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生物科学热门话题知识讲座结课论文 生物技术在食品检测方面的应用摘要: 综述了DNA探针、PCR、生物芯片、胶体金免疫层析及ELLSA等生物技术的基本原理及其在食品检测方面的应用。关键词: 生物技术DNA探针PCR生物芯片胶体金免疫层析ELLSA食品检测Application of Biological Techn iques for Detection in FoodsXie Xiuzhi(Guangzhou Agricultural S tandard and Supervisory Center, Guangzhou 510315)Abs tra c t: The p rimary p rincip les of several biological techniques, includingDNA p robe, PCR, bio2chip s, immuno2chromatographicassay( ICA) and ELLSA were introduced, and meanwhile, their app lication in the regions of food safety and quality control were mainlydiscussed1Key wo rd s: Biological techniquesDNA p robePCRBio2chip sICAELLSAFood detection当前,我国农产(食)品质量安全问题受到社会广泛关注,仅靠常规的化学检测已不能满足快速判定的需要。一些简便、敏感、准确、省力、省成本的快速检测方法越来越多地被运用到食品安全性检测中。食品安全及质量与人们生活健康息息相关,也是影响食品工业发展及对外贸易的重要因素。长期以来,广泛应用的物理、化学、仪器等食品检测方法已不能满足现代食品检测的需要。一些简便、敏感、准确、省力、省成本的快速检测方法越来越多地被运用到食品安全性检测中。近些年发展的生物技术检测方法因其特异的生物识别功能,极高的选择性,且精确、灵敏、快速、成本低廉,在食品科学领域中得到了广泛应用,尤其是在检测致病性微生物、转基因食品等方面不可或缺。就近几年食品检测中常用的几种生物技术,诸如核酸杂交、PCR、生物芯片、生物传感器等做以介绍。1DNA探针技术1、1基本原理DNA探针技术又名核酸分子杂交技术,即两条不同来源的核酸链如果具有互补的碱基序列,就能够特异性地结合而成为分子杂交链。在已知的DNA或RNA片段上加上可识别的标记(如32 P同位素标记,生物素等) ,制成DNA 探针,即可检测未知样品中是否具有与其互补的序列 1, 2 ,检测出样品中是否含有此种微生物。近年来DNA探针技术在食品微生物检测中的应用十分广泛,目前已可以用DNA 探针检测食品中的大肠杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、李斯特氏菌 3 - 5 等。1、2DNA探针技术在食品检测中的应用 1 DNA 探针用于食品中微生物检测的关键是DNA探针的构建。为保证检测结果的高度特异性,必须根据具体的检测目标,构建不同的DNA探针。构建DNA探针是以待检微生物中特异性保守基因序列为目标DNA,以该序列的互补DNA作为杂交探针,对一般微生物而言,可以用决定该微生物特有的生理、生化特征的基因序列构建特异性的DNA探针。周志江 6 等用生物素标记的编码大肠杆菌耐热毒素( ST)的DNA片段作为基因探针,检测了污染食品中的产ST大肠杆菌。Moseley等( 1994)利用生物素标记的克隆沙门氏菌DNA片段作为基因探针,检测临床样品、食品及饲料样品中的沙门氏菌,敏感性为80个细菌/g。Hill等曾用 a232 P 标记的DNA 探针检测污染食品中的产热敏性肠毒素(LT)的大肠杆菌,其敏感性达100个细菌/g。陈倩等 7 对从食品中以血清学初筛分离出的78 株ESIEC菌株,以rp2z为探针检测其HP I毒力岛基因,结果检出了7株,可鉴定为ESIEC大肠杆菌。传统的用放射性同位素标记的DNA 探针技术,具有半衰期短,对人体有危害,作为常规诊断、特别是在食品检测实验室中不太适用; 生物素标记的DNA探针在紫外线照射下易分解,且易出现非特异性反应。近年来不少实验室采用地高辛代替进行标记,其毒性相对较小,应用越来越广泛。因此DNA探针技术在食品微生物检测中不失为一种有效的检测技术。