生物化学实验基本知识.doc

第六章 生物化学实验基本知识主编：齐锦生 编委：孔德娟 齐锦生 许丽辉 杨崇辉 周秀霞 罗湘衡 君智炜 张晓玲 王芳实验室要求一、 实验课的目的1、加深理解：加深对生物化学基本理论的理解。2、掌握技术：掌握生物化学的基本实验方法和实验技术（四大基本技术：离心、电泳、层析、比色）及分子生物学的一些基本技术和方法。3、培养能力：培养学生的思维能力、动手能力和表达能力。4、掌握精髓：科学的精髓是实事求是、敢于探索、善于创新的精神，要对实验中出现的一切反常现象进行讨论，并大胆提出自己的看法。二、 生化实验室规则和要求1、预习： 课前要预习实验教材，了解实验目的、原理，熟悉操作规程。2、秩序： 自觉遵守纪律，维护教学秩序，不准迟到、早退，保持安静，严禁谈笑打闹，听从教师指导，未经教师同意，不得随意离开实验室。3、整洁： 搞好实验环境和仪器的卫生整洁，实验台面必须保持整洁，仪器药品要井然有序，公用试剂用毕，应立即盖严放回原处，勿使药品试剂撒在实验台面和地面。实验完毕，需将药品试剂排列整齐，仪器要洗净倒置放好。固体废物，如滤纸、棉花、血块不得倒入水池中，以免堵塞下水道；一般性废液可倒入水池中冲走，但强酸强碱或有毒有害溶液必须用水高度稀释后，方可倒入水池中，同时放水冲走，以免腐蚀水管。全体同学由班长安排轮流值日，负责当天实验室卫生、安全和一些服务性工作，经教师验收合格后，方可离开实验室。4、节约： 使用仪器、药品、试剂及各种物品必须厉行节约，并节约水电。应特别注意保持药品和试剂的纯净，严防混杂、乱用和污染。使用和洗涤仪器应小心仔细，防止损坏，贵重仪器使用前应熟悉使用方法，严格遵守操作规程，严禁随意开动，发现故障后应立即报告指导教师，不要自己动手检修，如有损坏按学校规定赔偿。5、安全： 注意人身和国家财产安全是至关重要的，要时刻注意防火、防水、防电、防危险品、防事故，以免发生意外。实验室内严禁吸烟。使用乙醚、苯、乙醇、丙酮等易燃品时，不允许在电炉、酒精灯上直接加热。实验中须远离火源，如有危险发生，应首先关掉电源；有机溶剂着火时，勿用水泼，以免扩大燃烧面积，可用沙土、灭火器具灭之。用火时必须严格做到：火着人在，人走火灭。用毕电器后及时切断电源。加热试剂、液体时，管口不要对人，要十分小心操作，避免灼伤人。实验室内一切物品未经本室负责教师批准，严禁携带出室外，有毒物品尤其如此。借物必须办理登记手续。生物化学实验技术概述一、 层析法层析是利用混合物各组分物理化学性质（如：溶解度、吸附能力、电荷和分子量等）的差别，使各组分在支持物上集中分布在不同区域，借此将各组分分离。层析系统分为两个相：固定相和流动相。由于各组分受固定相的阻力和受流动相的推力影响不同，各组分移动速度也各异，从而使各组分得以分离。此法首先用于有色物质的分离，故又称色层析法。层析法是近代生物化学最常用的分析法之一，此法可以分离性质极为相似、而用一般化学方法难以分离的各种化合物，如各种氨基酸、核苷酸、糖、蛋白质等。层析法有多种类型，根据所用两组分不同分为以下几类：吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等；根据操作方式不同分为：柱层析、薄层层析和纸层析等。（一） 吸附层析法：吸附层析法（absorption chromatography）是混合物随流动相通过吸附剂时，由于吸附剂对不同物质有不同的吸附力而使混合物分离的方法。吸附层析根据操作方式的不同，分为柱层析与薄层层析两种。1、柱层析法：柱层析法是用一根玻璃管柱，下端铺垫棉花或玻璃棉，管内加吸附剂粉末，用一种溶剂润湿后，即成为吸附柱，如图1中的（1）。然后在柱顶部加入要分离的样品溶液，如图1中的（2）。假如样品内含两种成分A和B，则二者被吸附在柱上端，形成色圈，如图1中的（3）。样品溶液全部溶入吸附柱中之后，接着就加入合适的溶剂洗脱，如图6-0-1中的（4）。A与B就随着溶剂的向下流动而移动。最后分离情况如图1中的（5）所示。图 6-0-1 二元混合物的柱层析示意图在洗脱过程中，管内连续发生溶解、吸附、再溶解、再吸附的现象。例如，被吸附后的A粒子被溶解（解吸作用）随溶剂下移，但遇到新的吸附剂，又将A粒子吸附，随后，新溶剂又使A粒子溶解下移。由于溶剂与吸附剂对A与B的溶解力与吸附力不完全相同，A与B移动的速率也不同，经一定时间，如此反复地溶解与吸附，而形成两个环带，每一环带是一种纯物质。如A与B有颜色可看到色层；如样品无色，可用其它方法使之显色，为进一步鉴定，可将吸附柱从管中顶出来，用刀将各色层切开，然后分别洗脱，现在多采用溶剂洗脱法，即连续加入溶剂，连续分段收集洗脱剂，直到各成分顺序全部从柱中洗出为止。