MLL白血病关键靶基因的筛选和机制研究优秀毕业论文.pdf

华中科技大学 博士学位论文 mll白血病关键靶基因的筛选和机制研究 姓名：杨漾 申请学位级别：博士 专业：血液内科 指导教师：周剑峰 2011-05 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 1 mll 白血病关键靶基因的筛选和机制研究mll 白血病关键靶基因的筛选和机制研究 华中科技大学同济医学院附属同济医院血液内科 博士研究生 杨 漾 博士生导师 周剑峰 教授 中中 文文 摘摘 要要 【背景与目的】【背景与目的】 ：白血病干细胞 (leukemia stem cells, lsc)和正常造血干细胞 （hematopoietic stem cells, hsc）间的竞争与失衡伴随着白血病病程发展的全程，是 决定治疗转归的关键。最新研究提示 pi3k/pten/akt/mtor 通路可能是纠正两者间 失衡的理想干预靶点。 尽管目前已发现两代 mtor 复合物抑制剂， 但其在临床应用中 的效果并不理想。 本研究应用细胞印迹高通量筛选技术， 寻找 mtor 复合物 2 特异性 抑制剂。并初步探讨化合物 z1 选择性降解部分混合谱系白血病(mixed lineage leukemia,mll) 细胞中 rictor 蛋白的分子机制，为 mll 白血病的基因靶向治疗提供 一定的理论基础。然而 rictor 在 mll 白血病中究竟扮演着什么样的角色呢？于是我 们一方面探讨 rictor 分子在 mll 白血病细胞集落形成能力、增殖和凋亡等方面所起 的作用；一方面体内研究 rictor 分子在 mll 白血病发病和维持中所起的作用。 【方法】【方法】： 1. 高通量筛选技术寻找高通量筛选技术寻找mtor复合物复合物2特异性抑制剂：特异性抑制剂：采用细胞印迹高通量筛选 （cytoblot high throughput assay）技术，从华北制药集团新药研发中心小分子单体 化合物文库中筛选mtor复合物2特异性抑制剂，并进一步运用western 免疫印记法， 初步验证筛选得到的小分子化合物对各种白血病细胞系中的mtor复合物关键组分蛋 白的抑制作用。 2. 化合物化合物 z1 降解降解 rictor 蛋白分子机制的初步探讨：蛋白分子机制的初步探讨：以 thp-1 细胞作为 rictor 降解 机制研究的模型细胞，western 免疫印迹技术检测蛋白合成抑制剂放线菌酮 （cycloheximide， chx） 和 z1 联合蛋白酶体抑制剂 mg-132 分别作用该细胞后 rictor 蛋白表达水平的变化；荧光素酶-蛋白酶体活性分析技术（luciferase -proteasome-glo cell-based assay）检测 z1 处理后细胞蛋白酶体活性变化；构建体外泛素化模型，检 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 2 测 rictor 蛋白泛素化修饰情况。 3. rictor分子对分子对mll白血病细胞作用的体外实验研究：白血病细胞作用的体外实验研究：首先运用 rictor-shrna 慢 病毒反义封闭技术对mll白血病细胞、非mll白血病细胞及正常细胞中的rictor分子 加以反义封闭；然后利用该系统所带gfp经流式分选获得gfp-rictor-rnai 细胞；经 流式细胞术、细胞免疫荧光术及western免疫印迹法鉴定封闭效应后，通过甲基纤维素 集落形成实验检测rictor反义封闭对各种细胞集落形成能力的差别，并同时运用流式 细胞术检测相应细胞增殖和凋亡情况的差别。 4. rictor 分子对分子对 mll 白血病发病和维持影响的初步研究白血病发病和维持影响的初步研究: 建立白血病人源化 nod/scid 免疫缺陷小鼠模型；动态监测小鼠外周血 hcd45+细胞及 hcd45/gfp 双阳 性细胞比例，对异种移植是否成功加以评估，同时也对 rictor-rnai 组与其他组间抑 制率进行比较；在实验的终点，比较各组小鼠的整体观以及肝脏、脾脏等器官；流式 细胞仪分析各组骨髓、肝脏和脾脏 hcd45/gfp 双阳性细胞比例，并比较其差别；免 疫组织化学染色技术检测各组肝脏、脾脏、肾脏和肺 hcd45 阳性细胞表达情况； rt-pcr 技术检测移植小鼠外周血单个核细胞 mll 融合基因表达；绘制生存曲线，评 估各组小鼠生存期差别。 【结果】【结果】： 1. z1化合物对部分mll白血病细胞系中的mtor复合物2保守组分rictor蛋白有选择 性抑制作用，而其他白血病细胞系经z1化合物作用后仅出现mtor复合物2下游分子 磷酸化水平(如p-akt ser473)的下降。 2. 用 western 免疫印迹技术检测到， 经 10mol/l chx 处理后不同时间点的 thp-1 细 胞中 rictor 蛋白均无降解现象；mg-132 可以逆转 z1 引起的 thp-1 细胞中 rictor 蛋 白的降解；thp-1 细胞中蛋白酶体活性被 z1 所抑制；gst 标签的 rictor 片段蛋白可 以在体外被经 z1 作用后的 thp-1 细胞粗提液（s100）泛素化。 3. 经流式细胞术鉴定，分选后各组 gfp 阳性细胞均在 90%以上，同时细胞免疫荧光 术及 western 免疫印迹法均证实 rictor 蛋白封闭效应明显； mll 白血病细胞 rictor-rnai 组集落形成能力明显低于 nc-rnai 组（p 0.05） ；同时，mll 白血病细胞 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 3 rictor-rnai 组增殖能力也明显低于 nc-rnai 组（p 0.05） ， 但 thp-1 感染 rictor-rnai 组模型鼠外周血 hcd45/gfp 双阳性细胞比例从第 7 周开始就显著低于 nc-gfp 对照组（p0.01） ；实 验监测期的终点，可见 rictor-rnai 组模型鼠整体状况好于 nc-gfp 对照组，且肝脏 瘤结节数目体积均小于对照组； rictor-rnai 组模型鼠肝脏、 脾脏和骨髓中 hcd45/gfp 双阳性细胞比例均显著低于 nc-gfp 对照组（p0.01） ； kaplan-meier 曲线生存分析 显示 rictor-rnai 组模型鼠生存时间长于对照组（p=0.033） 。 