环境微生物实验指导内容-生命科学学院本科基础实验教学中心.doc

第一部分 基础实验实验一 显微镜的基本构造、使用和保养一、目的要求1.熟悉普通光学显微镜的构造及各部分的功能。2.学习并掌握油镜的原理和使用方法。二、显微镜的基本构造显微镜是由机械装置和光学系统两大部分组成。1机械装置镜座(base)和镜臂(arm)镜座位于显微镜底部,呈马蹄形，它支持全镜。镜臂有固定式和活动式两种，活动式的镜臂可改变角度。镜臂支持镜筒。镜筒(body tube)是由金属制成的圆筒，上接目镜，下接转换器。镜筒有单筒和双筒两种，单筒又可分为直立式和后倾式两种。而双筒则都是倾斜式的，倾斜式镜筒倾斜45。双筒中的一个目镜有屈光度调节装置，以备在两眼视力不同的情况下调节使用。转换器(nosepiece)为两个金属碟所合成的一个转盘，其上装34个物镜,可使每个物镜通过镜筒与目镜构成一个放大系统。载物台(stage)又称镜台，为方形或圆形的盘，用以载放被检物体，中心有一个通光孔。在载物台上有的装有两个金属压夹称标本夹，用以固定标本；有的装有标本推动器，将标本固定后，能向前后左右推动。有的推动器上还有刻度，能确定标本的位置，便于找到变换的视野。调焦装置 是调节物镜和标本间距离的机件，有粗动螺旋（coarse adjustment）即粗调节器和微动螺旋（fine adjustment）即细调节器，利用它们使镜筒或镜台上下移动，当物体在物镜和目镜焦点上时，则得到清晰的图像。2光学系统物镜（objective）物镜安装在镜筒下端的转换器上，因接近被观察的物体，故又称接物镜。其作用是将物体作第一次放大，是决定成像质量和分辨能力的重要部件。物镜上通常标有数值孔径、放大倍数、镜筒长度、焦距等主要参数。如：NA 0.30；10；160/0.17；16。其中“NA 0.30”表示数值孔径（numericalaperture,简写为NA），“10”表示放大倍数，“160/0.17”分别表示镜筒长度和所需盖玻片厚度（），“16”表示焦距。目镜（coular lens）装于镜筒上端，由两块透镜组成。目镜把物镜造成的像再次放大，不增加分辨力，上面一般标有7、10、15等放大倍数，可根据需要选用。一般可按与物镜放大倍数的乘积为物镜数值孔径的500700倍，最大也不能超过1000倍的选择。目镜的放大倍数过大，反而影响观察效果。聚光器（condenser）光源射出的光线通过聚光器汇聚成光锥照射标本，增强明度和造成适宜的光锥角度，提高物镜的分辨力。聚光器由聚光镜和虹彩光圈（iris diaphragm）组成，聚光镜由透镜组成。虹彩光圈由簿金属片组成，中心形成圆孔，推动把手可随意调整透进光的强弱。调节聚光镜的高度和虹彩光圈的大小，可得到适当的光照和清晰的图像。光源（light source）较新式的显微镜其光源通常是安装在显微镜的镜座内，通过按扭开关来控制；老式的显微镜大多是采用附着在镜臂上的反光镜，反光镜是一个两面镜子，一面是平面，另一面是凹面。在使用低倍和高倍镜观察时，用平面反光镜；使用油镜或光线弱时可用凹面反光镜。滤光片（filter）可见光是各种颜色的光组成的，不同颜色的光线波长不同。如只需某一波长的光线时，就要用滤光片。选用适当的滤光片，可以提高分辨力，增加影像的反差和清晰度。滤光片有紫、青、蓝、绿、黄、橙、红等各种颜色的，分别透过不同波长的可见光，可根据标本本身的颜色，在聚光器下加相应的滤光片。三、器材显微镜、擦镜纸、香柏油、二甲苯、染色玻片标本四、显微镜的使用 (1)安放显微镜打开镜箱，右手紧握镜臂，左手平托镜座，轻放桌上，距离桌子边缘几厘米处，使目镜对着观察者。（2）检查检查各部件是否完好，镜身、镜头必须清洁。（3）对光配置内置式电光源的显微镜可直接打开电源开关，并调节光量，使视野内的亮度达到明暗适宜，同时打开光圈。旧式显微镜应首先将虹彩光圈的孔径调至最大，将聚光器升至最高点，再将低倍镜对准镜台孔，镜头离载物台约1。这时，把反光镜转向光源，直到视野中的光线既明亮又均匀时为止。在镜检全过程中，根据所需光线的强弱，还可通过扩大或缩小光圈、升降聚光器加以调节。