最常用的吸附剂是硅胶和氧化铝。硅胶的吸附能力和含水量关系极大，硅胶吸水后，吸附能力下降，常用于分离非极性的和极性不强的有机物，如甘油脂、磷脂、胆固醇等。2、薄层层析法：薄层层析法是吸附剂在玻璃板上均匀地铺成薄层，把要分析的样品点加到薄层上，然后用适当的溶剂展开，而达到分离、鉴定的目的。其优点是：设备简单，操作容易；层析展开时间短，分离时几乎不受温度的影响；可采用腐蚀性的显色剂，且可以在高温下显色；分离效率高。薄板的制备：所用玻璃板表面必须光滑、清洁。根据制薄板的方法不同薄板可以分为软板和硬板两种。软板即不加粘合剂，将吸附剂干粉直接均匀铺在玻板上；制作简单方便，但是易被吹散。硬板即用粘合剂如水或其他液体，将吸附剂调成糊状再铺板，经干燥后才能使用；制备虽然较繁琐，但易于保存。具体制备方法如下：（1）软板：选用一根直径约为11.2cm的玻璃管，根据薄层的厚度在玻璃管两端缠几圈胶布，胶布的厚度按需要的薄层厚度而定。常用的厚度约为0.41mm左右。把干的吸附剂倒到玻璃板上，玻板的一端固定，防止推玻璃管时玻板移动，然后将玻璃管压在玻板上，把吸附剂由一端推向另一端，即成薄板。要求：光滑、平整、厚度均匀。（2）硬板：将适当调好的吸附剂倒在两块3mm玻板中间所夹的一块2mm厚度的玻板上，然后用一块边缘光滑的玻片把吸附剂刮向一边，即成厚度一定的薄板。下面介绍氧化铝和硅胶硬板的制备方法。氧化铝硬板：称取氧化铝G25g（G表示石膏，这种氧化铝中含5%锻石膏），加水25ml，在烧杯中调成糊状，铺层，先在空气中干燥，后置于200220烘箱中烤4小时即可使用。硅胶硬板：称取硅胶G30g，加水6090ml，在烧杯中调成均匀糊状，立即铺层，室温内干燥后置烘箱中烘干。此外，也可用淀粉或羧甲基纤维素钠（CMC）作粘合剂制板。薄层层析的操作步骤是：点样、展开、显色。（二）分配层析：分配层析是利用混合物在二种或二种以上的不同溶剂中的分配系数不同而使物质分离的方法。如用带水的材料（载体）作为液相（固定相），加入与水不相混合或仅部分混合的溶剂（流动相），则混合物各组分在两相间发生不同的分配现象而逐渐分开，形成色层。载体在分配层析中只起负担固定相的作用，它们是一些吸附力小、反应性弱的惰性物质，如淀粉、纤维素粉、滤纸等。固定相除水外，还有稀硫酸、甲醇、仲酰胺等强极性溶液。流动相则采用比固定相极性小或非极性的有机溶剂。纸层析是最广泛应用的一种分配层析。纸层析法以滤纸为载体，滤纸上吸附着水（约含20%22%）是经常用的固定相，此类有机溶剂如醇、酚等为常用的流动相。把欲分离的物质加在纸的一端，使流动溶剂经此移动，这样就在两相间发生分配现象。由于物质分配系数的不同，就逐渐在纸上集中于不同的部位。在固定相中分配趋势较大的成份，随流动相移动的速度就慢；反之，在流动相分配趋势较小的成分，移动速度就快。物质在纸上移动的速度可以用Rf表示： 色斑中心至原点中心的距离Rf = 溶剂前缘至原点中心的距离物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也恒定，因此，可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。纸层析法按操作方法分成两类，即：垂直型和水平型。垂直型是将滤纸条悬起，使流动相向上或向下扩散；水平型是将圆形滤纸置于水平位，溶剂由中心向四周扩散。垂直型使用较广，按分配物质的多寡，将滤纸截成长条，在某一端距边缘24cm处点样，待干后，将点样端边缘与溶液接触，在密盖的玻璃缸内进行展开 见图6-0-1 图6-0-2垂直纸层析上述方法只用一种溶剂系统进行一次展开，称为单向层析。如果样品成分较多，而且彼此的Rf 值相近，单向层析分离效果不佳，可用双向层析法，即在长方形或方形滤纸的一角点样，卷成圆筒形，先用第一种溶剂系统展开，展开完毕吹干后转90，再放于另一种溶剂系统中，向另一方向进行第二次展开，如此各成分分离较为清晰。见图6-0-3 图6-0-3（三）离子交换层析：离子交换层析法（ion exchange chromatography IEC）是利用离子交换剂对需要分离的各种离子有不同的亲和力而达到分离的目的，这种柱层析称为离子交换层析。离子交换剂是通过化学反应将带电荷基团引入惰性支持物上而形成。离子交换作用是指一溶剂中某一种离子与一固体中的另一种具有相同电荷的离子进行相互位置的调换。由于各种离子所带电荷的多少不同，它们对交换剂的亲和力就有所差别。因此，在洗脱过程中，各种离子由固体柱上先、后下来的顺序不同，从而可达到分离的目的。