【结论】【结论】： 1. 运用细胞印迹高通量筛选技术，从小分子单体化合物文库初步筛选并得到一种能 够选择性降解部分mll白血病细胞系中mtor复合物2保守组分rictor蛋白的特异性 小分子化合物，为研究mll白血病的靶向治疗提供了新的分子靶点。 2. rictor作为一种高度保守蛋白在一般情况下是很稳定的， 但z1可引起thp-1细胞中 rictor蛋白通过泛素-蛋白酶体途径（ubiquitin -proteasome pathway，upp）降解，这种 降解作用很可能是通过z1活化该途径的e3泛素连接酶而实现的， 与蛋白酶体自身活性 无关。 3. rictor分子在mll白血病细胞集落形成能力、增殖和凋亡调控等方面起着重要的 作用，提示它可能是mll白血病靶向治疗中的一个关键靶基因。 4. rictor分子是mll白血病发病和维持所必须的。 【关键词】【关键词】 ：高通量筛选；mtor 复合物；mll 白血病；rictor；体外泛素化；e3 泛 素连接酶；集落形成；白血病人源化小鼠 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 4 screening key target genes of mll and studying on the underlying mechanisms department of hematology, tongji hospital, tongji medical college, huazhong university of science and technology ph.d.candidate : yang yang supervisor: prof. zhou jianfeng abstract background and objective: the competition and imbalance growing state between leukemia stem cells and normal hematopoietic stem cells is the crux of therapeutical approaches and outcome of leukemia as accompanying the whole process of generation and development of leukemia. the latest research reveals that pi3k/pten/akt/mtor signaling pathway may be a new target for correcting the imbalance between leukemia stem cells and normal hematopoietic stem cells. two generations of mtor complex inhibitor have been developed, however, the practical clincal applications have received unfavorable outputs. in present study, we use cytoblot high throughput assay to identify cell-specific inhibitor of mtor complex 2. then to investigate the degradation effect of protein rictor in parts of mll cell lines induced by lead compound z1, and to supply some theories for gene targeted therapy to mll. this study was designed to investigate the role of rictor in the colony forming, proliferation and apoptosis regulation of mll leukemic cells in vitro. to study the effect of rictor in the pathogenesis and maintain of leukemia in vivo. methods： 1. searching for specific inhibitor of mtor complex 2 by developing a high-throughput cytoblot assay: specific inhibitor of mtor complex 2 was screened 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 5 from small molecule monomeric compound library of ncpc new drug research center by using cytoblot high throughput assay. western blot was then used to determine the inhibiting effect of compound against the key component protein in mtor complex. 