生物物理.pdf

生物化学与生物物理进展 P r o g r e s s i n B i o c h e m i s t r y a n d B i o p h y s i c s ， 2 0 0 6 ，3 3 ( 1 0 ) ： 9 9 4 9 9 9 www p i b b a c c a P t 1 ；3 牛不同供体核克隆囊胚 X i s t 基因 D N A甲基化程度的比较研究 冰 曹更生 ， 高 宇l 3， 戴蕴平 ， 李 荣 赵要风 ， 李 宁 ( 中国农业大学农业生物技术国家重点实验室，北京 1 0 0 0 9 4 ； 。 河 南大学生命科学学院 ，开封 4 7 5 0 0 1 ； ) 中国农业 大学动物科技 学院，北京 1 0 0 0 9 4 ) 摘要利用亚硫酸氢盐测序法分析 H o l s t e i n奶牛胎儿成纤维细胞 ( F F B ) 和输卵管上皮细胞 ( F O V ) 来源的克隆囊胚 X i s t 基因 D NA甲基化状况，以体外受精囊胚 ( F ) 和供体细胞作对照 克隆囊胚 X i s t 基因处于较低程度的 D NA甲基化状态，其中， F F B来源的克隆囊胚 X i s t 基因 D N A 甲基化程度为 4 3 ，而 F O V来源的克隆囊胚仅为 1 7 在体外受精囊胚中， Xi s t 基因 D N A甲基化处于中等状态，为 4 9 然而，在体细胞中，X i s t 基因的甲基化程度较高，F F B为 6 6 ，F OV为 6 3 这些结果 说明，Xis t 基因 D NA甲基化足可以被重编程的，所榆测的C p G岛可能调节 X i s t 基因的表达 结合已发表的实验数据，在同 一 个体中，F F B来源的克隆囊胚发育率比F OV的低，但其克隆牛胎儿的妊娠率和产犊率比F O V的高，这暗示不同供体核克 隆囊胚的重编程是有差异的，并可能影响到胚胎及个体的发育 关键词x失活特异转录物，D N A甲基化，克隆囊胚 学科分类号s 8 1 4 8 为消除两性性染色体基因在表达量上 的差异 ， 雌性哺乳动物的一条 x染色体在胚胎发育 时失活 x失活特异转录物 f X i n a c t iv e s p e c i fi c t r a n s c r i p t ， X i s t ) 是导致 x染色体 失活的关键基 因，它是一种 非编码的 R N A基因，在胚胎发育早期 ，从 x染色 体失活 中心 f X i n a c t i v a t i o n c e n t e r ，X i c )被转录 出 来，当 X I S T转录物扩散至整个 x染色体上时，该 染色 体将变成非活性的 x染色体( xi 1 而 克隆胚胎 的核来源于体细胞，它们必须适当地消除分化细胞 的细胞记忆，适 时失活 x染色体 ，克 隆胚胎才能 正常发育 因此 ，x染色体失活发生异常，可能影 响到动物的克隆效率和个体发育 J 1 为提高克隆效率和解决克隆动物发育异常等 问 题 ，近年来，生物学家对动物克隆机理进行了一系 列的研究，目前认为表观修饰异常是导致动物克隆 异常的主要原因，而 X染色体作为研究表观修饰 的模式材料，x染色体失活是克隆机理的研究热点 之一 E g g a n等 2 1 将绿色荧光蛋 白f G F P ) 转染到小 鼠 父源的 X染色体( X p ) 上 ，以此来监测 X p在小 鼠克 隆胚胎早期的失活变化状况，结果发现，处于卵裂 期的克隆胚胎，其两条 X染色体均处于活性状态 ， 而在胚胎 附植前期，将来发育成胎儿 的内细胞团细 胞 ，其 X染色体有一条发生随机 失活 ，而将来发 育成胎盘等胚外组织的滋养层细胞 ，其父源 X p发 生印记失活 No l e n等【s 1 认为，尽管失活的 x染色体 在小鼠克隆胚胎发育中能被再次激活，但却不能对 Xi c进行有效 的调节 ，同时，研究还发现克隆胚胎 存在着大量表观修饰的异质，( h e t e r o g e n e i t y ) 在印 记基因的研究中发现 ，小鼠克隆囊胚仅有 4 的印 记基因表达是正常的，而其他绝大多数印记基因表 达为异常4 1 与 自然受精胚胎相 比，克隆胚胎在桑 椹胚和囊胚期常染色体区的 DN A处于低甲基化水 平，而异染色体 区的 D NA则处于高甲基化水平 5 1 对 克 隆 牛 胎 儿 的研 究 发 现 ， 无 论 在 单 个 基 因 ( L e p t i n a和 P O U5 F 1 ) 水平 ，还 是在整 个基 因组水 平，均存在着 DN A C p G岛甲基化异常现象 7 Xu e 等【s 1 对 MA O A及其他 9个 X染色 体连 锁基 因的研 + 国家 自然科 