这种离子交换是定量完成的，因此测定溶液中由固体上交换下来的离子量，可知样品中原有离子的含量，也可将吸附在交换剂上的样品的成分用另一洗脱液洗脱下来，进行定量测定。离子交换层析主要用于蛋白质、多肽的分离。核酸也是强极性分子，用离子交换层析也能得到很好的分离效果。离子交换剂种类很多，根据交换剂上吸附的离子交换基团不同，可分为阳离子交换剂和阴离子交换剂；根据惰性支持物不同，又有树脂、纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶及琼脂糖凝胶等种类。目前大多采用的离子交换剂是合成离子交换剂，即离子交换树脂，其分为两大类：分子中具有酸性基团，能交换阳离子的称为阳离子交换树脂；分子中具有碱性基团，能交换阴离子的称为阴离子交换树脂。按其解离性的大小，又可分为强弱两种：磺酸基 （SO3H）强酸性 阳离子交换树脂 酚羟基（OH） 弱酸性 羧基 （COOH）强碱性 季胺基 （NR4）阴离子交换树脂 伯胺基 （NH2）弱碱性 仲胺基 （NHR） 叔胺基 （NR2）交换反应举例如下：R-SO3H+ + M+X R-SO3M + XH+R4NOH + HX R4NX- + HOH-离子交换树脂的交换容量与其结构有关，这直接关系到合成过程。离子交换树脂主要是根据有机化学反应（如硝化、磺化、氯甲基化和胺化等）及高分子合成反应（如聚合及缩合）的基本原理进行合成的。离子交换剂的母体聚合物有苯乙烯、酚醛及丙烯酸等。常见的聚苯乙烯树脂由苯乙烯聚合，再加入二乙稀交联：（方程式1）插入附件1在这个母体上引进功能基就得到各种离子交换树脂，如制备强酸性阳离子树脂时，即将母体加以磺化：（方程式2）插入附件2制备强碱性阴离子交换树脂时，先将母体甲基化后，再加以胺化，即得：（方程式3）插入附件3这里，树脂中二乙烯苯的含量决定了树脂的交联度大小，应尽量选用交联度高些，而且有较高的交换容量的树脂。树脂交换容量的单位为毫克当量/克（干树脂）或者毫克当量/毫升（湿树脂）。测定树脂的交换容量方法：阳离子交换树脂：首先，用氢氧化钠溶液通过已转型为氢型的树脂，将H+替换出来，其反应式： RSO3H+NaCl RSO3Na+HCl再用酸碱滴定法测定流出液中盐酸的当量数，即可计算交换容量，即：HCl+NaOHNaCl+H2O而测定阴离子交换树脂交换容量的反应则为：R4NOH+NaClR4NCl+NaOHNaOH+HClNaCl+H2O离子交换纤维素是30年来广泛用于分离纯化蛋白质的离子交换剂。目前常用的离子交换纤维素列于下表：（表1）目前常用的离子交换纤维素离子交换剂游离基团结构阴离子交换剂强碱性TEAEGEQAE-Sephadex弱碱性DEAEPAB中等碱性AEECTEOLADBDBNDPEL三乙基氨基乙基胍基乙基二乙基（2-羟丙基）季胺二乙基氨基乙基对氨基苯甲基氨基乙基三乙醇胺经甘油和多聚甘油链偶联于纤维素的混合基团（混合胺类）苯甲基化的DEAE纤维素苯甲基化萘酰化的DEAE纤维素聚乙烯亚胺吸附于纤维素或较弱磷酰化的纤维素-OCH2CH2N（C2H5）3 NH-OCH2CH2NHC-NH2-C2H4N+ (C2H5) 2 CH2CHCH3 OH- OCH2CH2N（C2H5）2-OCH2CH2N H2阳离子交换剂弱碱性CM中等酸性P强酸性SESP- Sephadex羧甲基磷酸磺酸乙基磺酸丙基-OCH2C OOH O-O-POH OH O-OCH2CH2-SOH O O-OC3H6-SOH O常用离子交换树脂某些物理化学性质表（表2）插入附件4 -1、2、3各类常用离子交换树脂型号对照表（表3）插入附件5离子交换介质在纯化步骤中的选择（表4）插入附件6离子交换层析介质的技术数据 (表5) 插入附件71、2（四）凝胶层析（分子筛层析）凝胶层析（gel filtration）又称分子筛层析、排阻层析或凝胶渗透色谱，主要是根据混合物中各种分子的分子量不同，通过固定相凝胶时，分子的扩散速度各异，使大小不同的分子得到分离和纯化。它不仅用于大分子物质的分离，也可用于分子量测定以及蛋白质样品除盐等。所谓凝胶是一类具有三维空间多孔性的网状结构物质。在洗脱过程中，分子量最大的物质由于不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间的空隙而最先流出；分子量最小的物质因能钻入网孔而受阻滞，流速缓慢，而最后流出；分子量介于最大和最小之间的物质，流出的顺序在最大分子量物质之后，而在最小分子量物质之前。所以，各组分的洗脱顺序与其分子量成正比。（图6-0-4）插入附件8凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，是含有大量液体的柔软而富于弹性的物质。