通过扩增青霉素生物合成基因簇提高产黄青霉在固态和液态发酵中的.ppt

通过扩增青霉素生物合成基因簇提高产黄青霉在固态和液态发酵中的青霉素产量WorldJMicrobiolBiotechnol(2008),第二组,青霉素,次级代谢,杀菌,影响青霉素产量高低,随机突变,基因工程,优化,基因过表达,结构基因(pcbAB,pcbC和penDE),构巢曲霉（Aspergillusnidulans）,产黄青霉（Penicilliumchrysogenum）,pcbC和penDE,pcbAB,上述研究均是利用产黄青霉Wis54-1255完成的，Wis54-1255仅含有一个青霉素基因簇的拷贝并且只能产生少量的抗菌素，而且实验结果只适用于液态发酵。本实验中，研究者对比了在转入整个青霉素基因簇后低产菌株（Wis54-1255）和高产菌株（P2-32）青霉素产量的差别，并且首次应用此法检测转化菌株在新兴的固态发酵（SSF）技术（Suryanarayan2003;Barrios-GonzalezandMeja2007）中的反应。,材料和方法,产黄青霉Wis54-1255青霉素低产菌株产黄青霉Wis54-1255npe10其青霉素基因簇不完整产黄青霉P2-32青霉素高产菌株可容纳青霉素基因簇以串联重复的方式扩增数倍产黄青霉NRRL1951（野生型）用作基因文库的DNA源枯草芽孢杆菌ATCC6633用于在生物测定中评估青霉素G的产量大肠杆菌DH5a用于粘性质粒基因文库和一般基因操作的受体,菌株,材料和方法,质粒载体,cos区多克隆位点腐草霉素抗性基因位点（基因ble）作为真菌选择标记删除PstI和XbaI的限制性酶切位点,IztapaCos,基因组文库的构建,野生型NRRL1951,全部DNA,提取,Sau3A1部分消化去磷酸化,材料和方法,BamHI-XbaI消化,连接,材料和方法,基因组文库的筛选,pbcAB探针,penDE探针,【通过PCR方法获得】以TGACAGACTATGTGGGTCTAGACCT和CGCTGTAAAGGTAACGCTCTTAAGG为引物，并包括基因pcbAB编码区的3末端序列和3-UTR的起始序列,【由HindIII酶切质粒pULJL33而获得】大小为0.3kb，包含基因penDE的3末端序列,通过切口转移标记上-32P-dCTP,于暗盒中在-70oC条件下用Hiperfilm-MP胶片曝光1小时,30000cfu/dish,副本,材料和方法,真菌的转化,E.coli,3080g/ml的梯度培养基,3080g/ml的梯度培养基,转化菌株,转化菌株,30g/ml腐草霉素,30g/ml腐草霉素,30g/ml腐草霉素,Wis54-1255npe10,Wis54-1255,P2-32,碱裂解,40kbp粘性质粒,对照,材料和方法,青霉素在琼脂上的产量,Somerson培养基制成的琼脂块（g/l,乳糖110，葡萄糖14，CaCO320，KH2PO46，MgSO47H2O6，谷物浸提液70，苯乙酸1.4）,接种了枯草芽孢杆菌的胰蛋白胨（1%琼脂）培养基中,转化菌株的菌丝体,材料和方法,液态发酵,含有50ml复合生长培养基,25oC,50rpm培养36小时,取各菌株的孢子,接种,（1106）,每隔一定时间，取5毫升培养物,含有45ml复合生产培养基,25oC,250rpm培养144小时,转接,作为副本,材料和方法,固态发酵,经过0.3-0.6mm孔径筛过的甘蔗渣,改良的Somerson复合生产培养基,接种（2106孢子/ml）,初始的水分含量设定为70%,在每个Raimbault型圆柱发酵罐中加入12g固体培养基,25oC条件下进行144小时，通气量设定为2.4L/h,取出并混匀圆形容器中的内容物,取1克潮湿的培养基样品测定其pH值和青霉素含量,1700rpm离心20分钟，青霉素被抽提到0.1M的磷酸缓冲液中从而使样品的pH值为5.5（如果有必要可加入H3PO4调节pH值）。取60微升提取物或其稀释物用于生物鉴定。,材料和方法,数据分析,对于固态和液态发酵实验，实验结果为两个独立实验的平均值，样品（整个培养瓶或圆柱发酵罐）为一式三份。对原始和转化菌株的青霉素产量采用StudentsT-test方法进行分析。,结果与讨论,在粘性质粒载体IztapaCos中构建了一个基因组文库，该文库携带有一个腐草霉素抗性基因，且可直接转入真菌之中，不需进一步的亚克隆。首要目标分离出一个含有整套青霉素基因簇的粘性质粒克隆。利用整套基因簇来增加青霉素基因的拷贝数而不是转入单个的pcbAB和pcbC-penDE基因。为实现这一目标，用分别位于基因簇的两个末端的探针pcbAB和penDE对基因组文库进行了筛选。对E.coli进行的13次克隆证实这两个探针都已分离出来并获得了粘性质粒DNA。