WB实验原理.doc

sds聚丙烯酰胺凝胶电泳和western印迹技术sds聚丙烯酰胺凝胶电泳技术首先在1967年由shapiro等建立，主要用于测定蛋白质亚基分子量。western 印迹是在sds聚丙烯酰胺凝胶电泳基础上，将电泳分离的蛋白组分从凝胶转移至一种固相支持物上，应用抗体可与附着于固相支持物上的靶蛋白发生特异性反应的特点，针对特定蛋白进行鉴别和定量。原理1 sds聚丙烯酰胺凝胶电泳sds是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂，例如巯基乙醇和二硫苏糖醇则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入sds和还原剂后，蛋白质分子被解聚，使其氨基酸侧链与sds充分结合形成带负电荷的蛋白质-sds胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同分子之间原有的电荷差异。在水溶液中蛋白质-sds胶束的长度与亚基分子量的大小成正比。因此这种胶束在sds聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质或亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15kd200kd之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。由此可见，sds聚丙烯酰胺凝胶电泳不仅可以分离蛋白质，而且可以根据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子量。2 western 印迹在western印迹法中，待测样品溶解于去污剂和还原剂的溶液中，经过sds聚丙烯酰胺凝胶电泳后被转移到固相支持物上（常用硝酸纤维素滤膜），然后可被染色。随后滤膜可与抗靶蛋白的一抗反应。最后，结合上的抗体可用多种二级免疫学试剂（与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联的a蛋白或抗免疫球蛋白）检测。western 印记法可测出1-5ng中等大小的待检蛋白。方法1. 样品的制备从细胞中提取蛋白质样品用于western印记的方法有两种，一是可以在加样缓冲液中直接溶解完整细胞；二是制备细胞提取液。可根据不同的目的采用不同的方法。如果仅是定性实验，可应用第一种方法；如果需测定蛋白含量并进行定量实验，可应用后一种方法。1.1 凝胶加样缓冲液裂解哺乳动物细胞和组织制备蛋白质样品1） 裂解细胞或组织a. 单层培养细胞：用pbs缓冲液漂洗细胞2次，弃去洗液并吸尽残余的pbs液体，加入一定体积（50200l）的加热到85的1sds凝胶加样缓冲液50mmol/l tris.cl(ph 6.8), 100mmol/l 二硫苏糖醇（dtt）, 2% sds, 0.1% 溴酚蓝，10%甘油 溶解细胞，用细胞刮刀把粘稠状的细胞裂解物收集于一个微量离心管中，用于步骤2）。b. 悬浮培养细胞：用冷的pbs充分洗涤细胞后，去尽残液，加入一定体积用冰预冷的悬浮缓冲液0.1mol/l nacl，0.01mol/l tris.cl（ph 7.6），0.001mol/l edta（ph 8.0），1g/ml aprotinin，100g/ml pmsf，涡流振荡混匀后，加入等体积的2sds凝胶加样缓冲液100mmol/l tris.cl(ph 6.8), 200mmol/l 二硫苏糖醇（dtt）, 4% sds, 0.2% 溴酚蓝，20% 甘油，混匀后，用于步骤2）。c. 动物组织：用冷的pbs洗去残血后，加入一定体积用冰预冷的悬浮缓冲液，用剪刀剪碎，如有必要可在冰浴下匀浆，然后加入等体积的2sds凝胶加样缓冲液，混匀后，用于步骤2）。2） 将样品置于沸水浴中加热10分钟。3） 室温下以10000rpm将样品离心10分钟，将上清移至一新管中，分装后，冻存于-20。1.2 裂解缓冲液裂解哺乳动物细胞和组织制备蛋白质样品用于制备哺乳动物细胞蛋白质裂解缓冲液有多种，在对靶蛋白的抗原性一无所知的情况下，一般使用三去污剂和单去污剂裂解缓冲液，然后逐步过渡到更专门的提取方法。三去污剂裂解缓冲液：50mmol/l tris.cl（ph 8.0），150mmol/l nacl，0.02% 叠氮钠，0.1% sds，100g/ml pmsf，1g/ml aprotinin，1% np-40，0.5% 去氧胆酸钠单去污剂裂解缓冲液：50mmol/l tris.cl（ph 8.0），150mmol/l nacl，0.02% 叠氮钠，100g/ml pmsf，1g/ml aprotinin，1% np-40或triton x-100。