南瓜多糖的提取与分离.doc

O629.1 0708014106 Extraction and Separation of Pumpkin Polysaccharide 分类号分类号 学号学号 密级密级 10722 公开公开 南瓜多糖的提取与分离南瓜多糖的提取与分离 作者姓名作者姓名 指导教师指导教师 学科门类学科门类 提交论文日期提交论文日期 专业名称专业名称 学校代码学校代码 成绩评定成绩评定 崔崔 攀攀 化化 学学 理理 科科 孙孙 家家 娟娟 2011 年年 6 月月 摘要 摘 要 分别使用乙醇乙醚混合液和石油醚处理南瓜粉。然后在 90，固液比 40:1 的条件下 使用传统的热水浸法提取 4 小时，过滤，用甲醇沉淀滤液中的多糖，通过 Sevage 法脱蛋 白，得到精制的南瓜多糖。最后以葡萄糖为标准对照品，使用苯酚硫酸法测定南瓜多 糖吸光度，计算后得到多糖含量。 关键词：关键词：南瓜；多糖；提取；分离 Abstract Abstract Separately using ethanol ether mixture and petroleum ether processing pumpkin powder. Then in 90 , solid-liquid ratio under the condition of chains, the use of traditional hot water leaching extraction four hours, filtering, with methanol precipitation of polysaccharides, through the filtrate Sevage method refined, get off protein pumpkin polysaccharide. Finally with glucose for standard reference substance, the use of phenol hydrate-sulfuric determination - pumpkin polysaccharide absorbency, calculated get polysaccharide. Key words：Pumpkin; Polysaccharide; Extraction; Separation 目录 目目 录录 摘摘 要要.I 前前 言言.1 1 文献综述文献综述.2 1.1 南瓜介绍.2 1.1.1 南瓜的生物特性.2 1.1.2 南瓜的营养价值.2 1.1.3 南瓜多糖的组成及性状.2 1.1.4 南瓜多糖的应用前景.2 1.2 南瓜多糖组成的研究方法.3 1.2.1 南瓜多糖提取方法.3 1.2.2 除蛋白.3 1.2.3 多糖的分析方法.4 1.3 拟采取研究方法.4 2 实验部分实验部分.5 2.1 药品试剂与仪器设备.5 2.1.1 药品试剂.5 2.1.2 仪器设备.5 2.2 南瓜多糖的提取.5 2.2.1 南瓜的脱脂.5 2.2.2 南瓜多糖的提取.5 2.2.3 粗多糖的纯化.6 2.2.4 待测液的配制.6 2.3 苯酚硫酸法测多糖含量.6 2.3.1 测定方法.6 2.3.2 葡萄糖标准液的配制及测定.6 2.3.3 样品溶液的测定.6 2.3.4 多糖含量计算.6 3 结果与讨论结果与讨论.7 3.1 结果.7 3.1.1 最大吸收波长的确定.7 3.1.2 标准工作曲线的绘制.8 3.1.3 样品的测定结果.8 3.1.4 南瓜多糖的提取率.8 3.2 讨论.8 目录 结结 论论.9 致致 谢谢.10 参考文献参考文献.11 南瓜多糖的提取与分离 - 1 - 前前 言言 南瓜，俗名倭瓜、番瓜、北瓜。原产亚洲南部（另一说为中南美洲） ，很早以前就传 入我国，因而有“中国南瓜”之说1。南瓜在我国广泛栽种，其果实可食用，既当菜又当 粮，在农村很受欢迎。近年来，人们发现南瓜不但可以充饥，而且还有一定的食疗价值， 于是土味十足的南瓜得以登大雅之堂。 南瓜多糖是南瓜中重要的活性成分，是从南瓜中提取得到的一种水溶性杂多糖，主 要由 D半乳糖、葡萄糖、L阿拉伯糖、木糖和 D葡萄糖醛酸等组成。