的N H 4 + 氧化为N 0 2 。，再经亚硝酸氧化细菌氧化成N 0 3 。，从而降 低N H 4 + 的毒性；其中氨氧化细菌催化的氨氧化作用是硝化作用的限速步骤。1 。 长江口作为世界十条大河之一长江的入海口，是一个受人类活动影响较大的 河口，该河口的研究得到世界各国科学家的关注。长江口水域富营养化日趋严重， 赤潮频繁，近年来每年都有面积达数千平方公里的原甲藻赤潮发生，这可能与长 江氮的输送密切相关哪。有关长江氮的研究已经引起广泛关注。因此研究该海区 氨氧化细菌群落数量变化与群落结构分布对于了解和预测氨氮变化趋势均具有 重要意义。 近年来，利用现代分子生物技术研究海洋硝化细菌的数量变化与种群结构正 成为研究的热点。本文主要就海区氨氧化细菌的检测方法进行研究。并对F I S H 技术与P C R 技术对海洋氨氧化细菌的检测条件作进一步的研究。此外本文还采 用已优化的氨氧化细菌定量检测法F I S H 法与变性梯度凝胶电泳( P C R - D G G E ) 技术研究长江入海口及其临近海域中表层沉积物的氨氧化细菌的生态分布特征。 这些对于了解和预测长江口氨氮变化趋势以及揭示富营养化产生机制均具有重 要意义。 氨氧化细凶的分子生物学检测方法及麻川研究 1 、综述 1 1 氨氧化细菌概述 在自然界中氮素循环中，化能无机自养氨氧化细菌( a m m o n i a - o x i d i z i n g b a c t e r i a ) 起到非常重要的作用。它能通过氨氧化作用将氨转化为亚硝酸盐，产 生的亚硝酸盐再通过亚硝酸盐氧化细菌的硝化作用转化为硝酸盐。 1 1 1 氨氧化细菌的分类 目前从系统发育的角度，从系统发育的角度，氨氧化细菌( 又称亚硝化细菌) 分为三种类群，分属于p r o t e o b a c t e r i a 的y 和卢亚类。其中只有亚硝化球菌属 ( N i t r o s o c o c c u s ) 属于p r o t e o b a c t e r i a 的y 亚类，代表种：海洋亚硝化球菌 ( N i 抑o s o c o c c u so c e a n i ) 和嗜盐亚硝化球菌( N i t r o s o c o c c u sh a o l p h i l u s ) 。亚硝化 单胞菌属、亚硝化螺菌属和亚硝化叶菌属属于p r o t e o b a c t e r i a 的口亚属“1 。 p r o t e o b a c t e r i a 的口亚类中共有1 4 种：N i t r o s o s p i r ab r i e n s i s , N i t r o s o v i b r i ot e n u i s , N i t r o s o l o b u am u l t i f o r m i s N i t r o s o m o n a ss p e c i e s ( 1 。1 1 1 1 1 ) N i t r o s o m o n a se u r o p a e a , N i t r o s o m o n a se u t r o p h a , N i t r o s o m o n a sh a l o p h i l a ，N i t r o s o m o n a su r e a eN i t r o s o m o n a s o l i g o t r o p h a , N i t r o s o m o n a sm a r i n a , N i t r o s o m o n a sa e s t u a r i i , N i t r o s o m o n a sc o m m u n i s ， N i t r o s o m o n a sn i t r o s a , N i t r o s o m o n a sc r y t o l e r a n s 初N i t r o s o c o c c v z sm o b i l i s 等。 