吸水量大于7.5g/g的凝胶称软胶，吸水量小于7.5g/g的凝胶称为硬胶。根据凝胶物质的来源可分为天然凝胶和人工合成凝胶两类。、天然凝胶：主要是一些糖类物质，如淀粉、琼脂及琼脂糖等。淀粉凝胶应用较早，但因其理化性质不够稳定，洗脱时的阻力较大，洗脱时间长等缺点影响了它的应用。琼脂来源于一种海藻，是由D-半乳糖和L-半乳糖所组成的多聚糖。它能分离分子量较高的物质。其缺点是带有大量的电荷（主要是磺酸基，其次为羧基），层析时常需用较高离子强度的洗脱液，使洗脱物含有一定量盐分，而影响产品的纯度。琼脂糖凝胶（sepharose）应用较多，它又称生物凝胶（biogelA），由琼脂糖溶液冷却后，通过分子间氢键，自发凝集成束，形成稳定的珠状凝胶。稳定性较差，工作pH值范围在49之间，40以上易老化，不能高压和冰冻，其机械强度取决于琼脂糖的含量。它有2B、4B、6B三个级别，含琼脂糖的浓度分别为2%、4%、6%。Sepharose结构开放，排阻极限比Sephadex大，分离范围广泛，适用于DNA大片段分离。各种型号琼脂糖凝胶的的性质及生产厂商见下表。（表6）琼脂糖凝胶的技术数据名称、型号凝胶内琼脂糖%含量（W/ W）排阻的下限(Mr)分级分离的范围（Mr）生产厂商Sagavac 10Sagavac 8Sagavac 6Sagavac 4Sagavac 21086422.510571052106151061501061104 2.51052.5104 71055104 21062105 151065105 15107Seravac Laboratories ,Maidenhead,EnglandBio-GelA-0.5MBio-GelA-1.5MBio-GelA-5MBio-GelA-15MBio-GelA-50MBio-GelA-150M10864210.51061.5106510615106501061501061104 2.51061104 71061104 21064104 151061105 15106 1106 15106Bio-Pad Laboratories,California,U.S.A2、人工合成的凝胶：常用的有葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两大类。葡聚糖凝胶又称交联葡聚糖凝胶，英文名称为Dextrak，商品名称为Sephadex，由许多右旋葡萄糖单位通过1,6-糖苷键联结成链状结构，再由交联剂1-氯-2,3-环氧丙烷（CH2-CH-CH2CL，又称氯醇）交联而形成多孔网状结构高分子化合物。其基本结构如图： （ 图5)插入附件9在合成凝胶时，调节葡聚糖和交联剂的配比，可以获得具有不同大小网眼的葡聚糖凝胶。G表示交联度，G越大，网孔结构越紧密，吸水性差，膨胀也小，适用于分离小分子物质；G越小，网孔结构疏松，吸水量大，适用分离大分子物质。商品凝胶的型号采用“吸水量”的10倍数字表示，例如，每g凝胶吸水量为2.5g即定为G25型。各种型号葡聚糖凝胶的性质见下表。（表7）各种型号葡聚糖凝胶的性质型号分离范围（分子量）吸水量g/g干凝胶膨胀体积ml/g干凝胶浸泡时间（小时）蛋白质多糖20-25090-1000G-10G15G25G50G75G100G150G2007001500100050001500300030007000040001500005000400000500080000070015001005000500100001000500001000100000100015000010002000001.0.011.50.22.50.25.00.37.50.5101.0151.5202.0232.53.546911121515202030304033332472727211113555 由上表可见，SephadexG值越大，吸水量越大，分离范围（分子量）越大聚丙烯酰胺凝胶其商品名为生物凝胶P（Bio-Gel P），是用丙稀酰胺（acrylamide，简称Acr）和交联剂亚甲基双丙烯酰胺（N，Nmethylene bisacrylamide，简称Bis）在催化剂的作用下聚合而成。其结构式如下：（方程式4）张龙翔 P90聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：（1）化学聚合：催化剂多采用过硫酸铵（ammonium persulfare，AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作为加速剂，最有效的加速剂为N，N，N，N四甲基乙二胺（N，N，N，Ntetramethyl ethylenediamine，TEMED），其次为三乙醇胺及二甲氨基丙腈（3-dimethylaminopropionitrile,DMPN）。