学基 金( 3 0 2 2 1 0 0 5 ) 和 国家重 大基 础研究发展规划 f 2 0 0 6 C B1 0 2 1 0 0 ) 资助项 目 + 通讯联系人 T e l ： 0 1 0 6 2 7 3 1 1 4 6 ，0 1 0 6 2 7 3 3 3 2 3 E ma i l ： n i n g l b a up u b l i c 3 b t a n e t c n 收稿 日期：2 0 0 6 0 4 2 2 ，接受 日期 ：2 0 0 6 0 6 0 2 维普资讯 曹更生等：牛不同供体核克隆囊胚X i s t 基因D NA甲基化程度的比较研究 9 9 5 究中发现 ，死亡克隆牛 1 0个基因中有 9个异常表 达 ，而且 Xi s t 基 因也处于低 甲基化状态 ，因此 ， 他们认为不完全 的重编程使 x染色体产生 了异常 的表观遗传修饰 ，进而影响了 x染色体基 因的表 达 这个课题组还利用芯片技术对发育 7天 的克隆 囊胚进行研究，结果发现，克隆和正常囊胚在基因 表达方面差异很小，基于此，他们认为克隆胚胎可 能能够进行 比较完全 的重编程 ，但随着个体发育 的 进行，表观修饰错误积累越来越多，最终导致克隆 动物发育的异常 9 1 但是，关于体外受精胚胎 ( I VF ) 和克隆牛胚胎 Xi s t 基 因甲基化状况至今没有任何 报道 本文分析了不同供体核克隆牛囊胚 X i s t 基 因 DN A 甲基化状况 ，拟从 x染 色体 失活 的角 度 阐 述，不同供体核克隆牛胚胎 Xi s t 基因 DN A的重编 程对克隆囊胚的发育率造成的影响 1 材料与方法 1 1 实验药品及材料 亚硫酸氢钠和对苯二酚购 自S i g ma公司，T载 体试剂盒购 自T a Ka R a宝生物工程有限公 司，T a q DN A 聚合 酶 购 自北京 天 为 时代 科 技有 限公 司 ， d NT P购 自P r o ma g e公司，引物 由上海生工技术公 司合成 细胞和胚胎 的培养器皿购 自C o s t a r 或 Nu n e公 司 ；D ME M 1 2和胰 酶购 自 G i b c o公司 ；F B S购 自H y c l o n e公司；其他细胞及胚胎培养 的药 品除特 殊注 明外 ，均购 自S i gm a公司 H o l s t e i n 奶牛 的胎儿及成体牛来 自北京 市奶 牛 中心 黄牛卵巢来 自北京周边地区屠宰场 1 2 牛胎儿成纤维细胞系的建立及培养 将妊娠 5 0 6 0天 的 H o l s t e i n奶牛处死后 ，取 其输卵管和子宫，3 5 h内运 回实验室 在无菌条 件下，剖取胎儿 ，将其在 7 0 酒精 中浸泡 3 0 S 用 含有 5 双抗的 D P B S漂洗几遍后，无菌剪取其耳 部及 脊背部 的表 皮 组织数 块 ，置于含 5 X 双 抗和 1 0 F B S的 DME M 培养基中，在直径为 6 0 mm 的 平皿 中将表 皮组织 剪碎成 1 mms 大小 的小块 ，用 D ME M F 1 2清 洗 2次 后 ， 分 批 植 于 含 5 ml D ME M 1 2 + 1 0 F B S的 T 2 5培养瓶中，于 3 7 、 5 C O 培养箱培养 6 7天，每 2天换液 1次 待 细胞生长汇合后，以0 2 5 胰酶消化传代 2 3次， 分批 以 D ME M F 1 2 + 2 0 F B S + 1 0 DMS O冻存 1 3 牛克隆囊胚的获得 从屠宰场收集成年牛卵巢，在 3 8 5 、5 C O 培养箱中成熟培养 1 8 2 0 h 将成熟的卵母细胞放 入 0 1 的透 明质酸酶中，使卵丘与卵母细胞完全 脱离，挑选形态完整、胞质均匀并排出第一极体的 卵母细胞作为胞质 受体 培养传代 5 1 5次的胎儿 成纤维细胞 ，使 其生长 到 8 0 以上汇合时 ，作为 供体 核 将 卵母细胞 去核后 ，放 入融合液 中平衡 ( 现用现配) ，电融合后 ，将重构胚移入操作液中培 养 0 5 h ，挑选融合胚进行激活处理 将重构胚放入 A2 3 1 8 7 液中处理 5 mi n ，再放入 6 - D MA P液 中培养 5 h 然后将激活的重构胚放入 C R1 a a+BS A液中 处理 2天，将发育到 4 8细胞期的胚胎移入铺有 牛颗粒细胞 的四孔板中，用 C Rl a a + 5 F C S培养 液，在 3 8 5 ，5 C O ， 培养箱中培养 7 8 天 1 4 克隆囊胚的亚硫酸氢钠处理 取培养 7 8天 的囊胚 8 1 0枚 ，在体式镜下 机械 去除透 明带，用 P B S清洗 1遍，离心 除去多 余的 P B S溶液 亚硫酸氢钠处理依据文献并稍加修 