表1 1 氨氧化细菌的种属特征 ， T a b l e l 1C h a r a c t e r so f a m m o n i a - o x i d i z i n gb a c t e r i ag e n e r a 氨氧化细菌的分子生物学检测方法及应用研究 1 1 2 氨氧化细菌的特征 氨氧化细菌的主要特征如下m ： 氨氧化细菌是专性化能的自养菌，其几乎都不能在有机培养基上生长，也 不需要外源生长因素。对底物的要求非常专一，氨氧化细菌以氨作为能源。 氨氧化细菌的所有种类均生长缓慢，平均世代在1 0 小时( 8 h 几天) 以 上。 无芽孢，都是G 细菌。 对溶解氧、温度、p H 等外界因素的变化反应灵敏，易受外界环境的影响 1 1 3 氨氧化细菌在自然界中的作用 在自然界的氮循环中起着非常重要的作用，它与亚硝酸氧化细菌一起可以通 过硝化作用把氨氧化成为硝酸盐( 如图1 1 所示) ，是氮的生物地球化学循环中 不可或缺的一环伽。 图1 - 1 自然界氮素循环 T a b l e1 - 1 N i t r o g e nc y c l ei nn a t u r e 氨氧化细菌的分子生物学检测方法及应用研究 硝化作用一般由两个阶段组成，第一阶段把氨氧化为亚硝酸盐，有氨氧化细 菌完成； N I - I , + + 3 20 2 1 兰竺! - N 0 2 + 2 矿+ H 2 0 + ( 2 4 2 7 3 5 1 4 ) 1 0 3 焦耳 第二阶段把亚硝酸盐氧化为硝酸盐，由亚硝酸盐氧化细菌( 硝酸细菌) 完成： N 0 2 。+ 3 ，20 2 1 1 1 兰! ! N 0 3 + ( 6 4 4 8 6 2 ) x 1 0 3 焦耳 释放出的能量部分用于还原C 0 2 ，合成细胞物质。 1 1 4 影响氨氧化细菌生长的环境因子 由于氨氧化细菌的化能自养的特殊性，导致其易受外界因素的影响，其影响 因子主要有以下几点： 1 1 A 1 溶解氧( D o ) 硝化细菌正常代谢需要溶解氧，每毫克氮素经过整个硝化作用途径后，由氨 转交为硝酸根，最大需要4 5 7 毫克溶解氧来“清除”含氮物质释放的电子删。 M i c h a e lI CS t e n s t r o m 与R i c h a r d A P o d u s k a 在总结大量文献的基础上，通过对 各种因素及双底物限制动力学进行分析，认为D O 浓度与硝化细菌的动力学关系 主要是由于双底物限制动力学有关，并得出结论：在较高的平均细胞停留时间 ( M C R T ) 的条件下，D O 浓度为0 5 1 0 m g L 就可完成硝化作用，M C R T 较低时， 完全硝化则需要相对高的D O 浓度；而能够发生硝化作用的最低D O 浓度约为 0 3 m g L 。H a n a k i ，K 等通过实验发现，低的D O 不会对氨的氧化产生影响，因 为在低的D O ( 0 5 m g L ) 条件下，氨氧化细菌的生长量会增加，恰好补偿了 D O 太低引起的氨氧化速率的降低；而低的D O 会大大地抑制亚硝酸盐的氧化作 用，因为亚硝酸盐氧化菌的生长量未增加，不能补偿由D O 过低引起的亚硝酸盐 氧化速率的降低“1 。我国的王歆鹏、陈坚等也发现低的D O ( 0 8 m g L ) 会对 亚硝酸氧化细菌的生长酶系产生抑制作用，而对氨氧化细菌的生长酶系则会起到 促进的作用”1 。但最近，有研究表明当系统处于无溶氧存在的情况下，硝化细菌 能靠将亚硝酸或硝酸作为电子受体来代替氧维持呼吸作用和新陈代谢。一简而 言之，溶解氧的不足能破坏氨氧化菌和亚硝酸氧化菌之间的生化平衡。氨氧化菌 在低溶氧的条件下，会产生高能态的中间产物一羟氨，而羟氨的存在又破坏甚至 4 氨氧化细菌的分子生物学检测方法及应用研究 中止了亚硝酸氧化菌的活性，缩短了硝化反应的历程，即导致短程硝化。 1 1 4 2 温度 温度对氨氧化细菌的生长和氨氧化速率有较大的影响。一般的氨氧化细菌是 中温生长菌，其适宜的温度范围为2 0 3 0 C 。若温度低于l O 以下，氨氧化细 菌的生长及氨氧化作用显著减慢。若温度高于3 5 C ，则对氨氧化细菌的酶系具 有破坏作用，氨氧化细菌的生命将受到潜在的威胁。氨氧化细菌能承受的最高温 度的上限为4 0 C 叭。