在叔胺的催化下，由过硫酸胺形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合作用。因为叔胺要处于自由碱状态下才有效，所以在低pH时，常会延迟聚合作用。分子氧阻止链的延长，防碍聚合作用，一些金属也能抑制聚合。冷却可以使聚合速度变慢，通常控制这些因素使聚合在一小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。（2）光聚合：通常用核黄素作催化剂，不一定加TEMED即能聚合，但加入则可加速聚合。光聚合通常需要有痕量氧存在，核黄素经光解形成无色基，后者被氧再氧化形成自由基，从而引发聚合作用，但过量的氧会阻止链长的增加，应该避免过量的氧存在。光聚合通常用日光灯或普通钨丝灯泡作光源，直接日光或室内强散射光也可以。用核黄素进行光聚合的优点是：核黄素的用量很低（1mg/100ml）；通过光照可以预定聚合时间，但光聚合的凝胶孔较大，而且随时间延长而逐渐变小，不太稳定，所以用它制备大孔凝胶较适合。化学聚合的凝胶孔径较小，因而采用过硫酸胺TEMED催化系统制备小孔凝胶（分离胶），而且各次制备的重复性好。凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系：凝胶浓度与被分离物的分子量大小的关系，大至范围如表：(表8) Mr范围与凝胶浓度的关系Mr的范围适用的凝胶浓度% 蛋白质 510520301520101551025 核酸 104 104105 1052106152051022.6 聚丙烯酰胺凝胶的机械强度好，有弹性、透明、相对的化学稳定，对pH和温度变化较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。原料成分要采用高纯度制品，通过改变浓度和交联度，可以控制孔径变动在极广泛的范围，并且制备凝胶的重复性好，由于纯度高及不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。（表9）聚丙烯酰胺凝胶的技术数据型号排阻的下限（Mr）分级分离的范围（Mr）膨胀后的床体积ml/g干凝胶所需最少时间（室温，小时）Bio-gel-P-2Bio-gel-P-4Bio-gel-P-6Bio-gel-P-10Bio-gel-P-30Bio-gel-P-60Bio-gel-P-100Bio-gel-P-150Bio-gel-P-200Bio-gel-P-3001600360046001000030000600001000001500002000003000002002000500-40001000-50005000-1700020000-5000030000-7000040000-10000050000300000100000-4000003.85.88.812.414.919.019.0 24.034.040.02-42-42-42-410-1210-1224244848下面几张表列出凝胶层析介质的一些性能指标，供读者参考。表10 各种凝胶所允许的最大操作压凝胶建议的最大静水压（cmH2O）*SeohadexG-10G-15G-25G-50Seohadex G-75Seohadex G-100Seohadex G-150Seohadex G-200Bio-GelP-2P-4P-6P-10P-30P-60Bio-Gel-P-100Bio-Gel-P-150Bio-Gel-P-200Bio-Gel-P-300Sepharose2B4BBio-GelA-0.5MA-1.5MA-5MBio-Gel A-15MBio-Gel A-50MBio-Gel A-150M100(98.06Pa)100(98.06Pa)100(98.06Pa)100(98.06Pa)50(49.03 Pa)35(34.32 Pa)15(14.71 Pa)10(9.806 Pa)100(98.06Pa)100(98.06Pa)100(98.06Pa)100(98.06Pa)100(98.06Pa)100(98.06Pa)60(58.83Pa)30(29.42Pa)20(19.61Pa)15(14.71Pa)1*(0.9806Pa)1(0.9806Pa)100(98.06Pa)100(98.06Pa)100(98.06Pa)90(88.25Pa)50(49.03Pa)30(29.42Pa)* 每cm凝胶浓度 * 1 cmH2O=0.9806Pa（表11、）见附件10 （表12）见附件11-1、2下面介绍几种染料的性能及染色原理：1、氨基黑10B（amino black 10B）C22H13O12N6S3Na3, Mr=715, max=620630nm。