,结果与讨论,以此方式形成的重组粘性质粒继续呈递进行Southern分析，分析中仍然使用相同的两个探针以确定它们包含整套的青霉素基因簇。其中一个名为IztapaCos-pen5的粘性质粒（图2第5列），被用于转化产黄青霉。,结果与讨论,转化菌株Wis54-1255和P2-32被转移至腐草霉素浓度不断增高的琼脂培养基上，以便选出含有高拷贝数的选择标记基因ble的菌株，也就是含有高拷贝数青霉素基因簇的菌株。转化菌株中的6株Wis54-1255和3株P2-32可以在含有60g/ml腐草霉素添加剂的培养基上生长。同时利用在琼脂鞘上的发酵来检测所有转化菌株的青霉素产量。检测中青霉素产量最高的菌株是对60g/ml腐草霉素有抗性的转化菌株。我们将此两种菌株中筛选出的青霉素产量最高的转化菌株分别命名为TW和TP。对液态发酵和固态发酵中TW和TP菌株的青霉素产量作了仔细检测，并在同一实验中与其亲本菌株的发酵产量作了比较。在亲本菌株内转入IztapaCos（空载体）作为对照，该转化菌株的青霉素产量略微低于原菌株的青霉素产量。,结果与讨论,相对于亲本菌株，转化菌株TW和TP的青霉素产量在两种培养体系中均有显著提高。然而，来源于菌株P2-32的转化菌株TP的青霉素产量则提高的更多。,结果与讨论,关于产黄青霉(P.chrysogenum)青霉素产量的早期研究表明微生物在固态发酵中的生理生化反应与在液态发酵中的大不相同，从而导致了它们在两种培养系统中产量水平的差异。这一信息指出了设计能够特别适合于固态发酵菌株的改进方法的必要性（Barrios-Gonzalezetal.1993a;Barrios-GonzalezandMeja2007）。研究表明越接近于野生型的菌株在固态发酵能越高效地发挥其青霉素生产潜力，这说明在遗传改良过程中，为适合液态发酵而开发的工业高产菌株，正在失去一些（未知）有助于其在固体培养基上很好地适应和生长的重要功能，（Barrios-Gonzalezetal.1993a）。寻找这些引起所谓的固体培养生理性的“固体培养基因”已成为当前研究的主题（Barrios-Gonzalezetal.2008;Ishidaetal.2000;TeBiesebekeetal.2005）。,结果与讨论,这与实验结果相符，菌株Wis54-1255比P2-32更接近于野生型，其由于额外拷贝的转入而导致的在固态发酵中产量的增加比P2-32更高。相反地，对于菌株P2-32，额外拷贝的转入则在液态发酵中起到更加显著的作用。显然，在Wis中更加保守的“固态培养基因”促进了其新的生物合成能力在固态发酵中的发挥，而这些基因在菌株P2中没有很好地保留（或激活）。另一项试验结果也可用相同的原理来解释，那就是Wis在固态发酵和液态发酵（培养系统）间产量水平的差别在TW转化株上更加显著，而这种差别在P2转化株上则较小。,结果与讨论,高青霉素滴度产黄青霉工程菌内含有高拷贝的青霉素基因簇，且此高拷贝以串联重复方式排列（Fierroetal.1995;Newbert1997）。到目前为止，通过转入额外青霉素基因拷贝的方式增加青霉素产量的研究均是在含有单拷贝青霉素基因簇的低产菌株上完成的（Veenstraetal.1991;Theilgaardetal.2001）。我们首次使用了P2-32菌株，据报道它含有多达14个拷贝的青霉素基因簇（Barredoetal.1989）。Thykaer和Nielsen（2003）提出存在于一株菌株内使产量增高的基因簇拷贝数有一个上限；他们指出超过5个拷贝之后，基因簇拷贝数与青霉素产量之间不再有线性关系。我们的实验结果显示即使是P2-32这种有着高拷贝青霉素基因簇的菌株，也是对提高青霉素基因数量的改进策略高度敏感的。,结果与讨论,如前所述，P2-32转化株在液态发酵和固态发酵中均比Wis54-1255转化株显示出更高的青霉素产量的增加（相比于其亲本菌株）。对这些结果有种与生物合成基因无关的解释。P2是一个不断经过突变和筛选而得的高青霉素产量菌株。这意味着它已经积累了很多突变，而很多这些突变在功能上与生物合成基因不同但可以互补（附属基因），比如更高的输出能力。很多这类基因已被描述（Kieletal.2005;Lamas-Maceirasetal.2006;Garca-Ricoetal.2008）。这些突变使得更高的青霉素生物合成潜能得到更好地表达（由于生物合成基因的扩增）。因此，已存在于菌株P2中的互补突变必定使得菌株对通过增加青霉素基因簇拷贝数后获得的更高的生物合成潜能进行更高效的利用。,结果与讨论,另外，本实验首次显示基因剂量的增加对固态发酵中次级代谢物产量的提高也同样适用。在这点上，可以预见本实验中提出的策略在其最有效的形式下，也可用于其它更适用于固态发酵的实验，如B