氨氧化细菌的一般培养建议在2 0 3 0 C 为宜。 1 1 4 3 酸碱度( P H ) 氨氧化细菌的最佳p H 范围为7 8 8 0 。氨氧化细菌的生长缓慢，若p H 6 5 时，其生长将受到抑制。到p H 6 0 时，氨氧化作用就会停止。 p H 值和温度决定了非离子态氨在总氨氮中的比例，非离子态氨对于氨氧化 细菌具有微量的毒性作用。当非离子态氨的浓度达8 m g L 时，就能对氨氧化细 菌产生抑制 ”1 。 除了能适应其周围的p H 环境外，氨氧化细菌还能应付相当大范围内的p H 动态瞬便值。当然，当它们被驯化后，为了保持其活性，应该维持p H 的稳定性。 1 1 4 4 有机物 氨氧化细菌属于典型的自养细菌，有机物对于氨氧化细菌是否具有毒害作用 是人们普遍争论的问题。近年来，越来越多的研究表明，有机物对氨氧化细菌的 影响并非是具有毒害作用，更为可能的是有机物的存在刺激异养细菌迅速生长， 从而与氨氧化细菌竞争溶解氧、氨和微量营养物质，使得氨氧化细菌的生长受到 限制，而有机物本身并不直接影响氨氧化细菌的生长与氨氧化作用。H a n a k i 也 认为有机物导致硝化作用的降低不是直接的毒害作用的结果，他认为原因有二： 一是异养菌的同化作用导致氨的减少；二是异养细菌细胞的凝聚体会对氨的氧化 作用产生抑制作用。二者的共同作用导致了氨氧化作用的降低。 氨氧化细菌的分子生物学检测方法及应用研究 1 1 4 5 渗透压 氨氧化细菌能承受渗透压的范围相当的广，从淡水到海水，都有其相应的种 属。有一个盐度转变到另一个盐度时，多数氨氧化细菌能快速适应，且其活性几 乎不变“1 。 1 1 4 6 光照 氨氧化细菌对近紫外波段很敏感，其原因可能是与细胞膜上的氧产生超氧化 物游离基有关，但对于这一波段的光对氨氧化细菌产生负面影响的确切原因尚未 发掘。对于那些受光照影响的氨氧化细菌，应及时的将其转移到暗区，并提供足 量的供能物质，大约需要几个小时它们才能修复峨嘲 1 1 4 7 抑制剂 很多化学物质能对氨氧化细菌产生抑制作用，如：A T U ( 烯丙基硫脲) 、乙 炔、重金属、金属鳌合剂( 尤其是与铜鳌合的) 、二硫化碳、游离氮、2 氯6 三 氯甲基吡啶( N i t r a p y r i n ) 等n 6 。 1 1 4 8 共代谢 催化氨氧化细菌反应的是氨单加氧酶( a m m o n i am o n o o x y g e n a s eA M O ) ，它 与甲基营养菌的甲烷单加氧酶( m e t h a n e m o n o o x y g e n a s eM M O ) 极其相似m “”。 M M O 能催化氧化已分解的碳氢化合物，包括卤代烃类o ”。最近一些研究成果表 明A M O 也具有类似的功能，它能够通过共代谢的途径氧化其它非氨底物“”。有 人估计，氨氧化细菌能以共代谢的途径降解其每F I 耗氧量十分之一的碳氢化合物 【6 】 1 2 氨氧化细菌定量检测方法的研究 1 2 1M P N - G r i e s s 法在氨氧化细菌定量检测中的应用 由于氨氧化细菌是一种化能自养细菌，在琼脂平板上不易生长，不适用平板 6 氨氧化细菌的分子生物学检测方法及应用研究 菌落计数法，所以传统方法一般采用M P N G r i e s s 法( 最大可能数法C , r i e s s 试剂检 测法1 溉2 1 o M P N 法又称稀释频度法，采用G - r i e s s 试剂检测N 0 2 。M P N C , r i e s s 法的具体 做法是：先将样品进行一系列1 0 倍稀释，然后在装有氨氧化细菌培养基的多个 试管中加入一定量的不同稀释倍数( 每个稀释倍数3 5 管) 的待测样品稀释液进 行培养，经过一定时间的培养，对培养后试管中的培养液用G r i e s s 试剂进行检测。 对于氨氧化细菌而言，培养后有N 0 2 。积累的试管，表明有氨氧化细菌生长，为 阳性管。以不出现阳性管的稀释度为临界计数，根据不同稀释倍数阳性管的数量， 按照统计学方法计数出氨氧化细菌的数量。 