2PCR及其改进技术在食品检测中的应用2、1传统PCR技术聚合酶链反应( polymerase chain reation, PCR)是1985年诞生的一项体外扩增DNA的方法 8 ,是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在的条件下,依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应,体外扩增特异DNA片段的技术。食品检测中, PCR主要用病原微生物、转基因食品检测。PCR方法对病原菌进行检测早在1992年就有报道 9 ,然而从食品中检测病原微生物到近几年才比较广泛地应用。目前,利用传统PCR技术能够检测出的病原菌主要有单增李氏菌、肠出血性大肠杆菌0157、H7、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和性小肠耶尔森氏菌 10, 11 。1996年德国伯恩斯坦大学的MeyerRolf等论证了PCR检测转基因食品的可能性,而后,该技术被广泛应用于转基因食品的检测。在现有得到相关国家的安全评价的商品化源基因食品中绝大多数含转录启动子CaMV35 s、转录终止子NOS及抗生素抗性基因NPT,这为建立相应的PCR筛选检测方法提供了便利 12 。迄今为止,利用定性PCR 检测技术可检测如大豆、玉米、番茄、油菜等多种转基因作物 13 。传统PCR技术在实际应用中表现出一些缺陷,例如,只能定性而不能定量地检测,且在有死细菌存在的情况下容易产生假阳性、不能检测致毒微生物产生的毒素等。因此各项新技术的出现以及与PCR技术的有机结合,发展起来一系列改进的PCR技术。2、2实时定量PCR技术实时定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量的方法。该方法可以对GMO 进行定量分析,目前已被一些国家的政府实验室采用 14 。近年来,实时定量PCR技术在食品检测中的应用研究越来越广泛。在食物加工过程中外源DNA污染的定量,病原微生物的检测、掺假量的检测、转基因食品的检测方面都具有重要的应用。例如2003年, Sandberg等 15 用检测谷物基因来控制那些缺乏麦麸的婴儿食物;曹际娟等 16 检测了肉骨粉中牛羊源成分; 2006年,Muleg等 17 检测葡萄中曲霉菌的污染程度;潘良文等 18 对转基因油菜中Barnase基因成功地进行了测定。Alery等 19 也证实了该技术是估计食品中普通小麦量的理想技术。2、3PCR2DGGE技术PCR2DGGE技术是由Sheffield等1989 年首次提出,将变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术和PCR技术结合起来,可分离长度相同但是碱基不同的DNA片段混合物,在变性条件适当的情况下能分辨一个碱基对,具有特异性强、敏感性高的特点 8 。运用该技术,Ampe等 20 从面团中中鉴定乳杆菌和木薯淀粉发酵中的微生物菌落。2、4巢式和半巢式PCR巢式PCR ( nested PCR)是在普通PCR 基础上发展起来的一种PCR 技术,其原理是设计两对引物,其中1对引物在另1对引物扩增产物的片段上,通过2次PCR反应对某个基因进行检测。半巢式PCR ( semi2nested PCR)的原理与巢式PCR 基本相同,只是半巢式PCR只有1对半引物,有1个引物被用于两次PCR反应中。这两种方法可以减少假阳性的出现,同时可以使检测的下限下降几个数量级。从理论上来说,用巢式和半巢式PCR可以检测到低于10- 11 g/L的DNA模板量,且具有高度的特异性,其结果一般不需要再用其他方法来验证。另外,多重PCR8 , RAPD2PCR21 , PCR2EL ISA13 等也在食品检测中有广泛的应用。3生物芯片技术及其在食品检测中的作用生物芯片是20世纪80年代末在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术,它主要是指通过微加工技术和微电子技术在固格体芯片表面构建的微型生物化学分析系统,以实现对细胞、蛋白质、DNA以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。生物芯片的主要特点是高通量、微型化和自动化,其中基因芯片和蛋白质芯片在食品检测中广泛应用,分别从基因和蛋白水平实现对病原性微生物及转基因食品等的检测。