南瓜多糖具有 调节免疫，促进核酸与蛋白质的生物合成，控制细胞分裂和分化，调节细胞的生长与衰 老等功能，对提高肌体免疫力具有重要的作用2,3,。南瓜多糖可广泛应用于医药、保健品 及功能食品，作为绿色生物医药产品，具有非常广阔的市场前景4,5。 目前植物多糖的提取方法有热水浸提取法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法、 醇提取法以及生物酶提取法6。热水浸是多糖提取的传统方法，此法操作最为简便。 分析方法应用广泛的是苯酚硫酸法、蒽酮法等。苯酚硫酸法是利用多糖在硫酸 的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物， 再以比色法测定吸光度。由于苯酚硫酸法简便，仪器、试剂易得，因此是最常用的多 糖测定方法之一。 咸阳师范学院 2011 届本科毕业设计（论文） - 2 - 1 文献综述文献综述 1.1 南瓜介绍南瓜介绍 1.1.1 南瓜的生物特性南瓜的生物特性 南瓜，俗名倭瓜、番瓜、北瓜等，是葫芦科、南瓜属中叶片具有白斑、果柄五棱形 的一年生双子叶草本植物，茎长达数米，节处生根，粗壮。单叶互生，叶片心形或宽卵 形。花单生，雌雄同株异花。花冠钟状，黄色。种子卵形或椭圆形，灰白色或黄白色， 边缘薄7。世界各地均有栽培。南瓜可食用部分达到 80%以上，它皮薄肉厚，味道甜美， 既可作为蔬菜食用，又能长期储存以代替粮食，是一种救荒佳品。近年的食疗和药用价 值十分可观，它几乎全身都可作药用8。 1.1.2 南瓜的营养价值南瓜的营养价值 每100克含蛋白质0.6克，脂肪0.1克，碳水化合物5.7克，粗纤维1.1克，灰分0.6克，钙 10毫克，磷32毫克，铁0.5毫克，胡萝卜素0.57毫克，核黄素0.04毫克，尼克酸0.7毫克， 抗坏血酸5毫克。此外，还含有瓜氨酸、精氨酸、天门冬素、葫芦巴碱、腺嘌呤、葡萄糖、 甘露醇、戊聚糖、果胶等8。 南瓜性温，味甘无毒，入脾、胃二经，能润肺益气，化痰排浓，驱虫解毒，治咳止 喘，疗肺痈与便秘，并有利尿、美容等作用。近年来，国内外医学专家、学者研究实验 表明，食南瓜，还有防治动脉硬化与胃黏膜溃疡、治糖尿病、化结石等作用9,10。 1.1.3 南瓜多糖的组成及性状南瓜多糖的组成及性状 近年来研究表明，南瓜具有多种食疗保健作用和药用价值。其中流传最广、最为人 们肯定的当属南瓜的抗糖尿作用11。南瓜多糖除蛋白后的物质降血糖效果不如前身南瓜 多糖，提示南瓜多糖可能是以糖蛋白形式存在的。孔庆胜等人采用凝胶过滤法测定多糖 分子量为 1.6104。采用层析法分析南瓜多糖中单糖种类有半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、 木糖和葡萄糖醛酸，其比值为 15.09 : 40.18: 10.73: 6.56: 26.44，摩尔比为 0.083: 0.181: 0.069: 0.031: 0.17512。 1.1.4 南瓜多糖的应用前景南瓜多糖的应用前景 近年来多糖研究突飞猛进，国际科学界视多糖为生命科学前沿的领域，甚至提出二 十一世纪是多糖的世纪13。多糖类物质是所有生命有机体的重要组成部分是生物体内除 核酸和蛋白质以外的又一类重要的生物分子，尤其是一类重要的信息分子14。现代研究 表明，南瓜含有治病、防癌等功能性因子。近年来，对南瓜功能性因子的研究及相应功 能食品的开发也得到越来越多的重视。科学研究已经确认多糖类物质具有许多生物活性， 包括抗肿瘤、免疫、降血糖和抗毒素等，且无毒副作用，在保健食品的开发应用上前景 广阔。现在国际上多糖研究以日本、美国、德国等处于领先地位，我国多糖的研究起步 南瓜多糖的提取与分离 - 3 - 较晚，对于我们日常食用的果蔬中含有的多糖研究相对较少15。 但我国开发果蔬多糖的前景十分看好，原因有：其一，我国的许多果蔬产品的产量 居于世界前列，具有丰富的资源。其二，目前用现代高科技手段如超滤，生物酶解技术 开发果蔬多糖技术已经成熟。其三，活性多糖一定剂量时可以治疗疾病，少量时可健身 防病，是抗衰老增强免疫力的健康佳品，果蔬多糖不仅可以作为药物进行研究，还可以 作为保健食品进行开发16。此外根据多糖的性质还可以从其他方面加以开发，如作为药 物的释放剂、稳定剂、悬浮剂以及工业上的涂抹剂、凝聚剂和润滑剂等17。 