【优秀毕业论文】PDL1在肝癌组织中的表达及临床意义研究.pdf

同等学力人员硕士学位论文 论文题目 pd-l1 在肝癌组织中的表达及临床意义研究 研究生姓名 严 广 指导教师姓名 钱海鑫 专 业 名 称 普通外科学 研 究 方 向 肝癌的基础和临床研究 论文提交日期 2012 年 11 月 pd-l1 在肝癌组织中的表达及临床意义研究 中文摘要 i pd-l1 在肝癌组织中的表达及临床意义研究 中文摘要 目的：目的： 应用免疫组织化学方法研究 pd-l1 在肝癌组织、癌旁组织及正常组织中的表达 差异，探讨其与肝癌临床病理特征的关系，并初步探讨表达差异的临床意义，为肝癌 的免疫干预治疗提供理论依据和实验基础。 方方法：法： 选择诊断明确和随访资料完整的原发性肝癌病例 72 例， 获取患者术后肿瘤标本， 切取石蜡切片，应用免疫组织化学技术，检测 pd-l1 在患者肝癌组织、癌旁组织及 肝脏正常组织中的表达，阐述其与各临床病理参数之间的相关性，评估 pd-l1 的临 床意义。 结果：结果： 应用免疫组织化学方法检测 pd-l1 在肝癌组织、癌旁组织及正常组织中的表达； 统计学分析表明，肝癌与癌旁组织、正常肝组织之间 pd-l1 蛋白表达差异有显著性 (p10 cm 有 17 例， 通过 spearman 相关分析，肝癌组织中 pd-l1 的高表达与肿瘤大小存在正相关 (p=0.0043，p0.05)；72 例肝癌中，期 16 例，a 期 33 例，b 期 23 例，通过 speamran 相关分析，肝癌组织中 pd-l1 的高表达与临床 分期存在正相关 （p=0.0002， p0.05)； 72 例肝癌中， afp0.05)。 上述结果表明：肝癌组织中 pd-l1 的高表达与肝癌病理分级、血清 afp 水平 （g/l）无关；而与临床分期、肿瘤大小相关（p0.05） 。 结论：结论： 中文摘要 pd-l1 在肝癌组织中的表达及临床意义研究 ii 在肝癌组织、癌旁组织中均检测到 pd-l1 的表达，但是 pd-l1 在肝癌组织中的 阳性表达率明显高于癌旁组织及正常组织。临床上对于如何进一步判断患者的预后， pd-l1 有可能会成一个新的指标。 在具有高风险、 预后较差的患者， 借助于 pd-l1 检 测，提前干预，采取有效治疗措施，预防疾病的进一步恶化；通过 pd-l1 拮抗剂的 应用，阻断 pd-1/pd-l1 通路抑制信号的传递，可能成为肝癌免疫治疗新靶点。 关键词关键词：协同刺激分子；pd-l1；肝癌；免疫组织化学 作作 者者： 严 广 指导老师指导老师： 钱海鑫 research on expression of pd-l1 and its clincical significance in primary hepatocellular carcinoma abstract iii study of pd-l1 expression in hepatocellular carcinoma and its clinical significance abstract objects: to study the differential expression of human pd-l1 in liver cancer tissues, paracancer organizations and normal tissues using immunohistochemical methods, and its relationship with clinical pathological features, and to investigate the clinical significance of the differential expression of pd-l1 to provide cancertheoretical and experimental basis for immune intervention therapy for liver cancer. methods: 72 cases of primary liver cancer were choosed with a clear and complete