2. an approach to the mechanism of lead compound z1 in degradation protein rictor: thp-1 cell line was taked as the cell model, western blot was employed to detect the expressions of protein rictor after the treatment of chx and z1-mg-132-combined treatment, respectively; luciferase -proteasome-glo cell-based assay was used to measure the poteasome activity changes of thp-1 after treated by z1; ubiquitylation in vitro model was constructed, and the situation of ubiquitylation in protein rictor was also detected. 3. study on the role of rictor to mll leukemic cells in vitro: rictor-rna interference (rnai) by transcription of short hairpin rnas (shrnas) from a lentiviral system was applied to silence rictor gene expression in mll leukemic cells, non-mll leukemic cells and normal cells; and then gfp-rictor-rnai cells were isolated by flow cytometry using the targeting-gfp in this lentivirus rnai system; after established by flow cytometry, cellular immunofluorescence and western blot, methyl cellulose colony forming assay was used to detect the differences among these rictor-rnai groups. meanwhile, the proliferation dynamics of ddao-se labeled cells was detected by flow cytometry and analyzed with modfit software, and flow cytometry was also used to observe apoptosis of each cell group. 4. preliminary study on the influence of rictor in the pathogenesis and maintain of mll leukemia in vivo: mouse model of hukemia was established in nod/scid mice. to evaluate the effect of xenograft by dynamic monitoring the percentages of hcd45 positive cells and hcd45/gfp double positive cells in mice peripheral blood, meanwhile, it could be used as a means for evaluating transplant rates of group rictor-rnai distinguishing from the other two control groups. at the end point of observation post transplantation, the aspects, the sizes of livers and spleens, also with the number of tumor nodes in liver and spleen were compared among each group. flow cytometry was used to analyze the percentages of hcd45/gfp double positive cells in bone marrow, liver and spleen. the expression of the hcd45 in the livers, spleens, kidneys and lungs of the mice post transplantation was detected by immunocytochemistry. the rearrangements of mll gene in mice peripheral blood was detected by rt-pcr. the survival curve of thp-1 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 6 transplantation mice was draw, and used to