1.2 南瓜多糖组成的研究方法南瓜多糖组成的研究方法 1.2.1 南瓜多糖提取方法南瓜多糖提取方法 目前南瓜多糖提取方法有热水浸提取法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法以及 生物酶提取法。 热水浸提法的原理是利用多糖的水溶性，将南瓜肉浸在热水中，经过长时间的浸煮， 将多糖提炼出来溶解于水中，然后通过浓缩醇沉得到南瓜多糖18。 微波辅助提取法的原理是利用不同极性的介质对微波能的不同吸收程度，使基本物 质中的某些区域和萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使萃取物质从基体或体系 中分离出来，进入到介电常数小，微波吸收能力较差的萃取剂中18。 超声波提取法具有不需要加热、操作简单、节省时间和提取效率高等优点，超声波 提取一般有利用超声波清洗器提取的，也有专门针式提取器，如超声波细胞破碎仪，无 论是哪种提取设备，都是利用了超声波的“空化”作用。超声波提取的特点很明显，不 需要加热，这个尤其适用于热不稳定性目标物的提取。目前实验室使用较多的还是超声 波清洗器作为提取仪器。一般在超声波提取之前应该将待提取样品用提取溶剂浸泡一段 时间，使之相互充分的接触、渗透。在超声波提取中，最好都是使用混合提取溶剂，分 步骤提取，以提高目标物的提取效率。超声波提取法对玻璃容器也有一定的要求，如果 玻璃容器的质地不好，有裂隙等，在提取过程中很容易破裂，因此在选择玻璃器皿时应 特别注意19。 生物酶提取法反应条件温和，是一种较为先进有效的提取方法，其原理是水解植物 纤维素、原果胶和粗蛋白，分解细胞壁，有利于南瓜多糖的溶出。此方法制得的多糖中 蛋白质含量低，不需要进行脱蛋白6。 1.2.2 除蛋白除蛋白 采用醇沉或其它溶剂沉淀所获得的多糖，常混有较多的蛋白质，脱去蛋白质的方法 有多种：如选择能使蛋白质沉淀而不使多糖沉淀的酚、三氯甲烷、鞣质等试剂来处理， 但用酸性试剂宜短，温度宜低，以免多糖降解。常用的方法有： 沙维积法（Sevage 法）：根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性而不溶于水的特点， 将多糖水溶液、氯仿、戊醇（或正丁醇）之比调为 25:5:1 或 25:4:1，混合物剧烈振摇 30 咸阳师范学院 2011 届本科毕业设计（论文） - 4 - 分钟，蛋白质与氯仿戊醇（或正丁醇）生成凝胶物，然后离心，弃去水层和溶剂层交 界处的变性蛋白质。此种方法较温和，在避免降解上有较好效果，但效率不高。并且每 次除去蛋白质变性胶状物时，不可避免的溶有少量多糖，另外少量多糖与蛋白质结合的 蛋白聚糖和糖蛋白，在处理时会沉淀下来，造成多糖的损失。如能配合加入一些蛋白质 水解酶，再用 Sevage 法效果更佳20。 三氟三氯乙烷法：多糖溶液与三氟三氯乙烷等体积混合，低温下搅拌 10min 左右， 离心得上面水层，水层继续用上述方法处理几次，即得无蛋白质的多糖溶液，此法效率 高，但溶剂沸点较低，易挥发，不宜大量应用5,21,22。 三氯醋酸法：在多糖水溶液中滴加 530三氯醋酸，直至溶液不再继续混浊为止， 在 510放置过夜，离心除去沉淀即得无蛋白质的多糖溶液。此法会引起某些多糖的降 解。 酶解法：在样品溶液中加入蛋白质水解酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、 链霉蛋白酶等，使样品中的蛋白质降解。通常将其与 Sevage 法综合使用除蛋白质效果较 好。 1.2.3 多糖的分析方法多糖的分析方法 苯酚硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生 物，然后与苯酚生成橙色化合物，再以比色法测定糖总量。 