作为一种使用最为广泛的传统的氨氧化细菌计数检测方法，M P N G r i e s s 法存 在一些缺陷，如：由于在自然环境中氨氧化细菌常常是聚集生长，因此，将待测 样品充分分散，就显得尤为重要。如果分散工作没有做好，必然导致氨氧化细菌 检测结果的偏低。而待测样品( 尤其是活性污泥或生物膜样品) 的充分分散在实际 操作时往往难以做到。 研究表明，可培养的氨氧化细菌仅占自然环境中氨氧化细菌中很小的一部 分，大部分的自然环境中存在的氨氧化细菌是不可培养的。这些不可培养或在所 用的计数培养基中不易生长的氨氧化细菌、或处于休眠不活跃状态的氨氧化细 菌，它们在计数培养时可能无法大量繁殖，它们无法在计数培养基中产生足够的 可供化学检测的生物量，而导致致氨氧化细菌M P N - C , - r i e s s 计数法的检测结果低 于样品中实际存在的氨氧化细菌数量啪“1 。另外，在氨氧化细菌的M P N G r i e s s 检测时，部分文献报道中都提到了当G r i e s s 试剂加入后如果不显红色，还需要加 入锌粉，而后再加入G r i e s s 试剂进行检测，以防止样品中的亚硝酸氧化细菌将氨 氧化细菌的氧化产物N C h - 全部氧化为N 0 3 。，而造成的假阴性【2 ”。 ，当然M P N - C _ , r i e s s 法作为一种传统计数检测方法，只能检测氨氧化细菌总数， 而不能将氨氧化细菌的不同种类分别进行检测。 综上所述，传统的氨氧化细菌M P N G r i e s s 计数法简单，操作容易，对仪器 设备和操作人员的要求较低，但测定时间长，检测结果偏低。 氨氧化细菌的分子生物学检测方法及应用研究 1 2 2 分子生物技术在氨氧化细菌定量检测中的应用 由上文中提及的问题显示，用传统的研究方法很难对氨氧化细菌进行更进一 步的深入研究，必须采用新的试验方法，才能对自然坏境、污泥、生物膜中的氨 氧化细菌进行更进一步的研究，而迅猛发展的分子生物学技术正为此提供了良好 的工作基础和方法“瑚。 目前利用分子生物学方法对氨氧化细菌菌群的研究在国外己得到相当广泛 应用酬，但在国内的报道还相对很少。下面对日益广泛使用的F I S H 技术以及 P C R 技术在硝化细菌快速检测中的应用进行一些介绍。 1 2 2 1 荧光原位杂交( F I S H ) 技术 荧光原位杂交( F l u o r e s c e n ti ns i mh y b r i d i z a t i o n ，F I S H ) 技术是近年来生物学领 域发展起来的一项新技术，其运用的是细胞遗传学和分子生物学原理，目前己广 泛地应用于遗传疾病和肿瘤研究、临床诊断、环境检测等领域嘲3 。 1 9 5 3 年，W a t s o n 和C r i c k 提出了D N A 双螺旋结构学说：D N A 分子是由两条 反向平行的多脱氧核苷酸链组成，两条链上的碱基必须是腺嘌呤( A ) 与胸腺嘧啶 C r ) ，鸟嘌呤( G ) 和胞嘧啶( C ) 配对。A 与T 之间以2 个氢键连接，而G 与C 之间 以3 个氢键连接。D N A 这一线性的高分子化合物靠一些非共价键折叠形成三维 空间构象。这些非共价键都是比较弱的键，键能低，易在外力的作用下断裂，导 致空间结构的破坏，使有规律结构的D N A 变成不规则的线团。这个过程称为 D N A 变性。变性的D N A 是单链的，变性的程度与温度有关。 变性的D N A 在一定条件下可恢复成原来的结构，这一过程称为复性，或退 火。复性后两条单链又重新按照碱基互补的原则结合，形成双螺旋结构。两条 D N A 单链之间能否复性，并不取决于这两条单链是否同源，而取决于它们的碱 基顺序是否互补。如果两条来源不同的D N A 单链具有互补的碱基顺序，也同样 可以复性，形成一个杂交体。这个过程称为杂交，或分子杂交。分子杂交不仅可 以发生在两条D N A 单链之间，而且也可以发生在具有互补碱基的D N A 和R N A 片段之间，或R N A 与R N A 片段之间。 氦氧化细菌的分子生物学检测方法及应用研究 原位杂交是以标记的D N A 或R N A 为探针，在原位检测细胞内特定的D N A 或R N A 序列。