evaluate the differences of survival time among each group by kaplan-meier method. results: 1. the screen results indicated that compound z1 had selectively block activation on rictor protein which was a conserved component of mtor complex 2, this phenomenon appeared only in parts of mll leukemia cell lines. meanwhile, only decreased level of phosphorylated mtor complex 2 downstream molecules (such as p-akt ser473) was appeared in other leukemia cell lines treated by compound z1. 2. no degradation effect of rictor in thp-1 was detected after the treatment of 10mol/l cycloheximide in different time points by western blot; mg-132 could reverse the degradation effect of rictor in thp-1 cell line by z1; the activity of poteasome in thp-1 was inhibted by z1; gst targeting rictor fragment could be ubiquitylated by thp-1 s-100 fraction which was treated by z1. 3. after certified by flow cytometry , the positive rate of each sorted cell group was over 90%, meanwhile, both of cellular immunofluorescence and western blot confirmed that protein rictor was blocked obviously; colony forming ability of group rictor-rnai in mll leukemic cells was found to significantly lower than group nc-rnai（p 0.05). furthermore, proliferation of group rictor-rnai in mll leukemic cells was also found to significantly lower than group nc-rnai（p 0.05). however, the percentages of hcd45 positive cells in thp-1 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 7 infected rictor-rnai group had became significantly lower than those in the thp-1 blank or nc-gfp group from the seventh week (p0.01). at the end point of observation post transplantation, the aspect of rictor-rnai group mice was better than that of thp-1 blank or nc-gfp group. meanwhile, the sizes of the livers in rictor-rnai group were smaller than those in other two groups, and the numbers of liver tumor nodes in rictor-rnai group were less than those in other two groups. the percentages of hcd45/gfp double positive cells in mice liver nodes, spleens and bone marrow of rictor-rnai group were significantly lower than those of nc-gfp group(p0.01).the analysis by kaplan-meier method showed that survival time of rictor-rnai group was longer than those of control groups (p=0.033). conclusion: 1. taking cytoblot high throughput assay, a specific small molecule monomeric compound was found out which could degrade a conserved component of mtor complex 2rictor selectively, and it will provide new target molecules for targeted gene therapy of mll leukemia. 