改 “ 1 ，具体步骤如下 ：加入 1 7 L L l l mmo l L S D S 和 2 8 0 mg L的蛋 白酶 K，在 3 7 处理 1 1 5 h ， 加入 1 0 l 矿物油，9 8 处理 1 5 mi n ，再加入 3 l 2 mo l L的 Na O H ( Na O H 的终浓 度 为 0 3 mo F L ) ， 在 5 0 水浴放置 1 5 mi n ，加入 2倍体积的 2 低熔 点琼脂糖，充分混匀 配制 5 mo l L的 亚硫 酸钠 溶 液 ( p H 5 0 ) ：将 1 9 g亚硫 酸氢钠 溶于 2 5 ml 重蒸 水 中 ，然 后与 7 5 0 l 2 mo l L的 Na O H混合 ，再将 5 5 mg对苯二 酚溶于 5 0 0 l 的水中，混合 以上 2种溶液 吸取 2 0 l 琼脂糖 D NA混合液，打入预冷的 矿物油中形成小球 ，在一 2 0 。 C放 置 3 0 mi n ；移走矿 物油，加入 5 0 0 l 5 mo l L的亚硫酸钠溶液 ，5 0 处 理 8 h ，然 后 移 去 亚 硫 酸 钠 溶 液 ，用 1 x T E ( p H 8 0 ) 洗涤 4 x 1 5 mi n ，加 入 5 0 0 l 0 2 mo l L的 Na O H洗涤 2 x 1 5 mi n ，移走 N a O H 溶液 ，用 1 ml 1 x T E( p H 8 0 ) 洗涤 3 x l 0 mi n ，移去溶液 ，琼脂糖 小球可在一 2 0 中保存 P C R扩增前，琼脂糖小球 用灭菌水洗涤 2 x 1 5 mi n 使用上述方法 ，没有发现 亚硫酸盐处理不完全的现象 1 5 P C R扩增 、克隆及测序 将上述亚硫酸氢钠处理过的琼脂糖小球加热， 使其融化，取 2 5 L L l 作为模板，采用半巢式 P C R 进 行 扩 增 第 一 轮 引 物 序 列 如 下 ： Pr i me r F L1 2 61 1 28 6： 5 TTTGTTGTAGGGATAAT ATGGTTGAT 3 Pr i me r R1 4 56 1 481 ： 5 CCACC C T T T C T A AT T AA A T A AA A C AC 3 反 应 条 件 ： 维普资讯 9 9 6 生物化学与生物物理进 展P r o g B i o c h e m B i o p h y s 2 0 0 6 ； 3 3( 1 o ) 9 4 5 mi n； 9 4 1 mi n， 5 2 1 mi n， 7 2。 C 3 0 S ， 3 O个循环；7 2 1 0mi n 将第一轮扩增产物稀释 1 O倍作为模板 ，进行 第二轮 P C R反应 ，第二轮扩增引物序列为： P r i me r F S1 2 8 0 1 3 0 6 ： 5 GGTT GAT TT TGTT A TGTGGAT ATT AT G 3 ，P r i me r R1 4 5 6 1 4 8 1 ： 5 C C AC C C T T T C T A AT T A A A T A A A A C AC 3 反应条 件 ： 9 4 5 mi n ；9 4 3 0 s ， 5 4 3 0 s ， 7 2 3 0 S ， 3 O个 循 环 ；7 2 1 0 mi n 扩 增 目的 片 段 大 小 为 2 0 2 b p 用 1 5 琼 脂糖胶 回收第二 轮 P C R扩 增产 物 ，与 T a K a R a公司生产的 p MD1 8 一 T载体进 行连 接，转化涂板后 ，挑选阳性克隆，使用商品化通用 引物在 AB I 3 7 7测序仪上测序 2 结 果 2 1 X i s t 基因 C p G 岛的分析及靶序列的选择 在 NC B I网 站 上 查 得 牛 的 Xi s t基 因 序 列 f Ge n Ba n k a c c e s s i o n No NR 0 0 1 4 6 4 ) ， 通 过 Me t h P r i me r网站 ( 、 V 、 v ， u r o g e n e o r g me t h p r i me ) 对 该 基 因 5 端 5 k b的序列进行 C p G 岛预测分析 结果 显示，在 1 2 9 6 1 5 0 2 b p处存在一 C p G岛，序列 见图 1 将 该序 列与牛的基 因组序列进行 比对，找 到 Xi s t 基 因 5 调控区上游约 1 O k b的序列 ，以同样 的方 法进 行 C p G 岛预测 ，再没有 预测 到其 他 的 C p G岛 将预测到的C p G岛序列作为靶序列，设计 半巢式引物进行 P C R扩增 ，来检测 Xi s t 