（4）调焦光线对好后，将玻片标本放在镜台上，有盖玻片的一面朝上，被检物体对准镜台孔正中，用标本移动器上的压片夹卡紧，然后调焦。转动粗调焦螺旋调节镜台与物镜间的距离，从侧面注视，以二者间距离5为度。然后自目镜观察，慢慢转动粗调焦螺旋，同时移动标本移动器，直到基本看清标本物像。（5）低倍镜观察用粗调焦螺旋调焦后，再轻轻转动细调焦螺旋，以便得到清晰的物像。如果观察的目标不在视野中央，可调节标本移动器，使之恰好位于视野中央。若光线不适，可拨动虹彩光圈的操纵杆，调节光线至适宜。（6）高倍镜观察在低倍镜下将观察的标本部分移至视野中央，再转动镜头转换器，将高倍物镜转至工作位置。适当调节亮度后，只需微微转动细调焦螺旋，就可看到更清晰的物像。切记此时不能使用粗调焦螺旋，由于显微镜下观察的被检物有一定厚度，故在观察过程中必须随时转动细调焦螺旋，以了解被检物不同光学平面的情况。在高倍镜下，将玻片中的被检物按从上到下、从左到右的顺序移动、观察一遍，再由低倍镜转高倍镜反复观察几次，以熟练高倍镜使用。用高倍镜观察后，若有必要，可再换用油镜观察。（7）油镜观察转动粗调焦螺旋，使物镜与镜台保持一定距离。滴1滴香柏油于玻片标本待观察的区域上，将油镜头转至工作位置，眼睛从侧面注视，转动粗调焦螺旋，直至油镜头浸没于香柏油内，几乎与载玻片相接触，但不能相碰。然后从目镜中观察，用粗调焦螺旋极其缓慢地向上调节至出现物像为止，注意勿将粗调焦螺旋转动方向搞反了，以免油镜头与载玻片相碰而损坏了镜头及玻片。再用细调焦螺旋调至物像清晰，此时还应适当增加光的亮度。如果镜头已提出香柏油而尚未见到物像时，应按上述过程重复操作。使用完毕，将镜头从香柏油中脱离，取下玻片，用擦镜纸擦去镜头和玻片上的香柏油，再用擦镜纸蘸少许二甲苯擦拭镜头上的油迹，然后用干净擦镜纸擦去镜头上残留的二甲苯。二甲苯用量不宜过多，擦试时间应短。切忌用手或其他纸擦试镜头，以免损坏透镜。（8）复原显微镜使用完毕，关闭电源，将物镜镜头转开，取下玻片。擦净载物台和物镜，将各部分还原，注意物镜头不可正对镜台孔，装镜入箱。五、显微镜的保养显微镜的光学系统是显微镜的主要部分，尤其是物镜和目镜。一架显微镜的机械装置虽好，但光学系统不好，这架显微镜是不会起好作用的。因此，对显微镜要妥善保管。1避免直接在阳光下曝晒，因为透镜与透镜之间，透镜与金属之间都是用树脂或亚麻油仁粘合起来的。金属与透镜膨胀系数不同，受高热因膨胀不均，透镜可能脱落或破裂，树脂受高热溶化，透镜也会脱落。2避免和挥发性药品或腐蚀性酸类一起存放，碘片、酒精、醋酸、盐酸和硫酸等对显微镜金属质机械装置和光学系统都是有害的。3透镜要用擦镜纸擦拭，若仅用擦镜纸擦不净，可用擦镜纸蘸二甲苯拭擦，但用量不宜过多，拭擦时间也不宜过长，以免粘合透镜的树脂被溶化，而使透镜胶落。4不能随意拆卸显微镜，尤其是物镜、目镜、镜筒不能随意拆卸，因拆卸后空气中的灰尘落入里面引起生霉。机械装置经常加润滑油，以减少磨擦而受损。5避免用手指沾抹镜面，否则会影响观察，沾有有机物的镜片，时间长了会生霉，因此，每使用一次，所有的目镜和物镜都得用擦镜纸擦净。6显微镜放在干燥处，镜箱内要放硅胶吸收潮气。目镜、物镜放在盒内并存于干燥器中，以免受潮生霉。六、几种特殊光学显微镜介绍1.相差显微镜相差显微镜与普通光学显微镜在构造上的不同之外是在聚光镜下面装有一个环状光阑（加绿色滤光片），并且其物镜是装有相板的相差物镜。此外，它还具有一个调整光线的“合轴望远镜”（又称“辅助远焦镜”）。环状光阑的作用是形成一个空心的光线锥，造成透过标本的光线分离成直射光和衍射光2组光线。这2组光线分别从相板上的环区和环外区通过，导致它们之间微弱的相位差人为地扩大增强，进而在上面透镜的收敛作用下，这2组光线复在一条光路上发生干涉效应，使得相位差转变成振幅差（即明暗差），反差增强。因而通常在显微镜上难以观察到的细胞细微结构，就可以利用相差显微镜看清楚，同时增强被观察物体的立体感，即景深加大，以利于观察物体的全貌。在细胞显微操作时尤其需要相差显微镜。