其基本原理是含互补顺序的标记D N A 或R N A 片段，即探针，在 适宜的条件下与细胞内特定的D N A 或R N A 形成稳定的杂交体。根据所用的探 针和靶核酸的不同，原位杂交可分为D N A q A 杂交，D N A R N A 杂交， R N A R N A 杂交三类。根据探针的标记物是否被直接检测，原位杂交可分为直接 法和间接法两种。直接法原位杂交，探针与细胞内靶核酸所形成的杂交体不经免 疫组织化学( i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y ) 反应便可直接显示。而间接法一般都用半抗原 标记探针，探针与细胞内靶核酸所形成的杂交体则通过免疫组织化学反应对半抗 原的定位间接地显示。 F I S H 技术是直接原位法杂交，利用带有荧光标记的探针与固定在玻片或纤 维膜上的组织或细胞中特定的核苷酸序列进行杂交，而无需单独分离出D N A 或 R N A ，探测其中所具有的同源核酸序列，结果可直接在荧光显微镜下观察。探针 的灵敏度可达到1 0 2 0 个m R N A 拷贝c e l l 啪1 。目前使用的核酸探针主要有c D N A ， c R N A 和寡聚核苷酸探针等，其各自的优缺点见表1 2 所示。 表I - 2c D N A 。c R N A 和寡聚核苷酸探针的优缺点 探针种类优点缺点 9 氨氧化细菌的分子生物学检测方法及应_ H j 研究 传统研究氨氧化细菌的方法是将氨氧化细菌从环境培养中富集、分离，然后 主要从形态学的角度加以分类、鉴定。由于任何一种培养基都具有一定的选择性， 使得亚硝化单胞菌属( N i t r o s o m o n a s ) 某些菌株超过了其它氨氧化细菌，在培养基 中处于竞争优势o ”。因而，传统方法研究氨氧化细菌主要集中在欧洲亚硝化单胞 菌( N i t r o s o m o n a se u r o p a e a ) 。然而，随着分子生物学技术引入微生物生态学，使 得对环境样品中的更多的氨氧化细菌进行定性、定量研究成为可能啪1 。在分析比 较1 6 Sr R N A 序列的基础上，已经人工设计、合成了氨氧化细菌特异性的P C R 引物和寡核苷酸探针。F I S H 技术就是利用氨氧化细菌特异性的靶寡核苷酸探针， 在原位检测水环境或生物膜上的氨氧化细菌时，不仅能对它们定性地检测，而且 还能定量地反映出环境中氨氧化细菌的分布和“丰度”，为研究硝化系统中氨氧 化细菌类群的空间和数量分布提供了有效的检测手段。 F I S H 技术在国外，尤其在德国、荷兰己被广泛应用于硝化细菌的快速检测 中。德国的W a g n e r 等是较早将F I S H 技术应用于硝化细菌检测的研究者，他们 研究了一套比较完善的对硝化细菌检测的F I S H 技术，被后人广泛地应用于活性 污泥系统、生物膜、硝化流化床反应器及各种水环境中”。利用了F I S H 技术 对活性污泥中的硝化细菌进行鉴定和计数，。避免了传统的、用培养方法计数带来 的偏差。他们认为F I S H 技术能揭示更多硝化细菌的微生物学方面的信息及它们 种群的大小，更有利于提高、改进生物脱氮系统的工艺。并且开发了一种对硝化 细菌快速定量检测的方法，只需要3 5 天。他们实验的结果与理论是完全吻合 的。而且利用荧光共焦显微镜来对活性污泥中的氨氧化菌在絮体中的空间分布进 行分析啪3 。V o y t e k 等研究了3 种检测B o n n e y 湖中硝化细菌丰度的方法：P c R ( 聚 合酶链式反应) 、I F A ( 荧光免疫抗体法) 、F I S H ( 荧光原位杂交法) 。P C R 用于鉴定 P r o t e o b a c t e r i a p 和Y 亚属的氨氧化菌。I F A 和F I S H 用于检测氨氧化菌的相对丰度。 他们利用F I S H 技术与化学方法检测的A O B 在B o n n e y 湖中的分布状态基本一致 “们 由此可见，在F I S H 是一项具有重要应用价值的分子生物学检测技术。