基因调控 区 D N A 甲基化状况 T T T G C T G C A G G GA C AA T AT G GC T GA C C T T G T C A T G T G G A T A TC A TG G CA GT T T G T C A C G T 6 0 T T T G T T G T A G G GA T AA T AT G GT T G A T T T T G T T A T G T G G A T A TT AT G G T A G TT T G TT AC G T Cp G 1 G G A T A T C G T G G CA G GG G TG T TT G A C C G T T A C A T T C T T G G C G G G C TT T G C A T C A GG A GG G C G G A T A T C G T G G T A G G G G T G T T T G A T C G T T A T A T T T TT G G C G G G T T T T GT A TT A G G A G G G T C p G 2 C p G 3 C p G4 C T G C C G C A T T G T T A A A G AT G GC G TG C T T T G C C G C G GA C AA AG T G A 从 GG A GG G AT T G G C A T T G T C G T A T T G T T A A A G AT G G C G TG T T T T G T C G C G G A T A A A GT G A 从 GG A GG G AT T G G T A C p G 5 C p G 6 C p G 7 C p G 8 A T G T T A G A T T G C C G C G T G T C C C A C C C A A T CA G AA A G G G T G G A T G T T A G A T T G T C G C G T G T T T T A T T T A A T TA G AA A G G G T G G C p G 9 C p G I O F i g 1 D NA s e q u e n c e o f 5 r e g u l a t o r y r e g i o n o f X i s t g e n e( u p p e r s t a n d s 1 a n d t h e s e q u e n c e o f Bi s u l fi t e - PCR ( 1 o we r s tan d s ) P r i m e r s e q u e nc e s a r e u n d e r l i n e d CpG s i t e s a r e s h o wn i n b o l d 2 2 体 外 受 精 囊 胚 X i s t 基 因调 控 区 C p G 位 点 DN A甲基化检测 8 枚 H o ls t e i n奶牛体外受精囊胚 X is t 基 因的 D NA 甲基化结果见图 2 ，在 X i s t 基因调控 区被 检 测 的 C p G位点 中，约有 4 9 的位点 是 甲基化 的 ， 如图中箭头所示 ，甲基化与非 甲基化仅有一个位点 差异 ，甲基化与非甲基化的整齐度较为一致 2 3 F F B及 其克隆囊胚 X i s t 基因调控 区 D N A 甲 基化检测 培养 3代 的牛胎儿成纤维细胞 ( F F B ) X i s t 基 因 调控区 D N A 甲基化的结果见 图 3 a ，在所有被检测 的 C p G位 点 中， 甲基化 的 C p G位 点 占 6 6 ，而 1 O枚 F F B来源 的克隆囊胚 甲基化位点 占 4 3 ，与 其供体细胞相 比，甲基化程度有所减少 ，但 甲基化 水平与体外受精囊胚接近，只是相 比之下，其 甲基 化 的 C p G位点分布不够均匀 ，整齐度不好 ( 图 3 b ) Cp G 1 2 3 4 5 6 7 8 91 0 F i g 2 M e t h y l a t i o n p a t t e r n s o f 1 0 c o ns e r v e d Cp G s i t e s wi t h i n t h e 5 r e g u l a t o r y r e g i o n o f Xi s t g e n e i n n v i t r o f e r t i l i z e d b l a s t o c y s t s Op e n a n d c l o s e d c ir c l e s i