氨基黑是酸性染料，其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐，是最常用的蛋白质染料。但用氨基黑染SDS-蛋白质时效果不好。另外，氨基黑染不同蛋白质时的着色度不等、色调不一（有蓝、黑、棕等），作同一凝胶柱的扫描时误差较大，需要对各种蛋白质作出本身的蛋白质染料量（吸收值）的标准曲线。（方程式5）插入分子式 张龙翔P912、考马斯亮蓝G250，又名Xylene brilliant cyanin G。比考马斯亮蓝R250多二个甲基。Mr=854, max=590610nm。染色灵敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。优点在于它在二氯乙酸中不溶而成胶体，能选择地染色蛋白而几乎无本底色。所以常用于需要重复性好和稳定的染色，适于作定量分析。3、考马斯亮蓝R250（Coomassive brilliant blue R250），C45H44O7N3S2Na, Mr=824, max=560590nm。染色灵敏度比氨基黑5倍，但蛋白质浓度超出一定范围时，对高浓度蛋白的染色不合乎Beer定律，用作定量分析时，要注意这点。（方程式6）插入分子式 张龙翔P924、1-苯胺基-8-萘磺酸（1-anilino-8-naphthalene sulfonic acid，ANS）本身无荧光，但与蛋白质结合后则产生荧光。将凝胶放在此染料溶液浸13分钟，用长波紫外灯照射时，产生黄色荧光，可显示蛋白质100g，如果不明显，可将凝胶取出暴露于空气或盐酸气中，或浸没在3mol/L盐酸中几秒至2分钟，使表面蛋白质稍变性，然后再用ANS染色，这样可显示蛋白质20g。这样的染色优点是可保留凝胶内部的酶和抗体的活性。可将该区带切下来进行酶活力测定；也可直接把凝胶捣碎研细，用作抗原来注射动物，聚丙稀酰胺不影响抗体的产生。（五）亲和层析法：生物体中许多高分子化合物具有与某些对应的专一分子可逆结合的特性，例如，酶、蛋白与辅酶，抗原与抗体、酶与酶抑制剂、激素与受体等体系，都具有这种特性。生物高分子与配体之间形成可解离的专一络合物的能力称为亲和力。根据这种具有亲和力的生物高分子与配基间可逆性结合和解离的原理而建立的层析技术称为亲和层析（affinity chromatography）。亲和层析的优点是：在温和条件下进行，操作简单，效率高。亲和层析在分离、纯化的效率上可以说是最佳的方法。亲和层析是由吸附层析发展起来的，它相对于建立在物理化学原理（如分子颗粒大小、分子带电荷状况等）的分离方法而言，可称为“生物专一吸附”的层析分离方法。在亲和层析过程中，被分离的生物分子在一定条件下，有选择性地即高度特异性地被结合到共价偶联的不溶性载体的配基亲和吸附剂上，然后改变原有条件，如选用竞争性抑制剂、底物、辅助因子，或采用不同pH的缓冲液、高浓度盐，变性剂等，又可有选择性地从亲和吸附配基上把要分离的物质洗脱下来。通过亲和层析，被分离物质的纯度有时一次即可提高几倍、十几倍甚至几百倍，活化回收率也是非常高的。亲和层析法的基本过程如下：1、偶联：将欲分离的高分子物质X（如抗原）的配基L（如抗体）在不影响其生物功能的情况下与水不溶性的载体相结合（称为固相化或固定化），制成亲和吸咐剂或免疫吸附剂。2、装柱：在层析柱内装入固相化的配基亲和吸附剂（称为亲和柱）。3、亲和吸附：含有高分子物质X的混合液（如粗匀浆提取液或血清等），在有利于配基和高分子之间形成复合物的条件下，进入亲和吸附剂的层析柱。混合液中只有能与配基形成复合物的高分子X被吸附，而所有不能形成复合物的杂质则直接流出。亲和柱进一步用缓冲液洗涤，以尽可能地除去非亲和吸附的物质。4、洗脱：改变洗脱条件，促使亲和吸附剂高分子复合物解离而释放出高分子的物质X，便得到欲纯化的活性物质。5、再生：将欲分离、纯化的生物大分子从亲和吸附剂中洗脱的过程，就是再生的过程。再生后的亲和吸附剂可直接用于又一周期的纯化工作。用亲和层析法分离大分子化合物可用下图表示：（图6、7）张龙翔P372从理论上说，亲和层析可以用来纯化各种酶、抗原、抗体、维生素结合蛋白、传递蛋白、激素和药物的受体、核酸、多酶系统以至完整的细胞。固定化的配基也可用来探讨生物体内大分子和配基间的作用方式。