diagnosis follow-up data, access to the patients tumor specimens from surgery, then cut paraffin sections and apply immunohistochemical techniques to analysis the expression of pd-l1 in the patients with liver cancer tissue, paracancer organizations and normal tissues. the correlation between the expression of human pd-l1 and the patients clinicopathological parameters was investigated by statistical methods. the clinical significance of pd-l1 expression was also evaluated with the experimental results and clinical data. results: pd-l1 is expressed in the liver cancer tissues, paracancer tissues and normal tissues. the results of statistical analysis showed that the difference of the expression of pd-l1 protein between liver cancer tissues and normal liver tissues has statistically significant (p0.0001). among of 72 cases of liver cancer, there were 18 cases with tumors smaller than or equal to 5 cm, 5-10 cm 37 cases, and there were 17 cases with tumors more than abstract research on expression of pd-l1 and its clincical significance in primary hepatocellular carcinoma iv 10cm, the results indicated that pd-l1 expression and tumor size existence is related (p=0.0043, p0.05) through the speamran related analysis. the 72 cases of liver cancer could be divided into stage16 cases, stagea 33 cases, stageb 23 cases, and pd-l1 expression and stage had statistically relation (p=0.0002, p4 倍组织体积。 标本固定的主要目的是（1）清除类脂，有利于抗原-抗体相结合，从而使抗原- 抗体结合物易于得到满意的染色结果； （2） 使标本和载玻片贴附紧密， 不易剥落； （3） 标本妥善固定后方便保存。 2、组织脱水、组织脱水 经固定后，组织标本依然含有较多的水分，而透明剂石蜡和苯无法与水相融合。 所以先要把水从标本组织中脱去。脱水剂一般既有使标本组织硬化的作用，同时脱水 剂一定也是与水在任意比例下均可以混合的液体。酒精是通常所用的脱水剂，沸点 78.4。脱水能力强并能使组织硬化，能较好地与二甲苯透明剂相混合。最终结果表 明 ： 只 要 脱 水 环 节 处 理 好 ， 都 会 得 到 好 的 切 片 。 酒 精 脱 水 的 顺 序 为 75%-80%-95%-100%， 各级酒精脱水时间一般为 2-4 小时， 主要根据组织材料的厚薄、 大小而决定。