高盐裂解缓冲液：50mmol/l hepes（ph 7.0），500mmol/l nacl， 100g/ml pmsf，1% np-40，1g/ml aprotinin。无盐裂解缓冲液：50mmol/l hepes（ph 7.0）， 100g/ml pmsf，1% np-40，1g/ml aprotinin。1） 裂解细胞或组织a. 单层培养细胞：用冷pbs缓冲液漂洗细胞2次，弃取洗液并吸尽残余的pbs液体，加入一定体积（50200l）用冰预冷的裂解缓冲液，置于冰上孵育20分钟。然后用细胞刮刀将细胞刮下，连同裂解缓冲液一起移至微量离心管中，用于步骤2）。b. 悬浮培养细胞：用冷的pbs充分洗涤细胞后，去尽残液，加入一定体积用冰预冷的裂解缓冲液，重悬细胞，于冰上放置30分钟后，用于步骤2）。d. 动物组织：用冷的pbs洗去残血后，加入一定体积用冰预冷的裂解缓冲液，用剪刀剪碎，如有必要可在冰浴下匀浆，用于步骤2）。2）于4以12000rpm将裂解物离心2分钟。3）将上清移至一新管中，分装后，冻存于-20。电泳时取出适量的提取液（50g）与等体积的2sds凝胶加样缓冲液混合后，置于沸水浴中加热5分钟以使蛋白变性。2蛋白含量的测定（bradford）2.1 所需试剂1） 0.15mol/l nacl： nacl 0.88g 水 100ml2） 0.5mg/ml 牛血清白蛋白（bsa）：bsa 0.5mg 0.15mol/l nacl 1ml3） 考马斯亮蓝溶液：在1l容量瓶中，将100mg考马斯亮蓝g-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml磷酸，然后补加水至容量瓶体积。用滤纸过滤后，于4保存。2.2 操作步骤1） 分别在两组微量离心管中各加入0.5mg/ml bsa（ 1.0，2.5，5.0，10和20l），以0.15mol/l nacl补足体积至20l，同时以两管20l的0.15mol/l nacl作空白对照。2） 每管各加入480l考马斯亮蓝溶液，振荡混匀，室温放置2分钟。3） 用1cm光径的比色杯测a595，取a595吸光值对标准蛋白浓度作图，画出标准曲线。4） 取待测样品2.5l，补加0.15mol/l nacl 17.5l，480l考马斯亮蓝溶液，混匀后，在a595下比色，从bsa标准曲线中确定待测样品的蛋白含量。如果待测样品的浓度过高，可稀释后再测。3 sds聚丙烯酰胺凝胶电泳和western 印迹3.1 所需试剂1） 30%丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺 29gn，n-亚甲双丙烯酰胺 1g 水 100ml2） 10% sds： sds 10g水 100ml3） 1.5mol/l tris（ph 8.8）：tris 18.17g水 80ml 溶解后，用浓hcl调ph至8.8，补水至100ml，4保存。4） 10% 过硫酸铵：过硫酸铵 0.1g水 1ml 4保存可使用一周。5） 1.0 mol/l tris（ph 6.8）：tris 12.11g水 80ml 溶解后，用浓hcl调ph至6.8，补水至100ml，4保存。6） tris-甘氨酸电泳缓冲液（25mmol/l tris，250mmol/l甘氨酸， 0.1% sds）： tris 3.02g 甘氨酸 18.8g 10% sds 10ml 水至 1000ml7） sds聚丙烯酰胺凝胶电泳12%分离胶所需溶液：水 3.3ml30%丙烯酰胺溶液 4.0ml 1.5mol/l tris（ph 8.8） 2.5ml 10% sds 0.1ml 10% 过硫酸铵 0.1ml temed 0.004ml8） sds聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶所需溶液：水 3.4ml30%丙烯酰胺溶液 0.83ml 1.0 mol/l tris（ph 6.8） 0.63ml 10% sds 0.05ml 10% 过硫酸铵 0.05ml temed 0.005ml9） 甲醇：冰醋酸固定液：甲醇 450ml 冰醋酸 450ml水 100ml10）0.25% 考马斯亮蓝r250染液：考马斯亮蓝r250 0.25g 甲醇：冰醋酸固定液 100ml11）转移缓冲液（48 mmol/l tris，39mmol/l甘氨酸，0.037% sds，20% 甲醇）： tris 5.8g 甘氨酸 2.9g 10% sds 3.7ml 甲醇 200ml水至 1000ml12）丽春红储存液： 丽春红s 2g 三氯乙酸 30g 磺基水杨酸 30g 水至 100ml 使用时，用水稀释10倍。