n d i c a t e u nme t h y l a t e d a n d me t h y l a t e d cr ， G s i t e s ， r e s p e c t i v e l y 维普资讯 曹更生等：牛不同供体核克隆囊胚X i s t 基因D NA甲基化程度的比较研究 9 9 7 F i g 3 Me t h y l a t i o n p a t t e r n s o f 1 0 c o nse r v e d C p G s i t e s o f 5 r e g u l a t o r y r e g i o n o f X i s t g e n e i n F F B( a )a n d i t s c l o n e d b l a s t o c y s ts( b ) Ope n a n d c l o s e d c i r c l e s i n d i c a t e u nme t h y l a t e d an d me t h y l a t e d Cp G s i t e s ， r e s p e c t i v e l y 2 4 F OV及其克隆囊胚 X i s t 基 因调控 区 D N A 甲 基化检测 培养 3代 的输卵 管上 皮细胞 ( F O V) Xi s t 基 因 D NA甲基化检测结果见图 4 a ，在被检测 的 C p G位 点中有 6 3 的位 点是甲基化 的 F F B的检测结果与 F OV相似 ，说 明体细胞的 甲基化程度 比较高 ，但 是甲基化位点的分布并不均匀 ，整齐度稍差 ，而 8 枚 F O V来源的克隆囊胚的检测结果见图 4 b ，仅有 约 1 7 的位点是甲基化 因此，与 F F B来源 的克隆 囊胚及体外受精囊胚相比，F O V来源的克隆囊胚 Xi s t 基 因D NA 甲基化水平处于相对较低的状态 F i g 4 Me t h y l a t i o n p a t t e r ns o f 1 0 c o nse r v e d C p G s i t e s wi t h i n t h e 5 r e g ula t o r y r e g i o n o f X is t g e n e i n F OV ( a ) a n d c l o n e d b l a s t o c y s ts ( b ) Op e n an d c l o s e d c i r c l e s i n d i c a t e u n me t h y l a t e d an d me t h y l a t e d Cp G s i t e s ， r e s p e c t i v e l y 3 讨 论 雌性哺乳动物早期胚胎发育时，x染色体发生 失活，这是哺乳动物个体发育 的重要事件，因此 ， x染色体失活是否正常进行 ，将对动物胚胎 发育 、 妊娠及 出生都具有重要影响 X i s t 基 因是调 节 X 染色 体失活 的重要 基 因 ， 它是单等位基因表达的( mo n o a l l e l i c e x p r e s s i o n 1 ，其 表达受 5 调控 区 C p G 岛 D NA 甲基化的调节 在小 鼠的研 究中发现 ，Xi s t 基 因的低 甲基化 ，可 导致 Xi s t 基 因的异常表达 ，使位于 X染色 体上的基因 沉默 2 1 ；另外 ，Xi s t 基 因 D N A 甲基化状态对 X i s t 表 达 的影 响可 能与 个 体发 育 的某 些 时期 相关 ， B e a r d等 3 认 为胚 胎期 X i s t 基 因的表达 与其 D N A 甲基化可能没有 明显的相关性 ，但 是，体细胞 X i s t 基 因 D N A低甲基化可能会导致 Xi s t 基 因的异常表 达 关于牛 X i s t 基 因的研究报道较少，X u e等 在 2 0 0 2年用甲基化敏感的限制性 内切酶对 Xi s t 基 因 甲基化程度进行研 究，发现死亡克 隆牛 X i s t 基 因 均处于低 甲基化状态 ，但 在 D i n d o t 等 4 的研 究中 却未能发现 X i s t 基 因 D NA 甲基化的变化 在本实 验中，对体外受精囊胚和不同供体核克隆囊胚的研 究 发现( 图 5 ) ，体细胞 X i s t 基 因 D NA 甲基化程度 较高 ，F F B Xi s t 基 因甲基化 的 C p G位点 占所检测 C p G总位点的 6 6 ，与 F O V 的 6 3 接近 ，而体外 受精囊胚中该基因处于中等 D NA 甲基化水平 ，所 占比例为 4 9 ，但是克隆囊胚处于较低 的甲基化 状态 ，特别是 F O V来源 的克隆胚胎仅有 1 7 的位 点是 甲基化的 从实验结果看 ，在体外受精囊胚和 维普资讯 9 9 8 生物化学与生物物理进展P r o g B i o c h e m B i o p h y s 2 0 0 6 ； 3 3( 1 0 ) F F B中，2条 X染色体上 X i s t 基 因的 D NA 甲基化 程 度 是 完 全 不 同 的 ， 符 合 单 等 位 基 大J表 达 ( mo n o a l l e l i c e x p r e s s i o n ) 的特征 ，X a上的 X i s t 基因 5 调控区，各 C p G位点可能是完全 甲基化的，而 xi 上的可能是完全未被 甲基化的 在克 隆囊胚中， X i s t 基因的 D NA 甲基化程度相对其供体核都有所 降低 ，这说明 Xi s t 基 因是可 以被重编程 的，并且 重编程 在不 同供体核 之 间也有 一定差 异 由于该 C p G岛能够被重编程，因此 ，所检测 的 C p G 岛可 能在调节 X is t 基因的表达中起作用 结合本实验室 n ， F bl a s t o c y s t s F i g 5 DNA 参 考 文 献 F F B 已发表 的实 验数 据B s ， H o l s t e i n奶 牛同一个 体 的 F F B和F O V来源的重构胚， F F B来源的克隆囊胚发 育率 比 F O V 的低 ，但其克隆牛胎儿的妊娠率和产 犊率都比 F O V来源 的高 由此得出，不同供体核克 隆囊胚 X i s t 基因 DNA甲基化是不 同的，F O V来源 的克隆胚胎 Xi s t 基 因低 甲基化可能有利 于囊胚 的 发育，这也从侧面说明不同供体核克隆囊胚的重编 程是有差异 的，这种 差异影 响到胚胎及其个 体的 发育 F 0V me t hyl a t i o n l e ve l s o f t he Xi s t ge ne i n cl o ne d bl a s t oc y s t s d e r i v e d f r o m F FB a n d F OV l l ： Me t h y l a t e d ； 口： Un me t h y l a t e d 1 Ri d e o u t W M ， Eg g a n K，J a e n i s c h R Nuc l e a r c l o n i n g a n d e p i g e ne t i c r e p r o g r a mmi n g o f t h e g e n o me S c i e n c e ， 2 0 0 1 ， 2 9 3 ( 5 5 3 2 ) ：1 0 9 3 l 0 9 8 2 Eg g a n K， Ak u t s u H， Ho c he d l i n g e r K， e t O1 X c h r o mos o m e i n a c t i v a t i o n i n c l o n e d mo u s e e mb r y o s S c i e n c e ， 2 0 0 0 ， 2 9 0( 5 4 9 6 ) ： l 5 7 8 l 5 8l 3 No l e n L D， Ga o S ， Ha n Z ，e t a l1 X c h r o mo s o me r e a c t i v a t i o n a n d r e g u l a t i o n i n c l o n e d e mb ryo s D e v B i o l ， 2 0 0 5 ， 2 7 9( 2 ) ： 5 2 5 5 4 0 4 M a n nM R， Ch u n gY G，No l e n LD，e t O1 Di s r u p t i o n o fi mp rin t e d g e n e me t h y l a t i o n a n d e x p r e s s io n i n c l o n e d p r e i mpl a n t a t i o n s t a g e mo u s e e mb ryo s B i o l R e p r o d ， 2 0 0 3 ， 6 9( 3 ) ： 9 0 2 91 4 5 Bo u r c h i s D，Le Bo u r h i s D， P a t in D， e t o 1 De l a y e d a nd i n c ompl e t e r e p r o g r a mmi n g o