100%的酒精有使标本组织硬化的作用，时间上要控制，不适合太长， 一般情况下不宜超过 3 小时。 3、组织透明、组织透明 透明对组织有透明、 脱酒精两种作用。 常用的透明剂为二甲苯， 不影响各种染色。 通常为半小时到 1 小时左右。当二甲苯透明时必须持组织放在专用二甲苯皿器中，不 得将水滴混入二甲苯中。 本实验应用二甲苯作为透明剂， 100%乙醇： 二甲苯 （1:1） 15 分钟，二甲苯 15 分钟，二甲苯 15 分钟。 4、组织浸蜡（透蜡）、组织浸蜡（透蜡） 组织标本经脱水、透明后，将石蜡等支持剂渗透到组织标本内部，同时把组织中 二、资料与方法 pd-l1 在肝癌组织中的表达及临床意义研究 8 的透明剂清除，将软组织形成为蜡块，具有适当的硬度，从而有利于切成切片。浸蜡 的要点主要有： （1）在标本组织细胞的内外两面，石蜡都要均匀而紧密的贴附，使组 织和石蜡形成为一个密不可分整体。 （2）组织细胞的每个部分都要完全渗入石蜡；浸 蜡一般设置熔点，5052为第一缸蜡，5254为第二缸，5456为第三缸。浸 蜡的时间根据不同组织类型及其大小而定。组织 12cm 大小，浸蜡 23 小时；2 3cm 浸蜡 35 小时。浸蜡时石蜡在温箱内的温度应与石蜡的熔点相配合，温度不可 过高过低，过高会使组织高度收缩变脆，无法切片，过低石蜡将凝固达不到浸蜡的作 用。常规的作法是调节至略高于石蜡熔点 23。控制温度是浸蜡极其重要的关键。 5、石蜡包埋、石蜡包埋 准备好金属包埋框，将液态的石蜡缓慢、均匀的倒入，于底部将浸好蜡的组织块 平放。待凝固、冷却、变硬，然后修整蜡块。 6 切片前准备切片前准备 （1）修整蜡块 切去过多的石蜡，四周留约 2mm。留得过少，使连续切片分片 困难且易破坏组织，留得过多，徒占地方，同时使标本之间的距离过远而镜检不便。 蜡块两边必须切成平行的直线，否则切下的蜡条弯曲，也不可修成圆角，致蜡带容易 分开不能成条。 （2）玻片处理 一般玻片用 76 26mm 载片，厚度 l1.5mm,厚于 1.5mm 的玻片 不宜用于高倍镜及油镜的观察。 新的玻片也必须擦洗干净， 否则染色时引起切片脱落。 方法有煮沸洗涤法洗液浸泡法。最后经 95酒精浸泡脱脂、烘干。放置冰箱备 用。 7、制片 (1)将冷却蜡块妥善固定在石蜡切片机，将蜡块的切面与刀口成平行之方向。通 常切片刀的倾斜角度为 15 ，调整切片机，调节 6m 的切片厚度，予切片。 (2)左手持笔刷，右手操作切片机，切片出来后，用笔刷轻轻托起，然后予眼科 镊小心夹取蜡片，以切片正面置入展片箱中，其水温一般控制在 40-43左右。等 待切片平整后捞片。 (3)贴附切片 左手持载玻片的一端，垂直入水，将载玻片贴附切片。右手可用笔 刷辅助推动，于载玻片三分之二处附贴。 pd-l1 在肝癌组织中的表达及临床意义研究 二、资料与方法 9 (4)切片贴附后，可置于空气中，待晾干后即予烤片。 （四）he 染色方法及步骤 1、he 染色方法染色方法 苏木精-伊红染色法 即 he 染色法，是石蜡切片技术中最常用的染色法之一。胞 质内的核糖体、细胞核内的染色质能够被碱性的苏木精染成紫蓝色；伊红的化学性质 为呈酸性染液，而细胞质和细胞外基质中的成分能够被之染成红色。 2、具体操作步骤、具体操作步骤 （1）二甲苯切片脱蜡两次，各 510 min。 （2）100%、95%、85%、70%酒精，各级为 25 min。蒸馏水转入染液。 （3）苏木精染色 515 min。 （4）洗片，0.51%盐酸酒精分色。镜检视细胞核及核内染色质清晰，约数 10s。 （5）流水冲洗 1530 min。 （6）蒸馏水短洗。 （7）0.10.5%伊红染色 15 min。 （8）经 70%、85%、95%、100%酒精脱水，各级为 23 min。 （9）二甲苯透明（二次） ，约 10 min。 （10）封片：滴加适量中性树胶，加盖玻片封固。 结果：细胞浆红色，细胞核蓝紫色。 （五）免疫组化染色方法及具体操作步骤 1、免疫组化染色方法：、免疫组化染色方法： （1）脱蜡和水化 主要目的是能够让组织中的抗原充分与抗体等试剂相结合反应， 得到满意的实验 结果。脱蜡的流程一般先予 60孵育 20 min，后予二甲苯 1-3 分别 10 min。水化常 用梯度乙醇（由高到低） 。 （2）抗原的修复 二、资料与方法 pd-l1 在肝癌组织中的表达及临床意义研究 10 在组织固定过程中，由于抗原蛋白交联以及醛基的抗原封闭作用，导致抗原性的 丢失； 通过一系列措施， 使抗原得到修复， 从而细胞内的抗原决定簇得到了重新暴露， 抗原的检测率得到进一步提高。常用的实验室修复方法分为三种，从弱到强分别是胰 酶修复、微波修复、高压修复。微波修复应用于本实验中，中火 6 min 4 次，修复效 果良好。注意微波修复后自然冷却 30 min 左右。 （3）细胞通透 在免疫组化及免疫细胞化学中，一般情况下选用 triton x-100 作为细胞通透剂， 在膜上打孔，主要是可以让抗体充分地进入组织细胞内进行有关结合反应。其可以溶 解组织细胞膜上的脂质双分子层，从而使抗体、大分子结构的物质顺利通过膜，进入 胞浆及胞核内。因此，在免疫组化时常常被使用，从而使抗体进入胞内，顺利与相应 抗原相结合。 （4）生物素及内源性过氧化物酶的灭活 在传统的 abc 法和 sp 法中，内源性过氧化物酶（pod）和生物素常常影响免 疫组织化学反应的结果，要降低其对结果的影响，常常用卵白素及过氧化氢等进行有 效的灭活。 内源性过氧化物酶的灭活， 一般选用 3%过氧化氢， 灭活时间一般为 10 min 左右， 如果选用 0.3%过氧化氢， 那么就可以适当延长封闭的时间， 一般情况下为 10 30 min；双蒸水或 pbs 配置过氧化氢的实验效果与用甲醇相比，效果稍差。用甲醇配 置可以更好地起到组织固定及抗原保护作用。过氧化氢孵育的时间不宜过长，否则极 易引起组织脱片；过氧化氢最好的是即配即用，配好后 4保存，注意避光措施。 （5）血清封闭 组织病理切片上如果有剩余的位点，那么其就可以非特异性的与一抗相结合，造 成后续假阳性的结果；封闭血清一般情况下是和二抗同一来源的，血清中动物自身的 抗体，可以预先和组织细胞中有交叉反应的特异位点发生特异性的结合；封闭血清切 记不可以与一抗来源相一致，能够选用羊血清、小牛血清、bsa 等封闭血清，温度 一般选择室温或者 371030 min。 （6）一抗和二抗浓度和孵育时间 免疫组织化学中的最关键的环节是一抗的孵育条件， 包括孵育的时间以及抗体的 浓度。一抗孵育的温度一般有如下几种：37、室温、4，其中实验效果最佳的 pd-l1 在肝癌组织中的表达及临床意义研究 二、资料与方法 11 温度为 4； 孵育的时间：主要和温度、抗体浓度有关，常用 4过夜、37，1-2h。 本研究采用 4过夜。二抗孵育的相关条件：二抗一般室温或 37 30min1h，本 研究采用室温。具体的浓度一般有工作液，假如是浓缩液，要注意浓度的配制。在实 际实验操作中，往往首要确定二抗的浓度和孵育的时间，进一步再研究、探索一抗的 浓度及孵育的时间。 （7）抗体稀释液 一般实验室多采用 pbs 液作为抗体稀释液，目前专用的抗体稀释液中，除 pbs 成份外，增加 bsa 稳定剂、叠氮化钠防腐剂等成分，有利于抗体的多次回收利用， 效果不错。所以建议选用专用的抗体稀释液。 （8）切片清洗（浸洗、冲洗和漂洗） 加强切片的清洗，如延长清洗时间及增多清洗次数，主要是为了防止一抗、二抗 等试剂残留，导致非特异性染色，影响实验结果。由此可见，适当地加强切片清洗， 延长清洗的时间及增多清洗的次数，对整个实验结果举足轻重。 注意事项：要求单独进行冲洗，以避免交叉反应所造成污染，影响实验结果； 不可猛烈冲洗， 要求温柔、 缓慢冲洗， 防止切片的脱落； 切片冲洗的时间要充分， 这样才有可能彻底冲洗掉结合的物质；pbs 的 ph 及离子强度的使用、要求。ph 在 7.47.6 时，浓度是 0.01m。免疫复合物在中性、弱碱性条件下易形成，反之， 在酸性条件易分解；低离子强度条件下对免疫复合物的形成有利，反之，在高离子强 度条件下对则有利于免疫复合物的分解。 （9）dab 显色 dab 孵育条件的改变可以决定背景的深浅程度、特异性染色的深浅程度。dab 显色的时间不是一成不变的，主要由病理医师在显微镜下来控制显色的时间，当看到 本底着色较浅，而显现特异性染色较强时，那么就能够冲洗；如果当 dab 显色的时 间过长时， 假设超过十几分钟， 才出现染色阳性， 原因： 可能封闭的时间过分延长； 很可能孵育的时间过短 （最好一抗 4 度过夜） ， 及抗体的浓度过低所致。 