13）封闭液10mmol/l tris.cl（ph 7.5），150mmol/l nacl，2% tween 20，4% bsa： 1mol/l tris.cl（ph 7.5） 1ml 1mol/l nacl 15ml 20% tween 20 10ml 牛血清白蛋白（bsa） 4g 水至 100ml14）洗涤缓冲液10mmol/l tris.cl（ph 7.5），150mmol/l nacl，0.05% tween 20： 1mol/l tris.cl（ph 7.5） 1ml 1mol/l nacl 15ml 20% tween 20 0.25ml 水至 100ml15）抗体稀释液：bsa 0.4g 洗涤缓冲液 100ml 分装后，-20冻存。16）ecl检测试剂盒：北京普利莱公司产品。3.2操作步骤：3.2.1 sds聚丙烯酰胺凝胶电泳1） 根据厂家说明书安装好垂直板电泳槽的玻璃板。2） 配制sds聚丙烯酰胺凝胶电泳12%分离胶溶液。3） 迅速在两玻璃板的间隙中灌注分离胶溶液，留出灌注积层胶所需空间（梳子的齿长再加1厘米）。用吸管小心地在分离胶溶液上覆盖一层水，以防止空气中的氧进入凝胶而抑制聚合反应。将凝胶垂直放置于室温下聚合。4） 分离胶聚合完全后，倾去覆盖层液体，用去离子水洗涤凝胶顶部数次以除去未聚合的丙稀酰胺。尽可能排去凝胶上的液体，再用纸巾的边缘吸净残留液体。5） 制备sds聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶溶液。6） 在已聚合的分离胶上直接灌注积层胶，立即在积层胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡，再补充一些积层胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。7） 当积层胶发生聚合时，从-20取出已制备好的样品及标准蛋白，在100下加热5分钟以使蛋白变性。8） 积层胶聚合完全后，小心移去梳子，用水冲洗齿孔以去除未聚合的丙稀酰胺。将凝胶固定于电泳装置上，上、下槽各加入tris-甘氨酸电泳缓冲液。9） 按预定顺序加样，并在所有不用的样品孔中加入1sds凝胶加样缓冲液。10）将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8v/cm。当溴酚蓝前沿进入分离胶后把电压提高到15v/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部，然后关闭电源。11）从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板，取下凝胶，进行考马斯亮蓝染色或western印迹。3.2.2 用考马斯亮蓝对sds聚丙稀酰胺凝胶染色1） 用至少5倍体积的考马斯亮蓝染液浸泡凝胶，放在平缓摇动的平台上于室温染色4小时以上。2） 移出凝胶并回收染液以备后用，将凝胶浸泡于甲醇-冰醋酸固定液中脱色，至蛋白带非常清晰为止，中间需更换几次脱色液。3） 移出凝胶至含20%甘油的水溶液中，4保存。可随时进行凝胶图象分析或照相。 3.2.3 western印迹1） 当sds聚丙稀酰胺凝胶电泳即将结束时，切6张滤纸和1张硝酸纤维素膜，其大小应与凝胶的大小完全吻合。如果滤纸或凝胶的面积大于凝胶，滤纸和滤膜伸出的边缘就大有机会相接触，造成电流短路而使蛋白质不能从凝胶向滤膜转移。2） 把硝酸纤维素滤膜漂浮于一盘蒸馏水中，借毛细作用使之从下往上湿润后，将之浸没于水中。3） 在一浅盘中加入一定量的转移缓冲液，将6张滤纸浸泡于其中。4） 带手套安装转移装置：先平放底部电极（阳极），上放海绵夹层；然后依次放上3张浸湿的滤纸、硝酸纤维素滤膜、凝胶及另外剩余的3张浸湿的滤纸和海绵夹层；最后用玻璃棒赶出所有的气泡，放上上方电极（阴极），插入电转移槽中。5） 连接电源，根据凝胶面积按0.65ma/cm2接通电流，电转移1.52.0小时。6） 断开电源，取出滤膜，直接浸入蒸馏水中，稍漂洗一下后，移至丽春红染液中染色510分钟，再用蒸馏水漂洗几次，蛋白带清晰可见，迅速标出标准蛋白所在位置后，进行下面的免疫检测。7） 加封闭液封闭滤膜，室温1小时或4过夜，然后用洗涤缓冲液室温下洗三次，每次10分钟；也可以不洗，直接从封闭液中取出滤膜，去尽残液，加入含0.4%bsa