F I S H 技术对环境中可显微镜观察但不可培养的微生物，如氨氧化细菌，是一种有效、 可行的检测方法。它能将单种细菌从复杂的菌群背景中检测出来，并加以定量且 1 0 氨氧化细菌的分子生物学检测方法及应用研究 对基于非培养的原位杂交法更显示出其优越性。来自于自然界、反应器系统或实 验室富集培养基中的样品，与带有荧光标记的寡聚核苷酸探针杂交，通过荧光原 位杂交可以把一个样品中是否有特定的微生物种类的细胞染色成一定的荧光观 察其在自然状态下的数量与分布特点。根据探针序列的不同，特异性探针与相应 的靶核糖体结合，能鉴定到科、属、种。F I S H 所需时间很短，最快的时候只需 要几个小时。 1 2 2 2M P N - P C R 法在氨氧化细菌定量检测中的应用 聚合酶链式反应( P o l y m e r a s eC h a i nR e a c t i o n , P C R ) 技术，是一种在体外模拟天 然D N A 复制过程，快速扩增特异性D N A 序列的技术。P C R 技术的特异性依赖 于两个寡核苷酸引物，基本点是重复利用扩增引物，以扩增的目标序列为模板， 在D N A 聚合酶作用下进行体外目标序列的合成。P C R 的反应包括三个主要步骤， 分别是：高温变性( D e n a t u r a t i o n ) 、低温退火( A n n e a l i n go f p d m e r s ) 、中温引物延 伸( E x t e n s i o no f p r i m e r s ) ，每组三个反应称为一个P C R 循五J ；( P C Rc y c l e ) 。所谓变 性即是将D N A 加热变性，在高温下使靶序列双链解离成单链D N A 作为复制模 板：而退火则是在低温下一定时间令两个引物分别结合到靶序列D N A 两条链的 3 末端，互补结合成一段新的D N A ；最后在D N A 多聚酶的催化下，以四种脱氧 单核苷酸( d N T P ) 为原料，引物延靶D N A 3 末端向5 末端延伸形成两条互补的新 链。如此三种温度反复循环，并且前一循环的产物作为后一循环的模板，每一循 环使特异区段的D N A 拷贝数放大一倍，使靶序列呈指数倍进行扩增。 最大可能数P C R ( M P N P C R ) 法是将P C R 技术与M P N 法结合起来对细菌 进行定量检测的方法“”。通过稀释阳性样品直至靶基因不能再扩增为止，根据出 现的阳性结果查M P N 表计算样品中氨氧化细菌的数量。该法由于P C R 技术扩增 的高效性和特异性，特别是所需要的模板微量，使得人们可以不必花费更多的时 间用于氨氧化细菌的分离和培养，直接获得少量D N A 模板就可以从分子水平上 研究氨氧化细菌，达到快速简便检测氨氧化细菌的目的。 D e g r a n g e 等( 1 9 9 5 ) 利用P C R 对N i t r o b a c t e r l 6 Sr R N A 基因片段进行扩增，检测 土壤中的硝化细菌并结合M P N 法( M P N P C R ) 对细菌数目进行了计数研究，将 氨氧化细菌的分子生物学检测方法及应用研究 计数结果与传统的M P N C - r i 鹤s 计数法和荧光抗体计数法比较，M P N o P C R 法可 以检测到更微量的硝酸细菌0 0 0 个g 土壤) ；对M P N P C R 法计数效率的研究发 现，随着接种到土壤中的硝化细菌的数目的增多，M P N P C R 计数效率也随之升 高，在实验中，对接种了1 0 2 个硝化细菌的土壤样品的M P N P C R 计数效率为 6 5 ，而对接种了1 0 3 个硝化细菌样品的计数效率则为7 2 。D e g r a n g e 等( 1 9 9 8 1 又利用M P N P C R 法对针叶林土壤中的硝化细菌进行计数，以研究土壤中硝化反 应与硝化细菌数量之间的关系“”。明镇寰等( 1 9 9 9 ) 利用M P N P C R 法对镇海炼化 生物硝化池活性污泥中硝化细菌进行定量检测获得了较满意的结果，研究发现利 用M P N P C R 法测定到的硝化细菌的数量比M P N - C _ n i e s s 法要高1 0 倍左右，而且 利用此方法可以大大缩短计数时间“3 1 。