3、1基因芯片技术基因芯片(DNA芯片、DNA微阵列) 是将各种基因寡核苷酸点样于芯片表面,待检样品DNA 经PCR扩增后,制备荧光标记探针,然后再与芯片上的寡核苷酸点杂交,最后通过扫描仪定量和分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在特定基因。因基因芯片技术能够及时、准确地检测出食品中的病原性微生物,近年来受诸多研究者青睐。3、1基因芯片技术在食品卫生检测中的应用 22 Appelbaum在对几种细菌进行鉴别时,兼顾了基因序列的保守性(含有细菌所共有的16S rDNA保守序列)和各菌种间的差异性,设计了一种鉴别诊断芯片不仅敏感度高于传统方法,而且操作简单,重复性好。Borucki等构建的混合基因组微阵列,可准确鉴别各种近缘单核增多李斯特菌分离物; Volokhov等通过单管复合体扩增和基因芯片技术检测和鉴别6种李斯特菌。Call等通过分析E1coli O157H7的Shiga样毒素及溶血素A发现基因芯片可准确检测各种E1coli O157 H7 的分离物; Chandle等确定免疫磁珠分离结合微阵列可检测生禽肉清洗液中的E1coli O157H7,其检测限达10 CFU /mL;空肠弯曲菌是食源性腹泻的主要病因,但其主要生物学特征尚不甚了解,Dorrell等通过比较11株空肠弯曲菌的全基因组序列证实该菌荚膜决定Penner血清型,为确定该菌致病性相关指标指出进一步研究的方向。此外,Wilson等采用病原体诊断区基因扩增和20个寡核普酸藻红素标记探针开发出一套多病原体识别( MP ID)微阵列,可准确识别18种致病性病毒、原核生物和真核生物,对炭疽杆菌的检测限低至10。Chizhiko等采用寡核苷酸芯片研究大肠杆菌、志贺氏菌及沙门氏菌的抗原决定簇和毒力因子与其致病性的关系,发现细菌毒力因子可用于肠道致病菌的分析检测。3、2基因芯片技术在转基因食品检测中的应用目前国际上尚无科学报告证实转基因食品的永久安全性。因此,对转基因食品进行检测和标识势在必行。基因芯片可以检测出食品中是否含有转基因,以及含有何种转基因。缪海珍 23 采用基因芯片(上海博星基因芯片有限公司制备)对大豆、玉米、油菜、棉花等转基因农作物样品进行检测。该芯片中加了CaMV2P基因,可鉴定CaMV35S阳性是否是由于病毒污染样品所致,从而对大豆、玉米、油菜和棉花四大类农作物的转基因背景都有了了解,因此该基因芯片检测范围广。3、2蛋白芯片及其应用体久安全性术正蛋白质芯片与基因芯片原理相似,不同的是前者是预先将大量蛋白质、蛋白质检测试剂或检测探针以预先设计方式固定在玻片、硅片及纤维膜等固定载体上。该方法可对各种蛋白质、抗体及配体进行检测,弥补基因芯片检测不足。具有多元样品同时检测、可直接测量非纯化分析物、样品用量少、样品无需任何标记物、具有分辨和排除干扰信号能力、检测速度快、结果直观等特点 24 - 26 Rowe建立一种基于荧光免疫检测方法抗体芯片,检测葡萄球菌内毒素、耶尔森氏菌产生特异性抗原和一些细菌感染造成脓毒血症特异标志物,并检测了对含芽抱杆菌、噬菌体、葡萄球内毒素3大类型个样品 27, 28 。在转基因食品检测方面,由于外源基因最终是以蛋白质或多肽形式得以表达,通过对蛋白质芯片设计不同探针阵列、使用特定分析方法可使该技术在此方面具有较高应用价值,是未来转基因食品安全检测的主要方向。4 胶体金免疫层析技术在食品检测中的应用胶体金免疫层析技术( immuno2chromatographicassay, ICA)在医学上应用较多,在食品检测领域的应用在近几年才发展起来。该方法操作简单、检测时间短、便于现场操作,可以为现场执法带来科学依据。目前,国内的研究主要集中在食品安全问题领域,此类检测通常需要进行定性分析或简单的半定量分析。4、1在食品中有害微生物检测中的应用胶体金免疫层析技术可用于食品中有害微生物的检测。如食品中常见的致病菌有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、布氏杆菌、霍乱弧菌等 29 - 36 。2006年,王静等 29 利用双抗体夹心法检测E. coliO157,最低检出浓度为1 105 CFU /mL,仅耗时15 min。邵晨东等 33 于2005年用该技术检测沙门氏菌O9抗原,最小检出量为4 105 CFU /条。4、2在检测食品中药物残留及有害物中的作用食品中药物残留残留物多为小分子物质,属于半抗原,制备抗体时需要将其与大分子蛋白(如人血清白蛋白、卵清白蛋白等)进行偶联,制备人工抗原进行检测。