如果当 dab 显色时间很短，假设几秒，已经出现深染的棕褐色，其原因很可能是抗体孵育时间过 长、抗体浓度过高所致，根据具体情况，需要进一步采取下调抗体浓度或缩短抗体孵 育时间等措施；如果当极短时间就已经有背景很深的情况出现，最困难的原因是前面 二、资料与方法 pd-l1 在肝癌组织中的表达及临床意义研究 12 的对非特异性蛋白封闭不全，需要进一步延长封闭时间来解决。 （10）复染 病理制片中经常用胞核染料-苏木素进行复染，主要的目的是形成结构清晰的细 胞轮廓，进而能够有效地对目标蛋白进行良好、准确的定位。尤其注意的是苏木素复 染的时间的确定，主要根据现场的溶液新旧情况、室内温度情况及目标抗原的定位等 情况，一般来说数秒至数分钟即可，胞浆蛋白可以适度将时间延长，而胞核蛋白时间 就得缩短。但是，即使染色未达到满意效果，亦可采取一定的措施进行补救。即：如 果染色深的话，那么分化时间可以适当延长；如果染色浅的话，可复放入苏木素中染 色。 盐酸、 酒精的作用主要是分化， 氨水的作用主要是返兰。 他们相互之间作用不同。 病理切片复染程序完成后需要进行流水振荡冲洗，然后将病理切片置于盐酸、酒精溶 液中数秒钟，随后拿出来流水振荡冲洗，最后再放入氨水中进一步返兰。 （11）封片 为了达到切片能够长期保存的目的，实验予中性树胶等封片，避免产生气泡。具 体方法如下：在位于载玻片的组织上滴一滴中性树胶，两手分置盖片的两个对角，先 降低一角触及液体；当液体接触面沿盖片在不断弥散时，那么就缓慢降低另一角。这 样操作一般情况下回避免气泡的产生。 2、具体操作步骤、具体操作步骤 免疫组化三步法具体操作如下： 石蜡切片常规脱蜡至水化用 pbs（ph 7.4）冲洗 3 次，每次 3 min； 用 edta 缓冲液浸泡(ph 8.0)，微波修复中火 6 min 4 次，微波修复后让其自 然的冷却 30 min 左右。抗原充分暴露； 在每张病理切片上，予以滴加过氧化酶阻断溶液（试剂 a）50l，室温下孵 育 10 min，pbs 冲洗 3 次，每次 3 min； 除去 pbs 液，将 50l 正常非免疫动物血清（试剂 b）滴加在每张病理切片， 室温下孵育 10 min； 除去血清，将 50l 浓度为 10g/ml 第一抗体滴加在每张病理切片上，4过 夜； pd-l1 在肝癌组织中的表达及临床意义研究 二、资料与方法 13 pbs 冲洗 3 次，每次 3 min，除去 pbs 液，每张病理切片加 50l 生物素标记 第二抗体（试剂 c）室温下孵育 10 min，pbs 冲洗 3 次，每次 3 min； 除去 pbs 液，每张病理切片加 50l 链霉菌抗生物素-过氧化酶溶液（试剂 d） 室温下孵育 10 min，pbs 冲洗 3 次，每次 3 min； 除去 pbs 液， 新鲜配制 dab 50l， 滴加在每张病理切片上， 显微镜下观察 3 10 min； 自来水冲洗，苏木素复染。自来水冲洗返蓝或冲洗后用 pbs 快速返蓝； 梯度酒精脱水、干燥，二甲苯透明中性树胶封固； 两步法至步骤与三步法不同，不用正常血清封闭，直接滴加一抗过夜，然后 直接滴加聚合辣根过氧化物酶、特异性二抗，余步骤相同。阴性对照予 pbs 50l 代 替第一抗体，余步骤相同。 （六）检测 pd-l1 在肝癌组织中表达和分布结果判断标准 免疫组织化学读片由两名资深病理学家，一为副主任医师，另一为主任医师进行 独立视片。阳性染色是在肿瘤细胞膜或胞浆中出现棕黄色颗粒。任意随机进行 5 个 视野的选择，在 100 倍镜头下观察染色细胞，按照切片中着色的肿瘤细胞所占百分 比区分如下： “” ，无肿瘤细胞着色； “+” ，1%30%肿瘤细胞着色； “+” ，30% 60%肿瘤细胞着色； “+” 60% 肿瘤细胞着色，并适当结合免疫组化染色强度评 估染色情况。将组化染色评分为“”和“+”的列入阴性表达组，将组化染色评分 为“+”和“+”的列为阳性表达组。 （七）统计学方法 所有统计学分析采用 spss17.0 统计软件对资料进行分析，两组差异用 mann-whitney u test、多组差异用 kruskal-wallis h test，检验水准为双侧 =0.05。 