2. a highly conserved protein rictor is stable in normal situation, and the protein rictor could be degradated by ubiquitin-proteasome pathway(upp), the degradation is likely to be achieved through the activation of e3 ubiquitin ligase by z1, and has no relationship with the activation of proteasome. 3. rictor could play a critical role in the colony forming, proliferation and apoptosis regulation of mll leukemia. it revealed that rictor might be a potential key target gene in target therapy for mll leukemia. 4. rictor was necessary for the pathogenesis and maintain of mll leukemia in vivo. keywords: high throughput assay; mtor complex; mll leukemia; rictor; ubiquitylation in vitro; e3 ubiquitin ligase; colony forming; hukemia mice. 独创性声明独创性声明 本人郑重声明， 本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文 中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本 人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 ，在_年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密。 （请在以上方框内打“” ） 学位论文作者签名： 杨漾 指导教师签名： 周剑峰 日期： 2011 年 05 月 09 日 日期：2011 年 05 月 12 日 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 8 研研 究究 背背 景景 白血病属造血系统的恶性肿瘤。根据最新流行病学调查显示，我国白血病占恶性 肿瘤中发病数的 5%，并且成为儿童、青少年发病率第一位的恶性肿瘤，严重的威胁 着我国人民的身体健康。 早期对于白血病的治疗，单纯的采用常规化疗手段，虽可使部分患者病情得到缓 解，但多数最终死于复发。直到造血干细胞移植技术(hematopoietic stem cell transplantation , hsct) 的出现1，白血病的预后才得到明显的改观，然而，hla 型别 匹配成为制约这一治疗手段的最大瓶颈。上世纪 80 年代发现全反式维甲酸 (all-trans retinoic acid , atra) 可诱导急性早幼粒细胞白血病 (acute promyelocytic leukemia , apl) 分化，使该型白血病的治疗有了质的飞跃，atra 单药治疗初发 apl 的完全缓 解率能达到 90%左右2，这极大地增强了人们攻克白血病的信心。21 世纪伊始，蛋白 激酶抑制剂格列卫 (gleevec) 的上市，使得 ph+ 慢性粒细胞白血病 (chronic myelogenous leukemia，cml) 的治疗效果大大改观，并成为白血病分子靶向治疗的里 程碑3。其他如针对白血病细胞特异性表达抗原的利妥昔单抗(rituximab)、吉姆单抗 奥佐米星(gemtuzumab-ozogamicin, go)以及 flt3 抑制剂 pkc-412 等一系列分子靶向 治疗药物已陆续用于临床或正进行临床前期试验3。但这些分子靶向治疗并没有真正 靶向白血病干细胞(leukemia stem cells, lsc)， 而白血病的病程却恰恰是由这少量 lsc 所维系着的，靶向 lsc 同时不对正常造血干细胞( hematopoietic stem cells, hsc)产生 影响才是治愈白血病的关键。可见，针对 lsc 靶向治疗具有深远意义。 近年来许多研究表明 pi3k/pten/akt/mtor 通路与白血病的发生和进展有着密 切的联系，该通路在白血病中的异常活化促进其生长增殖、造血微环境血管形成、加 速其营养代谢和细胞周期进程4,5，同时发现，运用该通路抑制剂如 mtor 复合物 1 抑制剂雷帕霉素(rapamycin) 能够逆转 pten 缺失模型鼠自发白血病，而对正常造血 干细胞不产生影响6，如若白血病患者体内白血病细胞及 lsc 能够得以选择性清除， 并且保留少量 hsc 及其功能，并依赖后者重建正常造血，定能获得白血病的彻底治 愈。然而，遗憾的是， rapamycin 及其类似物并未在白血病的临床治疗中获得预期效 果。 开发新型 pi3k/ pten/akt/mtor 通路特异性抑制剂成为一件很有价值和前景的 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 9 工作，这就是学位申请人及所在研究组开展本课题研究的初衷。 