2006年,张明等 37 采用SMZ2HSA (磺胺甲噁唑2人血清白蛋白)免疫新西兰白兔制得抗体,用胶体金技术对磺胺类药物SMZ残留进行检测,表明该方法对SMZ 标准溶液的灵敏度达到50 ng/mL,整个检测反应在5 - 10 min内完成。赵晓联等 38 于2005年采用竞争免疫层析技术检测食品中的黄曲霉毒素B1,制得检测试纸条,其最低检测限为215 ng/mL。另外,李余动等 39 对检测氯霉素残留的研究,陈小旋 40 对猪肉中盐酸克伦特罗残留的检测研究都采用了胶体金免疫层析技术,得到了能够快速方便的检测试纸条。4、3在检测食品中违禁药物的应用任辉 41 采用竞争免疫层析法检测食品中的吗啡,最小检测质量为45 g /mL。方邢有等 42 于2005年同样采用竞争性免疫层析技术检测食品中的罂粟碱,得到的试纸条检出限为012g/mL,正确检出率约为97%。目前,国内这一领域的研究仍处于实验室阶段,尚无国产的成型产品。有待于尽快研制出多品种、高质量的免疫层析产品,不仅可避免国内资金的大量外流,并且对改善食品质量与安全,提高我国国民健康水平,将起到不容忽视的作用。5生物传感器检测技术在农产(食)品质量检测中的研究5、1农药残留的检测近些年,国内外学者就生物传感器在农药残留检测领域中的应用做了一些有益的探索。在农药残留检测中,最常用的是酶传感器。不同酶传感器检测农药残留的机理是不同的,一般是利用残留物对酶活性的特异性抑制作用(如乙酰胆碱酯酶)来检测酶反应所产生的信号,从而间接测定残留物的含量。但也有些是利用酶对目标物的水解能力(如有机磷水解酶) 。美国Heather等 43 以仿生纳米硅粒胶囊将丁酰胆碱酯酶(BuCHE)和磷酸水解酶(OPH)固定化后,注入检测柱内,构成酶反应器( IMERS) 。该反应器与空气化学污染物采集系统集成,从而研发了用于连续监测空气中有机磷污染的酶传感器系统,该系统通过实时分析酶水解产物来测定有机磷含量。该系统检测适用范围较广,包括对氧磷(paraoxon) 、对吸磷( demeton - S) 、马拉硫磷(malathion)等。Singh 44 等开发了一种电化学生物传感器用于杀虫剂克菌丹及其代谢物的快速检测。该传感器的生物电极中固定有谷胱甘肽- S转移酶( GST) ,一定浓度的克菌丹对GST产生抑制作用的反应,利用电容- 电压(CV)技术测定抑制反应过程中电流的变化,并以此来判定被检测物克菌丹的浓度。研究结果表明,该电化学生物传感器对克菌丹的检测限为0. 2516 mg/L,抑制率大于72% ,灵敏度高达4. 5 A / (mg/L) ,检测响应时间12 s。Schvdge等 45 利用生物传感器的方法检测即食食品中杀虫剂残留物(有机磷酸酯和氨基甲酸盐) ,并与杀虫剂的传统检测方法相对比,生物传感器测定法与传统方法的检测结果较吻合,但无须对检测样品进行提取或预浓缩等复杂的前处理,检测灵敏度高,操作简便快捷。该传感器对杀虫剂的检测浓度水平可低于5 mg/kg,完全满足欧盟关于即食食品中杀虫剂10 mg/kg最大检测限的规定。Revolt等利用表面等离子共振检测技术( SPR)对农药进行检测研究,认为SPR 生物传感器体积小,成本低,响应快,灵敏度高,实时在线检测和抗干扰能力强,该方法的检测范围为0. 0011. 0 mg/L,因而非常适合用于现场的农药残留检测。5、 2抗生素残留检测抗生素是某些微生物在代谢过程中产生的能抑制或杀灭其他病原微生物的化学物质。如果大量使用或滥用,那么其代谢产物可能过量的蓄积,贮存于动物的细胞、组织器官中,人们通过食取或接触可能会引起体内的病变。有报道关于表面等离子谐振免疫传感器( SPR - basedbiosensor immunoassays, SPR - B IAs) 在磺胺甲嘧啶( sulfa2methazine)链霉素检测上使用 46 , Ashwin等47 利用SPR传感器检测动物产品中的氯霉素,所使用的传感器(Biacore AB)芯片中固定的抗体与氯霉素代谢物氯霉素- 葡萄糖苷酸有很好的免疫交叉反应,所以达到同时检测的目的,检测的范围也扩大到蜜蜂、动物内脏和水产中。Pellgrini等 48 使用电化学传感器设计巧妙的方法,间接检测牛奶中四环素和对苯二酚残留,选用对其敏感的大肠杆菌密封培养,假定每个微生物产生CO2 的速度相同,加入到培养基中的药物抑制生长,从而引起CO2 产量的改变,使用CO2 传感器(电极CO2 - S)监测CO2 浓度的变化,依据一定的公式,便可知抗生素的浓度,与微生物抑制法和免疫法比较有快速实时、样品量小、不需样品处理、检测灵敏度高等特点。