f c h r o mo s o me me t h y l a t i o n p a t t e r ns i n bo vi n e c l o n e d e mb ryo s C u r r Bi o l ， 2 0 0 1 ， 1 1( 1 9 ) ： 1 5 4 2 1 5 4 6 6 Kr e me n s k o y M ， Kr e me n s k a Y，S u z u k i M ， e t o l Ep i g e n e t i c c h a r a c t e riz a t i o n o ft h e c p g i s l a n d s o fb o v i n e l e p t i n a n d p o u 5 f l g e n e s i n c l o n e d b o v in e f e t u s e s J R e p r o d De v ， 2 0 0 6 ， 5 2( 2 ) ： 2 7 7 2 8 5 7 Kr e m e n s k o y M ，Kr e me n s k a Y， S u z uk i M ， e t o 1 DNA me t h yl a t i o n p r o fi l e s o f d o n o r n u c l e i c e l l s an d t i s s u e s o f c l o n e d b o v i n e f e t u s e s J R e p r o d De v ， 2 0 0 6 ， 5 2( 2 ) ： 2 5 9 2 6 6 8 Xu e F，Ti a n XC， Du F， e t Ab e r r an t p a tt e rn s o fX c h r o mo s o me i n a c t i v a t i o n in b o v i n e c l o n e s N a t Ge n e t ， 2 0 0 2 ， 3 1( 2 ) ： 2 1 6 2 2 0 9 S m i t h S L， Ev e r t s R E， Ti a n X C， e t Gl o b a l g e n e e x p r e s s i o n p r o fi l e s r e v e a l s i g ni fi c an t n u c l e ar r e p r og r a m mi n g b y t h e b l a s t o c y s t s t a g e a f t e r c l o n i n g P r o c Na t l A c a d S c i US A，2 0 0 5 ，1 0 2( 4 9 ) ： l 7 5 8 2 l 7 5 8 7 1 0 Che nT，Zh an gY L，J i an gY， e t o1T h eDNA m e t h y l a t i o n e v e n t si n n o r ma l and c l o n e d r a b b i t e mb ryo s F E BS L e t t ， 2 0 0 4 ， 5 7 8( 1 2 ) ： 6 9 7 2 1 1 Ol e k A， Os wa l d J ，W a l t e r J A mod i fie d a n d i mp r o v e d me t h o d f o r b i s u l ph i t e ba s e d c y t o s i n e me t h y l a t i o n a n a l y s i s Nu c l e i c Ac i d s Re s ， 1 9 9 6 ， 2 4( 2 4 ) ： 5 0 6 4 5 0 6 6 1 2 Pa n n i n g B， J a e n i s c h R DNA hy p ome t h y l a t i o n C an a c t i va t e xi s t e x p r e s s i o n a n d s i l e n c e X l i n k e d g e n e s G e n e s De v ，1 9 9 6 ，1 0 ( 1 6 ) ： u_1 0 I 1 0 口u 基 0 力 u 0 量 维普资讯 2 0 0 6 ； 3 3( 1 0 ) 曹更生等：牛不同供体核克隆囊胚 X i s t 基因 D N A甲基化程度的比较研究 9 9 9 1 9 91 2 0 0 2 1 3 Be a r d C， Li E， J a e ni s c h RL o s