三、结果与讨论 pd-l1 在肝癌组织中的表达及临床意义研究 14 三、结果与讨论 （一）结果 3.1 pd-l1 在肝癌组织中在肝癌组织中异常高异常高表达表达 免疫组化染色结果显示， 在正常肝组织， 细胞膜和胞浆中可出现少量棕黄色颗粒， 细胞着色不多。癌旁组织中细胞着色稍多，胞膜和胞浆中棕黄色颗粒稍多。肝癌组织 中细胞膜和胞浆中棕黄色颗粒大量聚集，肿瘤细胞着色明显。阴性对照组细胞膜和胞 浆无着色（图 1、表 1 和表 2） 。 图图 1 pd-l1 在正常肝组织、癌旁组织和肝癌组织中的表达（在正常肝组织、癌旁组织和肝癌组织中的表达（100 ） pd-l1 在肝癌组织中的表达及临床意义研究 三、结果与讨论 15 表表 1 pd-l1 在肝癌细胞中表达的特点及染色细胞数在肝癌细胞中表达的特点及染色细胞数 蛋白 表达特点 染色细胞数 pd-l1 细胞膜、胞浆呈棕黄色 83% 表表 2 pd-l1 蛋白在原发性肝细胞癌、其癌旁组织、正常肝组织中的表达蛋白在原发性肝细胞癌、其癌旁组织、正常肝组织中的表达 位置 pd-l1 阳性表达 阴性表达 肝癌组织 45 27 癌旁组织 8 64 正常肝组织 0 10 2 x值 47.7316 p 值 0.0001 通过 pearsonehi-square 检验，肝癌与癌旁组织、正常肝组织之间 pd-l1 蛋白表达差异有显著 性(p10 cm 有 17 例， 通过 spearman 相关分析， 肝癌组织中pd-l1的高表达与肿瘤大小存在正相关(p=0.0043， p 10 cm 14 3 3.3.2 pd-l1 表达与肝细胞肝癌临床分期的关系 72 例肝癌中，期 16 例，a 期 33 例，b 期 23 例，通过 speamran 相关分析， 肝癌组织中 pd-l1 的高表达与临床分期存在正相关(p=0.0002，p0.05) （表 5） 。 表表 5 肝细胞肝癌患者肝细胞肝癌患者 pd-l1 蛋白表达与病理分级的关系蛋白表达与病理分级的关系 病理 分级 pd-l1 表达 阳性表达 （例） 阴性表达 （例） 相关系数 p 值 级 6 3 -0.1217 0.2887 级 15 14 级 16 7 级 8 3 3.3.4 pd-l1 表达与血清 afp 水平（g/l）的关系 表表 6 肝细胞肝癌患者肝细胞肝癌患者 pd-l1 蛋白表达与血清蛋白表达与血清 afp 水平水平（ g/l）的关系的关系 临床指标 pd-l1 表达 afp 水平 （g/l） 阳性表达 阴性表达 相关系数 p 值 0.05） 。 上述结果表明： 通过 pearsonehi-square 检验， 肝癌与癌旁组织、 正常肝组织之间 pd-l1 蛋白表达 差异有显著性(p10 cm 有 17 例， 通过 spearman 相关分析，肝癌组织中 pd-l1 的高表达与肿瘤大小存在正相关(p=0.0043，p0.05)。 72 例肝癌中，期 16 例，a 期 33 例，b 期 23 例，通过 speamran 相关分析， 肝癌组织中 pd-l1 的高表达与临床分期存在正相关(p=0.0002，p0.05)。 72 例肝癌中， 患者 afp0.05） 。 （二）讨论 肝脏是机体新陈代谢的重要器官,同时也是重要的免疫器官。研究实验表明，在 原发性肝癌发生、发展的过程中，除了与多种基因在不同染色体上的变化外，还和多 因素、多基因、多步骤密切相关，其实质是一种复合基因病。目前人们将彻底根治肿 瘤的希望寄托于基因治疗。肝脏具有躲避潜在免疫损伤、保卫自身的特性，显现在对 外来抗原的免疫耐受性，却容易引起病毒持续感染，无助于清除病毒。然而，免疫耐 受环境形成的机制还存在不清楚之处。b7 家族的协同刺激分子，如程序性死亡分子 -1(pd-1) 的缺失、 突变或过表达都与恶性肿瘤的发生相关， 而这些变异的基因也可作 为基因治疗的作用靶点15。 虽然对于肝癌的诊疗手段目前有了长足进步， 但仍有待从 不同角度进一步探讨肝癌病理机理，并探索肝癌诊断和治疗的新手段。 恶性肿瘤病程中，肿瘤细胞及其生长的微环境（tumor microenvironment）相互作 用，影响着肿瘤病程和转归16。