张伟等( 2 0 0 2 ) 利用M P N - P C R 法检测生 物硝化池中硝化细菌富集前后数量，研究显示M P N - P C R 法完全满足对生物硝化 池中的硝化细菌进行及时监控的需要洲。 1 2 3 分子生物技术在氨氧化细菌种群结构分析中的应用 P C R 技术结合其他技术如R A P D 、R F L P 、A F L P 、D G G E 等对被扩增序列作 定性或定量研究分析微生物群体结构H 4 1 。 P C R - R A D P ( r a n d o m l ya m p l i f i e dp o l y m o r p h i cD N A ) 是采用那些对某一特定基 因的非特异性的引物来扩增某些片断。该法操作简便，引物实用性广，对于结果 准确性要求比较不高以及亲缘关系近的种属有较高的可信度；广泛应用于分子多 态的检测中，适用于分析混合微生物的各种生物反应器中微生物多样性，通过比 较得到的基因组指纹图谱，可以比较不同时间段或不同工艺条件下微生物种群的 变化，但此方法还不能分析群落的生物多样性“4 1 。 P C R - R F L P ( R e s t r i c tF r a g m e n tL e n g t hP o l y p h o r i s m ) 限制性片断长度多态性是 较早的基于D N A 的分子标记技术，能检测酶切位点因D N A 插入、重排或缺失 造成的长度差异，具有很高的分辨率，结果的重复性和准确性高，在群体遗传和 系统演化领域具有重要的应用价值。不足之处是操作步骤繁琐，有较高的技术要 求。如将P C R 技术和限制性酶切技术结合用来检测P C B 降解基因在环境中的存 在情况，通过对酶切产物的分析，探测该基因的多态性，从而得到不同的污染地 1 2 氮氧化细菌的分子生物学检测方法及应用研究 区降解某物质的微生物的群落的生物多样性m 1 。 P C R - A F L P ( A m p l f i e df i a g m e n t sl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 通过D N A 多聚酶链式 反应扩增基因组D N A 模板产生多态性的D N A 片断。不同的物种基因组D N A 差 异很大，复制特定D N A 序列所需的引物的核苷酸序列也不同。同一引物可能诱 导复制某一品种的D N A 片断，而对另一品种无法诱导。将此引物所诱导的特定 D N A 片断采用P C R 技术进行扩增，然后电泳分离，就可使某物种特定的D N A 出现，而其它物种无此谱带产生。A F L P 集R F L P 和R A P D 的优势为一体，既具 有高的分辨力，准确性和重复性，又克服了R F L P 的繁琐操作，成为遗传多样性 检测和系统分类，基因定位的主要分子标记技术。不足之处是得到的主要是显性， 而非共显性标记“”。 P C R o S S C P ( S i n g l e - s 仃a _ I l d e dc o n f o r m a t i o np o l y m o r p h i s m ) 单链构象多态性对于 碱基置换突变( 点突变) 具有极高的灵敏度，与P C R - R F L P 相比，P C R - S S C P 可以 检测所有的点突变，该方法由O r i t a 等建立，在检测已知突变或未知变异的分析 中十分常用和实用，由于设备配置简单，具有一定的推广价值H 4 1 遗传指纹图技术是指利用P C R 技术扩增标记序列，然后通过一定的电泳、 色谱等技术把扩增产物解析成具有特定条带特征的图谱。一般每个条带可以看作 是一个微生物类群，条带的强度可以反应这个类群的数量的多寡，这样，一个样 品的微生物种群组成就可以通过一组条带组成的图谱( 指纹图) 反应出来。这类技 术也叫“微生物群落指纹图分析技术”( P C R - b a s e x ic o m m u n i t yf i n g e r p r i n t i n