这种固相吸附剂还可作为生物大分子的结构与功能研究的工具。下面对亲和层析法中的几个需要注意的问题进行分析讨论：首先，载体的选择。使亲和物一方固相化的水不溶性化合物称为载体。其应具备下述特性：1、高度亲水。使固相吸附剂易与水溶液中的生物高分子接近。2、惰性载体。载体的非专一性吸附应尽可能小。3、具有相当量的化学基团可供活化或化学改变。4、有较好的物理和化学的稳定性，能经得起配基固定化和亲和柱层析时可能采用的各种条件（如pH、离子强度、温度、变性剂和去污剂）的影响。5、具有多孔的网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过，从而增加配基的有效浓度。6、有良好的机械性能，为使亲和柱有较好的流速，载体最好是均一的珠状颗粒。常用的载体有纤维素，聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶。（表13）珠状凝胶分离范围珠状凝胶分离范围（Mr）琼脂糖:Sephaarose 2BSephaarose 4BSephaarose 6B聚丙烯酰胺:Bio-gel-p-300Bio-gel-p-15041073107410651051.5105其次，配基的选择。作为理想的配基，它首先必须对欲纯化的大分子具有很高的亲和力。另外，小分子配基必须具备可修饰的功能基团，通过这些基团与载体形成共价键。这些共价键的形成应不致严重地损害配基与欲纯化蛋白质的亲合力，用于亲和层析的配基有酶的底物类似物、效应物、酶的辅助因子及抗体（或抗原）等。第三，几种类型的免疫吸附剂。把抗原或抗体用共价键或其它方式连接在固相载体上，用以分离和纯化相应的抗体或抗原的方法称为免疫吸附法，固相化的抗原或抗体称为免疫吸附剂，根据载体的性质不同，配基和载体的连接方式大体可分为三种类型。1、使配基吸附在某些载体的表面。常用的载体有皂土、玻璃粉（或微球）、石英粉、羟基磷灰石、氧化铝、硬脂酸钡等。其优点：操作简单，条件温和。其缺点：吸附不稳定而影响被分离物质的纯度。2、使配基网络在某些载体化合物的网状结构中。常用的载体有聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、交联葡聚糖凝胶等。此方法使用的条件也很温和；只要凝胶的交联度和配基分子大小选配合适，就可得到效果很好的免疫吸附剂。3、使配基通过共价键和载体结合。常用的载体有琼脂糖、纤维素交联葡聚糖、聚丙烯酰胺及多孔玻璃等，此种方法适用于大分子化合物及小分子化合物。由于与载体化学的结合，因此增强了配基对pH、离子强度及温度耐受力。它也是目前亲和层析方法中最广泛采用的一种类型。4、使用偶联剂直接把配基的许多分子彼此连接起来。这样的偶联剂有戊二醛、氯甲酸乙酯，乙基丁烯二酸酐，环已基碳二亚胺等。但如果条件掌握不好，很易引起生物大分子的失活。第四、亲和层析条件的选择1、吸附：生物大分子的亲和纯化最好采用柱层析法。亲和柱所用的平衡缓冲液其组成、pH和离子强度都应选择配基与生物大分子之间的作用最强、最有利于形成复合物的条件。上柱的样品应该溶于亲和柱的平衡缓冲液中，并在上柱前对缓冲液透析平衡。2、洗涤：样品通过亲和柱后，连续用大量缓冲液洗去无亲和力的生物大分子，且还常用不同的缓冲液洗涤，这样可进一步除去非专一吸附的物质，而在亲和柱上只留下有专一作用的亲和物。3、洗脱：洗脱正好与吸附相反，所选取的条件应该能减弱纯化对象与吸附柱之间的相互作用，使得复合物完全解离。通过改变缓冲液的条件，如改变pH、离子强度、有机溶剂的浓度等，有选择性地从载体上把被分离物洗脱下来。4、亲和柱的再生：当洗脱结束后，连续用大量洗脱剂彻底洗涤亲和柱，然后再用平衡缓冲液使亲和柱充分平衡，经过这样处理，亲和柱可反复使用。下面各表列出一些亲和层析介质的技术数据，供读者参阅。（表14）张龙翔P503507（十三）亲和层析介质的技术数据16。综上所述，五种层析技术在分离各种化合物时各有其优越之处，也有不足之处。因此，应根据具体分离化合物的种类及要求，选择不同的层析方法及层析介质，以达到迅速、准确地分离目的。现就如何选择层析介质，列表如下，供读者参阅。（表15）张龙翔P497（七）如何选择层析介质。 P498按纯化步骤选择层析介质。（表16）二、比色和分光分析法（孔德娟）（一）原理光线的本质是电磁波的一种，有与电磁波和X线类同的性质。光线有不同的波长，肉眼可见彩色光称为可见光，波长范围在400750nm，小于400nm的光线称为紫外线，大于750nm的光线称为红外线，如表所示。（表17）见书P19 当光线通过透明溶液介质时，其辐射能量一部分被吸收，一部分被透过，所以光线射出溶液介质之后，光能减少。