肿瘤微环境包括了肿瘤细胞以外的各种细胞（例如血 管内皮细胞、巨噬细胞、nk 细胞、细胞毒性 t 细胞、调节性 t 细胞和 b 细胞等） 、 基质和细胞因子和免疫分子17。 其中协同刺激分子是肿瘤免疫应答过程中肿瘤细胞与 免疫细胞、肿瘤细胞之间和免疫细胞之间相互作用的重要介质。 rudolf virchow 首次发现，恶性肿瘤组织中存在有大量的炎症浸润，肿瘤微环境 中，慢性炎症细胞亦参与其中18。目前的科学研究亦显示，肝癌的发生与炎症细胞的 浸润以及肿瘤微环境的构成密切相关19。 免疫细胞以及炎症细胞对于肿瘤的发生、 发 展，作用显著。炎症细胞以及免疫细胞参与肿瘤的发生、发展，并抑制了 t 细胞的 增殖，t 淋巴细胞的数量与肝癌的治疗预后成正相关20。在机体抵御外来抗原以及 防止自身免疫性疾病的过程中，免疫应答适时的开启，恰当的终止，作用显著，而这 pd-l1 在肝癌组织中的表达及临床意义研究 三、结果与讨论 19 依赖于 t 细胞所获得的正、负性协同刺激信号间达到的某一平衡。 b7 家族就是协同刺激分子两个超家族（tnf/tnfr 和 b7/cd28 超家族）中的族 员之一，b7 家族是第二信号分子，可以将刺激信号由抗原提呈细胞传递至 t 淋巴细 胞。近年研究发现，多种协同刺激分子肝癌细胞均可异常表达。癌细胞表达 cd80、 cd86、cd137 和 cd274 等一系列共刺激分子。cd274 即是 pd-l1，是 b7 家族成员 之一21。 程序性死亡因子-1（pd-1）亦是 b7 家族的一员，pd-1(programmed death-1) 是 pd-l1 的受体，称作程序性死亡-l 受体，和细胞毒 t 淋巴细胞相关抗原-4（ctla-4） 分子具有 23的同源性。各种淋巴组织及非淋巴组织中广泛表达。pd-1 基因的胞内 段包含有一个基序，正因如此，恢复了胞质段的磷酸化的作用，拮抗抗原受体信号的 功能得到充分的显示，这一基序，为免疫受体酪氨酸依赖抑制基序(itim)，在 n 端， c 端各有 1 个免疫受体酪氨酸转换基序(itsm)， 这 2 个区域与 pd-l 转导抑制性信号， 进而抑制免疫应答有关。在 pd-1 胞外区中，有一个 igv 样结构域，包含 4 个 n 连接 糖基化位点，在与配体 pd-l1 的结合中尤为关键。它可调节 t 细胞的活性。 pd-1 有两个配体，即 pd-l1 和 pd-l2（也称 b7-h1 和 b7-dc） ，已经证实有共 刺激分子的特征。大量文献已表明 pd-l1 可对 t 细胞进行负性调节并维持外周的免 疫耐受。pd-l2 确切的作用机制还需进一步证实。pd-1/pd-l1 信号途径参与自身免 疫、移植免疫、及肿瘤免疫等机体免疫调节过程。 在鼠的肝组织中，发现 pd-l1 表达于 kuffer 细胞和肝窦的上皮细胞。通常情况 下，肝细胞可表达低水平的 pd-l1，但在干扰素的刺激下，pd-l1 的表达将会增强。 在进行肝癌细胞的体外培养时，也发现肝癌细胞中表达的 pd-l1 可诱导 t 细胞的凋 亡。在鼠模型中，pd-l1 的缺乏可导致肝中 t 细胞聚集和诱导 t 细胞凋亡的失败。 腺病毒感染时，pd-l1 的缺乏可增强针对腺病毒的肝免疫效应细胞的增殖作用。 有关研究亦表明，新近发现的负性协同刺激分子 pd-l122，可通过作用于致敏 t 细胞，对免疫应答起到负性调控，在 t 细胞的活化过程中产生负向作用，使 t 细胞 处于失能状态，抑制 t 细胞的抗肿瘤免疫应答。对肝癌细胞的免疫逃逸23，以及肝 癌的转移与迁徙等过程作用显著。本研究显示负性协同刺激分子 pd-l1 在肝癌组织 中异常高表达且与临床分期、肿瘤大小相关。说明协同刺激分子 pd-l1 在肝癌细胞 三、结果与讨论 pd-l1 在肝癌组织中的表达及临床意义研究 20 中的表达变化是构成肝癌细胞微环境的非常重要的因素，伴随着肝癌发生、发展的整 个病程。可能表现在负性协同刺激分子表达的异常增高、正性协同刺激分子的表达下 降或者突变，最终引起了 t 细胞的凋亡以及功能抑制。因此，在恶性肿瘤细胞里，异 常高表达的 pd-l1 等负性协同刺激分子，对于恶性肿瘤细胞免疫逃逸作用明显。 t 细胞活化过程中，如果缺少了由协同刺激分子提供的第二信号，将会导致严重 的后果：t 细胞的无反应性；或特异性免疫耐受；甚至 t 细胞的凋亡。