5、 3细菌和病毒的检测Cheng等 49 开发了一种电流式酪氨酸酶生物传感器用于大肠菌的检测,非常适合于水质分析和临床自动诊断。该传感器采用玻璃碳电极,电极表面被纳米复合物修饰,且酪氨酸酶通过戊二醛固定在修饰电极上,与苯酚发生催化反应。传感器通过测定反应的电化学特性来检测苯酚的含量,显示出较宽的检测响应范围1. 0 10- 8 3. 9 10- 5 mol/L,检测下限为5. 0 10- 9 mol/L,灵敏度高达516 mA / (mol/L) 。而且,该传感器与流动注射分析( FIA)系统相结合可以用来监测大肠菌,检测原理是基于该传感器对苯酚的检测原理,大肠菌溶液的酶反应会产生苯酚, FIA系统中的电流响应值与该细菌的浓度成正比,检测范围为20100 000CFU /ml,检测下限为10 CFU /ml。Moschopoulou等 50 利用生物传感器的方法来检测病毒,将某种病毒抗体(如黄瓜花叶病毒)植入纤维原细胞膜,这些纤维原细胞与电板构成了超灵敏的微型细胞生物传感器系统,当相应的病毒(抗原)与细胞膜中的抗体发生触发反应时会引起细胞膜电压变化,利用微电极可以测定病毒抗原和抗体反应造成的电压变化,并以此来判定病毒种类并检测其浓度。与现有的酶免疫测定法相比,本方法成本相近,检测速度快,无需前处理,操作简便,非常适用于常规的或田间的病毒检测。Andrea等 51 利用2种方法将抗体通过共价作用与纳米孔硅片薄膜进行生物结合,制成用于病毒检测的生物传感器。试验表明,纳米孔硅膜的孔渗透性和束缚效率与孔表面的湿润性(wettability)相关,对于抗菌素病毒MS2的检测灵敏度高达2 107 PFU /ml。5、 4其他成分的检测Shkotova等 52 研制了乳酸氧化酶电流式生物传感器,并对2种不同酶固定化方法(聚合物物理吸附法和电化学聚合法) 进行对比分析研究, 吸附法检测范围为0. 004 0. 5 mmol/L,灵敏度320 nA / (mmol/L) ;电化学聚合法分别为0. 051. 6 mmol/L 和60 nA / (mmol /L) 。利用该生物传感器分析发酵液或酒中的乳酸含量,可用于葡萄酒发酵过程的控制和优化,以及葡萄酒品质控制。Donatella等 53 以二氨氧化酶DAO作为生物识别成分,用戊二醛将DAO固定在电镀合成双层膜上,研制了一种无干涉的电流式生物传感器,用来检测食品中的生物铵,结果表明其响应灵敏度高,响应时间短,检测极限低,抗干涉性能佳,可以用于食品的筛析。Wang等 54 以纳米金作为荧光剂,以核酸适配体( ap tam2er)作为探针,利用改性DNA纳米金研制成核酸适配体生物传感器,用于蛋白质的测。Kestwal等 55 人研制了电化学生物传感器用于Hg ( ) 、Ag( ) 、Pb ( )和Cd ( )等重金属的检测。该传感器检测探头为25m的铂超微电极,将转化酵素和葡萄糖氧化酶包埋在琼脂糖树脂,并以此对超微电极进行修饰。该传感器的检测范围为1 10- 10 1 10- 7 mol/L, 最低检测限为1 10- 10 mol/L,可重复利用9次。该传感器有望应用于重金属离子尤其是Hg2 +的现场实时快速检测。Shimomura等 56 报道了利用电化学生物传感器检测甲醛的新方法。该传感器包括固定化有蚁酸脱氢酶的介孔氧化硅材料、电化学介体(苯醌)以及电极,研究表明该传感器响应快、灵敏度高, 能够检测水溶液的甲醛最低浓度为1. 2mol/L,而且具有高选择性、高重复利用性以及储存稳定性。Mohammed等 57 利用SPR生物传感SPREETATM开展食物过敏原的在线检测研究,该传感器对花生检测下限为0. 7g/ml。SPREETATM传感器体积小,质量轻,易于携带,经久耐用,成本低,且操作简便,实时监测和采集数据,并输出折射率随时间的变化曲线。微型生物传感器的出现,为食品生产过程中过敏原的快捷、在线检测提供了有效工具。6酶联免疫吸附法( EL ISA)EL ISA是以抗体和抗原的特异性结合为基础,以酶或者辅酶作为标记物,标记抗原或者抗体,用酶促反应的放大作用来显示初级免疫学反应。其最大的特点就是利用聚苯乙烯微量反应板(或球)吸附抗原或者抗体,使之固相化,在其中进行免疫反应和酶促反应。该方法简便、灵敏度高、特异性强、快速等特点,并能批量地分析样品,在食品检测中应用广泛,检测范围较广,如生物毒素和残留农药(黄曲霉毒素B1 58 、氯霉素、克百威) 、微生物(沙门氏菌)及食品中的其它成分 47249 。