1.3 拟采取研究方法拟采取研究方法 根据参考文献4,6,15,20，和实验室现有的条件，拟采用以下试验流程： 南瓜干粉 乙醇乙醚混合液 石油醚、乙醇 水浴加热10小时 索氏提取法除杂 共10小时 抽滤 滤渣挥发干 燥溶于蒸馏 水 热水浸 提4小时 抽 滤 滤液减压浓缩 除 蛋 白 醇沉 洗涤干燥 南瓜多糖 样品1 样品2 南瓜多糖的提取与分离 - 5 - 2 实验部分实验部分 2.1 药品试剂与仪器药品试剂与仪器设备设备 2.1.1 药品试剂药品试剂 表表 1 药品名称、规格及来源药品名称、规格及来源 名称名称规格规格来源来源 石油醚分析纯天津市红岩试剂厂 无水乙醇分析纯洛阳市化学试剂厂 正丁醇分析纯天津市红岩试剂厂 甲醇分析纯天津市红岩试剂厂 无水乙醚分析纯洛阳市化学试剂厂 三氯甲烷分析纯洛阳市化学试剂厂 丙酮分析纯洛阳市化学试剂厂 苯酚分析纯天津易发化学试剂厂 2.1.2 仪器仪器设备设备 河南予华仪器有限公司 DF101S 集热恒温磁力加热搅拌器；北京科伟永兴仪器有限 公司 101 型电热鼓风干燥箱；予华仪器有限公司 SHZD型循环水式多用真空泵；上海 安亭科学仪器厂 800B 离心机；德国 Jena 紫外可见分光光度计；BS224S 电子天平； TD2001 电子天平。 2.2 南瓜多糖的提取南瓜多糖的提取 2.2.1 南瓜的脱脂南瓜的脱脂 取烘干的南瓜肉，粉碎机粉碎后过 40 目筛，用电子天平称取两份 5.0 克样品。第一 份移入圆底烧瓶中，加入 1:1 的乙醇乙醚混合液 200mL，80水浴搅拌回流 10 小时，抽 滤，得到脱脂的滤渣，记为样品 1。第二份用滤纸包住放入索氏提取器中，以石油醚为提 取剂，在 90的水浴中回流提取 6 小时，然后再用乙醇提取 4 小时，抽滤，挥发干燥得 到脱脂的滤渣记为样品 2。 咸阳师范学院 2011 届本科毕业设计（论文） - 6 - 2.2.2 南瓜多糖的提取南瓜多糖的提取 将挥发干燥后样品 1 和样品 2 的滤渣溶于 200mL 的蒸馏水中，在 95的水浴中加热 搅拌 4 小时，冷却，减压浓缩至 80mL 左右，然后加入 25 倍甲醇沉淀多糖，依次用乙醇、 丙酮、乙醚洗涤。将洗干净后的多糖迅速转入装有氢氧化钠的真空干燥器中减压干燥。 干燥后可得粉末状的粗多糖。 2.2.3 粗多糖的纯化粗多糖的纯化 Sevage 法除蛋白：把干燥后的南瓜粗多糖完全溶于蒸馏水中，定容至 100mL。将多 糖水溶液、氯仿、正丁醇按体积比为 25:5:1 混合，将混合物剧烈震荡 30 分钟，蛋白质与 氯仿正丁醇生成胶状物而与多糖溶液分离，离心，弃去水层和溶剂层交界处的变性蛋 白质。最后再用醇沉法制得南瓜精多糖。 2.2.4 待测液的配制待测液的配制 样品 1 制得南瓜精多糖 0.3877g，样品 2 制得南瓜精多糖 0.4210g。精多糖产品再用蒸 馏水溶解定容至 250mL，即为待测液。 2.3 苯酚苯酚硫酸法测多糖含量硫酸法测多糖含量 2.3.1 测定方法测定方法 用移液管准确吸取一定量的多糖样品溶液，置于 10mL 比色管中，再加 5%的苯酚溶 液 1.0mL，振荡摇匀，然后加入 7.0mL 浓硫酸，最后用蒸馏水定容到 10mL 并摇匀。显色 20 分钟。同时取 2mL 蒸馏水作为空白对照。在最大吸收峰处测定吸光度23,24。 2.3.2 葡萄糖标准液的配制及测定葡萄糖标准液的配制及测定 精确称取干燥恒重的葡萄糖 100.0mg，加适量蒸馏水溶解，定容至 100mL，作为标准 溶液备用。准确量取葡萄糖标准液 10、20、40、60、80、100L，按照 2.3.1 方法显色， 测定吸光度。 2.3.3 样品溶液的测定样品溶液的测定 吸取多糖样品溶液 100L，分别加入标准葡萄糖溶液 20、30、40、50、60L，按照 2.3.1 方法显色，测得吸光度，根据葡萄糖的测出量，计算多糖含量。 2.3.4 多糖含量计算多糖含量计算 样品中多糖的质量分数 % = 式中：C 表示显色时通过标准工作曲线计算得到的溶液多糖含量（g/mL） ； V 表示显色时所取样品溶液的体积（mL） 。 (10C/V)250 510001000 100 南瓜多糖的提取与分离 - 7 - 3 结果与讨论结果与讨论 3.1 结果结果 3.1.1 最大吸收波长的确定最大吸收波长的确定 吸取一定量的样品 1 和样品 2 溶液，显色后于 400600nm 范围内扫描测定吸收曲线， 确定最大吸收峰波长为 489nm（图 3-1，图 3-2） 。 