另外，阻断 了由协同刺激分子提供的第二信号，亦可抑制不利的免疫应答，如在体内应用抗 b7 分子的抗体封闭 b7-1 和 b7-2，以抑制移植排斥反应，可延长同种移植物的存活期。 在整个机体免疫应答过程中， 正性和负性协同刺激信号的调节及两者之间的平衡发挥 着重要的调节作用24。 相关研究显示： 在肝癌患者的癌组织及癌周组织中， 有大量淋巴细胞聚集且 pd-1 染色呈阳性。因此，可推断 pd-1 的表达水平由淋巴细胞的浸润程度所决定。pd-1 可 在浸润性淋巴细胞内表达。这些浸润性淋巴细胞的 cd3 表达呈阳性，如同肝癌组织 中 t 淋巴细胞表达一样。并且在部分浸润性淋巴细胞内 foxp3 的表达也呈阳性，表 明调节肝细胞癌中的 t 细胞可以抑制 pd-1 的表达。因为当 t 细胞活化时，由于协同 刺激分子 pd-1 与 pd-l1 的结合， 而诱生 t 细胞表面表达细胞毒 t 淋巴细胞相关抗原 -4（ctla-4）分子，其是 b7-1、b7-2 的受体。其胞浆内的 itim 基序经活化 shp-1 等磷酸酶， 使 cd3 分子内的 itim 中已磷酸化的酪氨酸去磷酸化， 产生抑制活化的作 用。 t 细胞活化的表现主要是在抗原一旦激活成熟的 t 细胞以后， 那么就将诱使其迅 速表达多种细胞因子，例如 il-2、il-4、il-7、il-1025等等。同时其经过自分泌或旁 分泌的作用， 促使 t 细胞进一步克隆、 扩增， 同时也促使其子代细胞分化成效应细胞。 在 t 细胞增殖、分化的后期，明显具备了合成特殊效应分子的强大能力，例如辅助、 炎症、杀伤等功能所需的蛋白质。当效应细胞遇到携有抗原的靶细胞时，可迅速启动 对机体靶细胞的免疫性攻击。t 细胞活化所需要的比较严格的条件明显降低之外，效 应 t 细胞明显增加了活化的敏感性26。 pd-1/pd-l1 信号途径能够起到负性调节作用， 主要是在 t 细胞活化的启动阶段， 通过抑制自身反应 t 细胞扩增以及激活，从而限制其以及靶器官损害，进一步抑制 pd-l1 在肝癌组织中的表达及临床意义研究 三、结果与讨论 21 初始扩增和向效应 t 细胞的分化。相关文献也同样提示：pd-l1 的表达在肝癌的早 期就比较显著，是肿瘤演变过程中的早期事件，意味在肝癌进展过程中 pd-l1 的表 达或许在免疫逃逸中发挥了重要作用。 t 细胞活化信号转导的早期，蛋白酪氨酸激酶起了活化作用27。参与 t 细胞活 化早期的 ptk 主要有 p56lek 和 p59 等。 p56lek 主要与 cd4 或 cd8 的胞浆尾部相连。 zap-7028在胞质中，当受体交联时，与 tcr 有关的膜蛋白如 cd3、cd4 或 cd8 的 胞浆尾部同时聚在一起，促使带有酪氨酸的蛋白发生磷酸化而活化，产生激酶活化的 级联反应，导致细胞核内转录因子活化，转录因子活化 t 细胞活化信号，经磷酯酰肌 醇代谢，活化 pkc 和钙离子信号途径及 ras-map 激酶途径，产生激酶磷酸化的级联 反应。放大了开始时的活化信号，就像发生在补体活化过程中的级联反应一样，使 t 细胞内转录因子活化，结合到有关基因的调控区，增强了启动子的活性，而促使转录 开始。 pd-1 基因的胞内段包含有一个基序，为免疫受体酪氨酸依赖抑制基序(itim)， 在 n 端，c 端各有 1 个免疫受体酪氨酸转换基序(itsm)，这 2 个区域与 pd-l 转导抑 制性信号，进而抑制免疫应答。正因如此，通过协同刺激分子 pd-1/pd-l1 的信号通 路，恢复了胞质段的磷酸化的作用，拮抗抗原受体信号的功能得到充分的显示，导致 肿瘤的免疫逃逸。 体内实验表明，在免疫缺陷型 rag-2-/-小鼠体内，分别植入空载的 p815 肿瘤细 胞和转染 pd-l1 的 p815 肿瘤细胞，立刻注射激活的 2c t 细胞，结果显示：前者 t 细胞明显增多，后者 t 细胞没有增加，显现 2c t 细胞的凋亡29。pd-ll-/-p815 肿瘤 细胞通过转基因方式表达 pd-l1， p815 对溶胞作用易感性降低， 该作用由细胞毒性 t 细胞产生，特异性 t 细胞抗原受体介导，同时其肿瘤诱发、侵袭能力明显增强。但通 过 pd-l1 单抗进行阻断可逆转