EL ISA技术方便快捷,不仅适用于食品中生物活性成分的检测,也适于非活性成分检测,因此有广泛的应用前景。7小结综上所述,多项生物技术因其低成本、高效、高通量和高特异性等特点已经渗透着食品检测领域,其优越性日趋明显,成为未来食品安全检测中的生力军。但每种方法难免有其局限性,在应用中需依具体需要进行选择或搭配使用,也期待各种方法的优化和新技术新方法的问世,从而为人们赖以生活的食品提供安全和营养的可靠保障。参考文献 1 张奇志. DNA探针和PCR技术在食品检测中的应用. 广东农工商职业技术学院学报, 2007, 23 (2) : 53256. 2 卿柳庭,等. 核酸探针和PCR技术在食品检验中的应用. 动物医学进展, 2000, 21 (2) : 22224. 3 徐茂军. 基因探针技术及其在食品卫生检测中的应用. 食品与发酵工业, 2001, 27 (2) : 66267. 4 Rudi K, Nogva HK, et al. Development and app lication of new nu2cleic acid2based technologies for microbial community analyses infoods. International Journal of Food Microbiology, 2002, 78:1712180. 5 Radhika B, et al. Detection of B acillus cereus in foods by colony hy2bridization using PCR generated p robe and characterization of iso2lates for toxin by PCR. International Journal of Food Microbiology,2002, 74: 1312138. 6 周志江,刘纯杰. 生物素标记ST基因探针检测产肠毒素性大肠杆菌的研究. 兽医大学学报, 1991, (2) : 3142317. 7 陈倩,等. 基因探针检测食品中具有HP I毒力岛的ESIEC大肠杆菌. 食品科学, 2000, (7) : 35. 8 刘辉, 杨利平, 张滨. PCR及其改进技术在食品检测中的应用.食品与机械, 2008, 24 (4) : 1662169. 9 Nakajima H. Detection and identification of Yersinia pseudotuberculos and pathogenic yersinia enterocolitica by an imp roved polymerasechain reaction method. J ClinMicrobiol, 1992 (30) : 248422486. 10 马宏伟,吴永生,邹清杰. PCR法检测食品中的致病性小肠耶尔森氏菌. 现代预防医学, 2002, 29 (2) : 1642166. 11 曹泽虹,李勇. 用PCR法快速测定食物中毒病原菌. 微生物学通报, 2001, 28 (4) : 73276. 12 王庆华,吕振岳,黄东东. 转基因食品及其检测技术的发展现状. 粮油加工与食品机械, 2002 (3) : 35237. 13 宋姗,龚加顺. 转基因食品及其检测技术的研究进展. 食品研究与开发, 2005, 26 (5) : 1312134. 14 周少芸. 转基因食品检测方法的研究进展. 福建稻麦科技,2007, 25 (1) : 43245. 15 SandbergM, Lundberg L, Ferm M. et al. Real time PCR for thedetection and discrimination of cereal contamination in gluten freefoods . European Food Research and Technology, 2003 ( 217 ) :3442349. 16 曹际娟,卢行安,曹远银,等. 实时荧光PCR技术检测肉骨粉中牛羊源性成分的方法. 生物技术通讯, 2003, 23 (8) : 87291. 17 Bellagamba F, Comincini S, Ferretti, L, et al. App lication ofquantitative real2time PCR in the detection of p rion2p rotein genespecies specific DNA sequences in animalmeals and feed stuffs. JFood Prot, 2006, 69 (4) : 8912896. 