例如，可见光通过有色溶液介质后，或红外线通过多种气体后均被吸收部分光能。这种光能的吸收和透过可用于某些物质的定量分析。 分光分析所依据的定律是Lambert 和Beer定律1. Lambert 式定律：一束单色光通过透明溶液介质时，光能被吸收一部分，被吸收光能的量与溶液介质厚度有一定比例关系。见图6-0-8 即： dI 1 dI 1 = - adl 将此式积分得： = - adl I 10 I 10I=I0eal(1)式式中I0 为入射光强度 I为通过溶液介质后的光强度 l 为溶液介质的厚度 为自然对数的底2.718 a 为溶液介质的吸收系数（1）式可改写为: I0Ln = al（2）式 I（2）式换算成常用对数式， 即： I0Ln 0.4343=0.4343al I I010g =0.4343al I I0 则 10g = kl（3）式 I式中K为吸光系数。2. Beer 定律： 以溶液中溶质浓度的变化代替溶液厚度的改变，光能的吸收与浓度改变有类同的关系。即一束单色光通过溶液介质时，光波被溶液介质吸收一部分，吸收多少与溶液中溶液介质浓度有一定比例关系。依据Lambert 氏定律中同样的推导，可得出下式： I0 10g kc(4)式 I式中c为溶液介质的浓度。Lambert 定律与Beer定律合并， 即(3) 和(4) 式合并为： I0 10g = kcl(5)式I I0 I0令A=10g T= I ， I 则 A=kcl （6）式 A=-10T式中A 为 光密度（又称吸光度）， T为透光度。（6）式为Lambert-Beer定律的物理表示式，其含义为：一束单色光通过溶液后，光能被吸收一部分，吸收多少与溶液的浓度和厚度成正比。 （二）光电比色法 利用溶液的颜色深浅来测定溶液中物质含量的方法，称为比色法。用光电池和检流计代替眼睛进行比色分析，又称光电比色法。光电比色法测定的条件是在可见光范围，并要求测定为有色物，或经过一定的化学处理使无色的测定物质变成有色化合物或者使其所处的溶液变成有色液，与经同样处理的已知浓度的标准液在光电比色计上进行比色，求出各自的光密度（吸光度），经计算即可求出被测物的含量。 比色分析较常见的仪器为光电比色计和分光光度计。（三）分光光度法采用适当的光源、棱镜和适当的光源接受器。可使介质浓度测定范围不仅仅局限于可见光，尚可扩大到紫外光区和红外光区。经单色器（棱镜）得到的光源虽说不是纯的单色光，但波长范围更狭窄，也更符合Lambert-Beer定律，使灵敏度大为提高。 以不同波长的单色光作为入射光，测定某一介质溶液的光密度。然后以入射光的不同波长为横轴，各相应的光密度为纵轴作图，可得到溶液介质的吸收光谱曲线。不同的物质，分子结构不同，其吸收曲线也有其特殊形状，许多动、植物组织中所含组分用化学方法不易分离，此组分可借助于分光光度法测定出不同的光谱曲线，用于确定几种组分的性质和含量，此法的优点是光电比色法不可 比拟的。由于分光光度计波长范围较大（2001000nm） ,故既可用于可见光，也可用于紫外光或红外光的分光测定。又由于分光光度法可利用物质特有的吸光谱曲线进行定性定量，因此，测定物质既可为有色物，也可是无色物，从而使测定手续简化，标本用量也可减少。 目前，学生实验室多用722型或UV-9100型分光光度计，其基本结构如图 所示： （图6-0-9） 图9 722型分光光度计结构示意图此仪器的最大特点为受光器不是光电池,而是光电管。光电管的阴极表面（光电面）有一层对光灵敏的物质，当光射到光电管后，会发射出光电子，此光电子向阳极移动，形成光电流。光电管灵敏度虽比光电池小，但经光电管出来的光电流可以放大，而经光电池出来的光电流不易放大，并且光电池易疲乏，故较高级的分光光度计均采用光电管作为出射光线受光器。722型分光光度计的使用方法：接通电源, 打开比色箱盖，使检流计指针处于”0”位，预热10分钟，用波长调节器选用所需的波长。将空白或对照液及测定液分别装入比色杯内，擦干后置于比色盒中，再放入比色箱内，放妥盖好。此时空白溶液对在光路上，光电管感光。旋转光量调节器，使检流计指针正确地指在透光度“100%”或光密度“0”上。轻轻拉动比色槽滑杆，使其他比色杯依次处于光路上，同时光密度。使用时可根据不同波长、光量分别选用放大器灵敏度挡，使空白液能很好地用光量调节器使光密度调整到“0”。其灵敏度范围是 第一挡1倍，第二挡10倍，第三挡20倍。（四）计算1利用标准管计算被测物含量：用已知浓度的标准物与测定管同样处理，读取光密度，再根据（6）式计算： A1=k1c1l1 A2=k2c2l2式中A1、