图1：pi3k/ pten/akt/mtor通路异常活化与白血病细胞的关系（插图引自martelli am, et al. the phosphatidylinositol 3-kinase/akt/mtor signaling network as a therapeutic target in acute myelogenous leukemia patients. oncotarget, 2010, 1(2): 89-103.） 1. mtor 复合物 2 特异性抑制剂白血病分子靶向治疗的新希望 最新研究显示，在肌肉细胞中选择性敲除 mtor 复合物 1 的调节亚基 raptor， 直接导致肌营养不良；而选择性敲除 mtor 复合物 2 的调节亚基 rictor，则不影响 肌肉的发育7。为此，目前 pi3k/akt/mtor 通路抑制剂的最新趋势是以 mtor 复合 物 2 为靶点研发新一代 mtor 抑制剂。我们与华北制药集团新药研发中心合作，从 其微生物来源小分子化合物文库中筛选这种特异性抑制剂，意外的发现了一种可以选 择性降解 mll 白血病细胞中 rictor 分子的化合物，而对其他类型白血病细胞及正常 细胞中 rictor 没有影响，并初步证明了这种降解作用可能与活化 mll 白血病细胞中 rictor 特异性 e3 酶而加速 rictor 通过泛素蛋白酶体途径降解。 由于白血病遗传背景复杂，亚型繁多，越是特异性的靶向治疗，其作用谱可能越 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 10 窄。由此，我们进一步将目光锁定在靶向 rictor 分子对 mll 白血病的意义及其机制 的初步探讨上。 2. 靶向 rictor 分子mll 白血病靶向治疗研究可以借鉴的模式 mll 基因重排的急性白血病是区别于传统 all 和 aml 的一类高度独立和显著 不同的白血病，预后极差。虽然目前已经证实 mll 融合与 hoxa 家族、meis1 等下 游分子的异常表达密切相关8，但鉴于它复杂的重排方式和繁多的伙伴基因，对 mll 白血病尤其是 mll 白血病干细胞的分子靶向治疗研究进展相对缓慢，目前尚没有发 现特异性的分子靶点9。 我们运用评价肿瘤细胞体外自我更新 (self-renew) 能力的经典实验集落形 成实验并结合增殖能力、凋亡情况观察来综合考量 rictor 对 mll 白血病细胞活性以 及 mll 干细胞体外干性 (stemness)的影响，证实了 mll 白血病细胞的活性及 mll 干细胞体外干性对 rictor 分子具有很强依赖性。紧接着，我们构建了 mll 白血病人 源化小鼠模型，初步证实了 rictor 是 mll 白血病发病和维持所必须的关键分子。为 筛选 mll 白血病后续分子靶点提供了线索，并为验证其有效性提供了可以借鉴的研 究模式。 参考文献参考文献 1 mathe g, amiel jl, schwarzenberg l, et al. bone marrow transplantation in man. transplant proc, 1969, 1(1): 16-24. 2 chim cs, kwong yl, liang r, et al. all-trans retinoic acid (atra) in the treatment of acute promyelocytic leukemia (apl). hematol oncol, 1996, 14(3): 147-154. 3 capriotti t. gleevec: zeroing in on cancer. medsurg nurs, 2002, 11(6): 301-304. 4 min yh, eom ji, cheong jw, et al. constitutive phosphorylation of akt/pkb protein in acute myeloid leukemia: its significance as a prognostic variable. leukemia, 2003, 17(5): 995-997. 5 park s, chapuis n, tamburini j, et al. role of the pi3k/akt and mtor signaling pathways in acute myeloid leukemia. haematologica, 2010, 95(5): 819-828. 6 yilmaz oh, valdez r, theisen bk, et al. pten dependence distinguishes 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 11 haematopoietic stem cells from leukaemia-initiating cells. nature, 2006, 441(7092): 475-482. 7 sparks ca, guertin da. targeting mtor: prospects for mtor complex 2 inhibitors in cancer therapy. oncogene, 2010, 29(26): 3733-3744. 8 liedtke m, cleary ml. therapeutic targeting of mll. blood, 2009, 113(24): 6061-6068. 9 krivtsov av, twomey d, feng z, et al. transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by mll-af9. nature, 2006, 442(7104): 818-822. 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 12 第一部分 高通量筛选技术寻找第一部分 高通量筛选技术寻找mtor复合物复合物2特异性抑制剂 特异性抑制剂 在白血病发生、发展的不同阶段，白血病细胞均可能通过不同层面，不同机制抑 制hsc的数目和正常功能1。 