18 潘良文,田风华,张舒亚. 转基因抗草丁膦油菜籽中Barnase基因的实时荧光定量PCR 检测. 中国油料作物学报, 2006, 28(2) : 1942198. 19 Terzi V, MalnatiM, BarbaneraM, et al. Development of analyti2cal systems based on real time PCR for Triticum species specific de2tection and quantitation of bread wheat contamination in semolinaand pasta. Journal of Cereal Science, 2003, 38 (1) : 87294. 20 Ampe Frdric, OmarNabil ben, Moizan Claire, et al. Polyphasicstudy of the spatial distribution of microorganisms in mexican Po2zol, a fermentedmaize dough, demonstrates the need for cultivationin dependent methods to investigate traditional fermentations. Ap2p lied and Environmental Microbiology, 1999, 65 ( 12 ) :546425473. 21 Saez R, Sanz Y, Toldra F. PCR2based fingerp rinting techniquesfor rap id detection of animal species in meat p roducts. Meat Sci2ence, 2004, 66: 6592665. 22 张奇志,邓欢英. 生物芯片技术及其在食品检测中的应用,中国食品学报, 2007, 7 (2) : 1342137. 23 缪海珍,朱水芳,张谦,等. 采用基因芯片技术筛查农作物转基因背景,复旦学报(自然科学版) , 2003, 42 (4) : 6342642. 24 靳刚. 蛋白质芯片技术及生物医学应用. 中国科学院院刊,2003 (3) : 3612364. 25 孙秀兰,等. 生物芯片技术与食品分析. 生物技术通报, 2003(4) : 22225. 26 崔建国,蔡建明,黄越承. 蛋白质芯片及其应用. 国外医学分子生物学分册, 2003, 25 (1) : 19221. 27 Rowe CA. Scruggs SB, Feldstein MJ. An array immunosensor forsimultaneous detection of clinical analytes. Annual Chemistry,1999, 71 (2) : 4332439. 28 Rowe CA. Tender LM, FeldsteinMJ. Array biosensor for simulta2neous identification of bacterial, viral and p rotein analytes. AnnualChemistry, 1999, 71 (17) : 384623852 29 王静,陈维娜,胡孔新,等,大肠杆菌O157 胶体金免疫层析快速筛查方法的建立. 卫生研究, 2006, 35 (4) : 4392441. 30 Shyu RH, Shyu HF, Liu HW, et al. Colloidal gold basedimmuno2chromatographic assay for detection of ricin. Toxicon, 2002, 40 (3) :2552258. 31 Takeda T, Yamagata K, Youhida Y, et al. Evaluation of immuno2chromatography based rap id detection kit for fecal Escherichia coliO157. Kansenshogaku Zasshi, 1998, 72 (8) : 8342839. 