s o f me t h y l a t i o n a c t i v a t e s x i s t i n s o ma t i c b u t n o t i n e mb r y o n i c c e l l s G e n e s D e v ，1 9 9 5 ，9( 1 9 ) ： 23 25 2 3 3 4 1 4 Dind o t S V， Ke n t K C， Ev e r s B， e t o 1 Co n s e r v a t i o n o f g e n o m i c i mp r i n t ing a t t h e x i s t ，i g f 2 ，a n d g t l 2 l o c i i n t h e b o v i ne Ma mm Ge n o me ， 2 0 0 4 ， 1 5( 1 2 ) ： 9 6 6 9 7 4 1 5 Go n g G， Da i Y， Zh u H， e t 01Ge ne r a t i o n o f c l o n e d c a l v e s fro m d i ff e r e n t t y p e s o f s o ma t i c c e l l s S c i C h i n a C L i f e S c i ， 2 0 0 4 ， 4 7( 5 ) ： 47 0 4 7 6 M e t h y l a t i o n P a t t e r n s o f Th e Xi s t Ge n e i n Cl o n e d Bo v i n e Bl a s t o c y s t s De r i v e d F r o m Di f f e r e n t S o ma t i c Do n o r Ce l l s CAO Ge n g S h e n g 1 ,2 ) ，GAO Yu ，DAI Yu n P i n g ，L I Ro n g 3 ) ，Z HAO Ya o F e n g ” ，LI Ni n g ) ( 。 ) T h e S t a t e K e y L a b o r ato r i e s f o r A g r abi o t e c h n o l o g y , C h i n a A g r i c u h u r 01 U n i v e r s i t y , B e ij i n g 1 0 0 0 9 4 ， Ch i n a ； C o l l e g e o fL if e S c i e n c e， H e n a n U n i v e r s i t y , K if e n g 4 7 5 0 0 1 ， C h i n a ； ) C o l l e g e ofA n i m a l S c ien c e a n d T e c h n o l o g y , C h i n a Ag r i c u l t u r 01 U n iv e r s i t y , B e ij i n g 1 0 0 0 9 4 ， C h i n a ) Ab s t r a c t Us i n g b i s u l p h a t e s e q u e n c i n g ， me t h y l a t i o n p a t t e r n s o f t h e Xi s t g e n e i n c l o n e d b l a s t o c y s t s d e riv e d f r o m b o v i n e f e t a l fi b r o b l a s t s( F F B )o r o v i d u c t e p i t h e l i a l c e l l s( F O V)w e r e i n v e s t i g a t e d ， a s c o mp a r e d t o t h a t i n d o n o r c e l l s a n d i n v i t r o f e r t i l i z e d( F )b l a s t o c y s t s H y p o me t h y l a t i o n o f t h e Xi s t g e n e wa s o b s e r v e d i n t h e c l o n e d b l a s t o c y s t s f 4 3 a n d 1 7 i n F F B a n d F O V d e r i v e d b l a s t o c y s t s ， r