hsc与lsc的竞争和失衡伴随着白血病病程发展的全程， 是决定治疗转归的关键。迄今尚无通过纠正 lsc 和 hsc 间的失衡，促进正常造血功 能恢复的有效干预手段2。为此，通过研究白血病状态下 lsc 和 hsc 间消长规律和 分子调控机制，分离并确定能纠正 lsc 和 hsc 间的失衡的治疗靶点，将会为白血病 的治疗提供富有潜力的方向和新的希望。最新研究提示 pi3k /akt/mtor 通路可能 是纠正 lsc 和 hsc 间的失衡的理想干预靶点。 基于此， 近几年针对 pi3k/akt/mtor 通路的抑制剂的研发和应用进展迅猛，部分抑制剂已进入临床试验阶段。尽管如此， 在实际应用中发现，mtor 抑制剂在获得更强、更广谱的抑制活性的同时，也具有明 显的临床应用安全隐患。 找到特异性的 mtor 复合物 2 抑制剂成为解决这一安全隐患 的关键环节。我们与华北制药集团新药研发中心合作，通过建立独特的细胞印迹高通 量筛选模型，在中国独有、亚洲最大的微生物菌种文库中筛选 pi3k/akt/mtor 通路 mtor 复合物 2 特异性的抑制剂。 1.材料与方法材料与方法 1.1 细胞系及培养细胞系及培养 急性髓系白血病细胞系kasumi-1、hl-60、thp-1、mv-4-11，急性淋巴系白 血病细胞系jurkat, rs4;11, 慢性粒细胞白血病急性变细胞系k562, 正常人胚肾细胞 系hek293，正常人支气管上皮细胞beas-2b均购于美国atcc，急性单核白血病细胞 系shi-1为苏州医学院血液病研究所惠赠。 kasumi -1、 hl-60、 thp-1、 jurkat、 rs4;11、 k562细胞培养采用 rpmi-1640培养液（含10%胎牛血清），mv-4-11和shi-1细胞培 养采用iscoves modified dulbeccos medium (imdm)培养基（含10%胎牛血清）， hek293细胞培养采用含10%胎牛血清的dulbeccos modified eagles medium (dmem) 培养基，beas-2b细胞培养则采用含10%胎牛血清的dmem: f-12培养基，细胞系均置 37、5% co2培养箱中培养，每23天传代1次，取对数生长期细胞进行实验。 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 13 1. 2 主要试剂主要试剂 各种培养基粉剂及胎牛血清均购于美国 gibco 公司，培养基粉剂用高压灭菌超纯 水溶解并加入 hepes 缓冲盐，用碳酸氢钠调节 ph 值后，再使用 millipore 公司出品 0.10m 滤器过滤除菌；bca 法蛋白定量试剂盒（bca protein assay reagent ） ，ecl 发光法检测试剂盒（ecl western blotting substrate ）与 hrp 标记的羊抗小鼠/兔 igg (h+l)均为美国 pierce 公司产品； 兔抗人单克隆总 akt、 p-akt （ser473） 、 总 4e-bp1、 p-4e-bp1(thr70)、 mtor、 rictor 和 raptor 抗体均为 cell signaling technology 公司产品； 小鼠抗人单克隆 -actin 抗体购自美国 santa cruz 公司；蛋白酶体抑制剂放线菌酮 (chx)购自 dako 公司；蛋白酶体抑制剂 mg-132 和 dmso 为 sigma-aldrich 公司产 品。 western 免疫印记用丙烯酰胺、sds、tris 缓冲盐、temed 和过硫酸铵（ap） 均购自美国 amresco 公司。ecl 曝光用显影液，定影液和医用胶片均为美国柯达公司 产品。国产试剂均购于国药集团化学试剂公司。 1.3 主要设备仪器主要设备仪器 wallac 1420 victor2多信号计数分析平台为美国 perkinelmer 公司出品； western 免疫印记用电泳槽、转膜槽及电源设备为美国 bio-rad 公司产品。 1.4 小分子单体化合物文库简介小分子单体化合物文库简介 华北制药新药研发中心作为国内最大的微生物菌种资源库之一，分离并保存放线 菌、真菌合计近 4 万株，并拥有其独特的微生物来源的小分子单体化合物文库，合计 近 1700 种已知或未知结构小分子单体化合物。在接近一年的前期研究中，学位申请 人所在课题组与华北制药新药研发中心合作，通过建立分子模型（详见 1.5.1 部分） ， 对该小分子单体化合物文库进行筛选。 1.5 方法方法 1.5.1 细胞印迹高通量筛选分子模型细胞印迹高通量筛选分子模型 p-akt（ser473）是mtor复合物2直接的下游靶点2,3，其磷酸化水平的高低可以 直接反应该复合物激活或抑制情况3,4，于是我们选用p-akt（ser473）这一指标作为 筛选模型靶点来间接寻找mtor复合物2可能的抑制剂。经adv-40转染而永生化的人 正常支气管上皮beas-2b细胞高表达p-akt5，因而我们选用该种细胞作为细胞印迹 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 14 高通量筛选技术的模式细胞，特异性检测细胞经各种化合物作用后96孔板中细胞整体 p-akt表达水平变化情况。下面就这一模型设计及具体步骤加以详细阐述： 1.5.1 模型设计 1.5.1 模型设计 细胞印迹高通量筛选技术（cytoblot high throughput assay）是一种基于被固定 破膜的细胞整体的基础上，采用特异性的一抗及hrp标记二抗去检测相应的细胞表面 或胞内特异性蛋白磷酸化位点水平高低。 与western免疫印记技术破坏了