32 杜玉萍,陈清,俞守义,等. 胶体金免疫层析法检测金黄色葡萄球菌的初步研究. 热带医学杂志, 2006, 6 (6) : 6502652. 33 邵景东,陈飞,肖国平. O9群沙门氏菌胶体金检测试剂盒的研制. 检验检疫科学, 2005, 15 (3) : 302321. 34 YoshimasuMA, Zawistowski J. App lication of rap id dot blot immu2noassay for detection of Salm onella enterica serovar enteritidis ineggs, poultry and other foods . App Environ Microbiol, 2001, 67(1) : 4592461. 35 Abe C, Hirano K, Tomiyama T. Simp le and rap id identification oftheM ycobacterrium tuberculosis comp lex by immunochromatographicassay using anti2MPB64 monoclonal antibodies. J ClinMicrobiol,1999, 37 (11) : 369323697. 36 王中民,李君文,王新为. 胶体金免疫层析法快速检测沙门氏菌. 微生物学免疫学进展, 2004, 32 (4) : 36238. 37 张明,吴国娟,陆彦,等. 免疫胶体金法检测磺胺甲噁唑残留的研究. 中国兽药杂志, 2006, 40 (4) : 172191. 38 赵晓联,龚燕,孙秀兰,等. 金标免疫层析法检测黄曲霉毒素B1的方法. 粮油食品科技, 2005, 13 (6) : 49251. 39 李余动,张少恩,吴志刚,等. 胶体金免疫层析法快速检测氯霉素残留. 中国食品卫生杂志, 2005, 17 (5) : 4162419. 40 陈小旋. 盐酸克伦特罗单克隆抗体制备及其免疫层析试纸条的研制D . 福州:福建农林大学, 2005, 147261. 41 任辉. 免疫胶体金层析法快速检测食品中吗啡. 中国公共卫生,2004, 20 (4) : 488. 42 方邢有,高志贤. 胶体金免疫层析法检测罂粟碱的研究. 分析试验室, 2005, 24 (12) : 124. 43 蒋雪松,王剑平,应义斌,等. 用于食品安全检测的生物传感器的研究进展 J . 农业工程学报, 2007, 23 (5) : 272 - 277. 44 王凯,殷涌光. SPR 生物传感器在食品安全领域的应用研究 J . 传感器与微系统, 2007, 26 (5) : 12 - 17. 45Heather R L, Roby G,Mike H B, et al. Biosensor system for continu2ousmonitoring of organophosphate aerosols J . Biosensors and Bio2electronics, 2007, 23: 400 - 406. 46 Singh R P, Kim Y J, Oh B K, et al. Glutathione - s transferase based electrochemical biosensor for the detection of cap tan J . Elec2 trochemistry Communications, 2009, 11 (1) : 181 - 185. 47 Schulze H, Scherbaum E, AnastassiadesM, et al. Development, vali2 dation, and app lication of an acetylcholinesterase biosensor test for the direct detection of insecticide residues in infant food J . Bachmann Biosensors and Bioelectronics, 2002, 17: 1095 - 1105. 48 熊剑娟. 酶联免疫吸附方法测定酱油中黄曲霉毒素B. 中国调味品, 1999 (4) : 27228. 49 太全,等. 肠衣中氯霉素残留量检测的研究. 肉类工业, 2003 ,(10) : 38239. 50 丁志刚,王静,高红梅. 抗生素残留检测技术的