0.0000 1.5000 1.0000 0.5000 图图 3-1 紫外分光光度计测南瓜多糖样品紫外分光光度计测南瓜多糖样品 1 吸收峰吸收峰 0.0000 1.5000 1.0000 0.5000 图图 3-2 紫外分光光度计测南瓜多糖样品紫外分光光度计测南瓜多糖样品 2 吸收峰吸收峰 咸阳师范学院 2011 届本科毕业设计（论文） - 8 - 3.1.2 标准工作曲线的绘制标准工作曲线的绘制 苯酚硫酸法测得标准葡萄糖溶液工作曲线见图 2，回归方程：C = 0.0555A + 0.0266；R = 0.9781。实验结果表明，标准葡萄糖溶液在其含量为 110g/mL 范围内呈线 性关系。 标注葡萄糖溶液工作曲线 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 024681012 含量ug/ml 吸光度A 图图 3-3 标准葡萄糖溶液工作曲线标准葡萄糖溶液工作曲线 3.1.3 样品的测定结果样品的测定结果 表表 2 2 样品样品 1 1 的测定结果的测定结果 多糖样品量 （L） 加入标准液量 （L） A C（g/mL）（%） 100200.31785.24681.6234 100300.36326.06491.5325 100400.37346.24861.1243 100500.40186.76040.8820 100600.44087.46310.7316 表表 3 3 样品样品 2 2 的测定结果的测定结果 多糖样品量 （L） 加入标准液量 （L） A C（g/mL）（%） 100200.32865.44141.7207 100300.43257.31352.1568 100400.51428.78562.3928 100500.54339.30992.1550 100600.632810.92252.4613 3.1.4 南瓜多糖的提取率南瓜多糖的提取率 经计算得：样品 1 的南瓜多糖的提取率为 1.1788%，样品 2 的南瓜多糖的提取率为 2.1773%。 3.2 讨论讨论 从提取率结果和脱脂后南瓜的性状可以看出，索氏法脱脂比水煮法脱脂提取率高， 南瓜多糖的提取与分离 - 9 - 而且得到的多糖性状好，所以索氏法脱脂是一种较好的南瓜多糖脱脂方法。 咸阳师范学院 2011 届本科毕业设计（论文） - 10 - 结结 论论 实验结果表明，在本试验中采用的两种脱脂方法中，用乙醇乙醚混合液脱脂的南瓜 多糖提取率低，而且提取的南瓜精多糖性状差，为红褐色，配制的样品溶液呈淡黄色。 用石油醚、乙醇通过索氏提取器分步脱脂的南瓜多糖提取率高，提取的南瓜精多糖性状 好，为乳白色，配制的样品溶液基本无色。 所以用石油醚、乙醇通过索氏提取器分步脱脂的方法较优异。 南瓜多糖的提取与分离 - 11 - 致致 谢谢 行文至此，我的毕业论文已接近尾声，心头如释重负，写作过程中常常出现的辗转 反侧和力不从心的感觉却久久不能散去。论文写作的过程并不轻松，知识的积累尚欠火 候，于是，我不断的来往于图书馆中，一次次的在深夜奋笔疾书。在花费了如此长的时 间和如此多的精力后，一篇具有一定学术价值的论文完成了，其中的艰辛与困难历历在 目，但曲终幕落后留下的滋味，确值得我一生回味。 敲完最后一个字符，从头细细阅读这如家人一般亲切的文字，我感由心生。虽然我 的论文里没有什么值得特别炫耀的成果，但对我来说是宝贵的。它是辛勤的教诲、无数 的关爱和帮助的结果。 我要感谢我的指导老师孙家娟教授。孙老师虽身负教学、科研重任，但仍然抽出时 间，不时召集我和同学们以督责课业。孙老师为我们提供了良好的实验条件，在撰写论 文等方面提供了很多专业性的指导。孙老师渊博的学识、严谨的治学态度、精益求精的 工作作风和诲人不倦的高尚师德，都将深深地感染和激励着我。 谨向我的家人表示诚挚的谢意。他们一如既往的站在我的身后默默的支持着我，他 们无微不至的关怀，是我前进的动力；他们的殷殷希望，激发我不断前行。没有他们就 没有我的今天，我的点滴成就都来自他们。 同时也感谢我的舍友们，很快就要分别了，四年的相处愉快而令人难忘，感谢他们 在生活中给予我的建议和帮助，在此衷心祝愿他们都有美好的前程，愿我们的友谊地久 天长。 本论文的完成远非终点，文中的不足和浅显之处则是我新的征程上一个新的起点。 我将继续前行！ 咸阳师范学院 2011 届本科毕业设计（论文） - 12 - 参考文参考文献献 1 Harry S. 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