合轴望远镜是用在相差显微镜上调节光轴的辅助设备，它不能用来观察被检标本。相差显微镜主要用于观察未染色的活细胞，亦可用于观察固定过的材料。被检材料厚度不超过20m，载玻片要求厚薄均匀，厚度在1左右，盖玻片的厚度要求在0.17左右。2.暗视野显微镜暗视野显微镜是按照丁达尔（Tyndall）光学效应原理，在显微镜基本结构上换装暗视野聚光镜，使照射被检物体表面的光线不能直接进入物镜与目镜，而利用被检物体表面的散射光线来观察，其分辨力可达0.20.004m，这是普通光学显微镜远不可及的。它的成像特点是：黑暗的视野中可见明亮的被检物体的明细外貌及其运动，但是看不见被检物体内部的细微结构。暗视野显微镜要求载玻片厚度在0.71.7之间。3.偏振光显微镜偏振光显微镜是在普通光学显微镜的结构基础上，加上2块能使光线偏振的尼科尔棱镜。装在聚光镜下面的那一块称为起偏镜，装在目镜与物镜之间的一块称为检偏镜。这2块棱镜中的一块固定，另一块可以旋转（或者2块均可旋转），并注有刻度。另外，偏振光显微镜的镜台亦能旋转。偏振光显微镜是利用偏振光来鉴别晶体和生物体内某些有序结构的光学性质，同时也可用来鉴别某些组织中的化学成分。4.荧光显微镜荧光显微镜是利用激发的照射，使标本内的荧光物质被激发出各种不同着色的荧光，从而分辨标本内某些物质的性质和位置。也可以用显微镜外加轻便荧光光源代替荧光显微镜，其观察原理相同，只是观察效果略差。荧光显微镜主要用于观察材料中荧光染料着色的色素颗粒等特殊成分。5.倒置显微镜倒置显微镜是将光路反转，光线由上往下照射被检物体，再经过反光镜进入目镜。此种显微镜充分利用聚光镜与载物台之间的距离，主要用来观察培养器皿中的细胞和进行显微操作，当然亦可被用作显微镜。七、实验报告1.分别绘出你在低倍镜、高倍镜和油镜下观察到的细菌个体形态。2.在使用油镜进行调焦时，应将镜筒徐徐上升还是下降？为什么？3.使用油镜观察时，为什么要在载玻片上滴加香柏油？4.镜检玻片标本时，为什么要先用低倍物镜观察，而不是直接用高倍物镜或油镜观察？实验二 细菌个体形态的观察一、目的要求1学习观察细菌的个体形态2学会生物图的绘制二、基本原理细菌的个体形态是指细菌细胞的大小，形状等特征，利用观察个体形态对细菌进行初步识别和鉴定。三、器材显微镜、细菌三型涂片、双层瓶（二甲苯、香柏油）、擦镜纸四、操作步骤1观察前的准备（1）置显微镜于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约3-4，镜检者姿势要端正，一般用左眼观察，右眼便于绘图或记录，两眼必须同时睁开，以减少疲劳，亦可练习左右眼均能观察。（2）调节光源、光线较强的天然光源宜用平面镜；光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜。2低倍镜观察检查的标本需先用低倍镜观察，因为低倍镜视野较大，易发现目标和确定检查的位置。将三型涂片玻片标本置镜台上，用标本夹夹住，移动推动器，使观察对象处在物镜正下方，转动粗调节器，物镜降至距标本约0.5处，由目镜观察，此时可适当地缩小光圈，否则视野中只见光亮一片，难见到目的物，同时用粗调节器慢慢升起镜筒，直至物像出现后再用细调节器调节到物像清楚时为止，然后移动标本，认真观察标本各部位，找到合适的目的物，并将其移至视野中心，准备用高倍镜观察。3高倍镜观察将高倍镜转至正下方，在转换物镜时，需用眼睛在侧面观察，避免镜头与玻片相撞。如果高倍镜触及载玻片应立即停止旋动，说明原来低倍镜就没有调准焦距，目的物并没找到，要用低倍镜重调，如果调对了，换高倍镜时基本可以看到目的物，若有点模糊，用细调节器调就清晰可见。找到最适宜观察的部位后，将此部位移至视野中心，准备用油镜观察。4.油镜观察（1）用粗调节器将镜筒提起约2，将油镜转至正下方。（2）在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油，切勿加多。（3）从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在香柏油中，其镜头几乎与标本相接，应特别注意不能压在标本上，更不可用力过猛，否则不仅压碎玻片，也会损坏镜头。 （4）从接目镜内观察，进一步调节光线，使光线明亮，再用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野出现物像为止，然后用细调节器校正焦距。如油镜已离开油面而仍未见物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作至物像看清为止。切勿将粗调节器旋转方向搞反了，以免油镜头与载玻片相碰而损坏了镜头及玻片。（5）观察完毕，关闭电源，上旋镜筒。将物镜镜头转开，取下玻片，用擦镜纸拭去镜头上的油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留油迹，最后再用干净擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其他纸擦镜头，以免损坏镜头。用绸布擦净显微镜的金属部件。（6）将各部分还原，将接物镜转成八字形，再向下旋。同时把聚光镜降下，以免接物镜与聚光镜发生碰撞，反光镜垂直于镜座。五、实验报告1.细菌个体的基本形态有几种？分别是？2.分别绘制出你在低倍镜、高倍镜和油镜下观察到的细菌形态图。实验三 放线菌个体形态的观察一、目的要求掌握观察放线菌形态的基本方法，并观察放线菌的形态特征。二、基本原理放线菌在固体培养基上呈辐射状生长而得名。放线菌是由不同长短的纤细的菌丝所形成的单细胞菌丝体。菌丝体分为两部分，即潜入培养基中的营养菌丝（或称基内菌丝）和生长在培养基表面的气生菌丝。有些气生菌丝分化成各种孢子丝，呈螺旋形、波浪形或分枝状等。孢子常呈圆形、椭圆形或杆形。气生菌丝及孢子的形状和颜色常作为分类的重要依据。三、器材显微镜，载玻片，盖玻片，玻璃棒，接种铲，小刀，镊子，土样，石炭酸复红染液，吕氏碱性美蓝染液，加拿大树胶，玻璃纸，高氏1号培养基；培养皿等。四、操作步骤1放线菌自然生长状态的观察（1）将灭菌后的高氏1号培养基倒入培养皿，每皿倒15ml左右，凝固后备用。（2）用经火焰灭过菌的小镊子将灭菌优质玻璃纸平铺在平皿培养基上，如果琼脂培养基和玻璃纸之间有气泡，可以用灭过菌的玻璃棒将气泡除去。（3）将一定量的无菌水倒入装有土样的无菌玻璃珠瓶中，制成菌悬液，再适当稀释。（4）用无菌吸管取0.1ml的孢子悬液稀释液，接种在玻璃纸上，并用无菌玻璃棒涂匀后，置28培养，直至菌长好，备用。（5）在洁净的载玻片上滴一小滴水，稍涂布。取出培养皿，打开皿盖，用镊子将玻璃纸与培养基分开，再用剪刀剪取小片长有菌的玻璃纸，菌面朝上放在载玻片的水面上，使纸平贴载玻片。（6）将载玻片置显微镜下观察。附：玻璃纸灭菌方法：在玻璃纸灭菌时，若直接将干燥的玻璃纸灭菌，它就会缩小，不便使用。故需作如下处理：将玻璃纸和滤纸剪成培养皿大小的圆形纸片，用水浸泡后把湿滤纸和玻璃纸交互重叠地放在培养皿中，借滤将玻璃纸隔开。然后进行湿热灭菌，备用。2.营养菌丝的观察（1）用接种铲连同培养基挑取放线菌菌苔置载玻片中央。（2）用另一载玻片将其压碎，弃去培养基，制成涂片，干燥、固定。（3）用吕氏碱性美蓝染液或石炭酸复红染液染0.51分钟，水洗。（4）干燥后，用油镜观察营养菌丝的形态。3.气生菌丝与营养菌丝的比较观察（1）将高氏1号培养基倒入无菌培养皿，制成4左右的培养基平板，经培养检验后无菌，备用。（2）用火焰灭菌的镊子将无菌盖玻片以45度倾斜角插入平皿培养基琼脂内，然后将孢子悬液（浓度以稀释10-210-3为好），接种在盖玻片与平皿培养基的界面上。（3）倒置，于28培养45天后，小心地将盖玻片取出，把有菌的一面朝上，放在载玻片上，置显微镜下进行观察。一般情况是气生菌丝颜色较深，并比营养菌丝粗二倍左右。4.孢子丝及孢子的观察（1）将培养34天的放线菌培养皿打开，放在显微镜低倍镜下寻找菌落的边缘，直接观察气生菌丝和孢子丝的形态，注意其分枝情况、卷曲情况等。（2）取清洁的盖玻片一块，在菌落上面轻轻按压一下，然后将印有痕迹的一面朝下放在有一滴吕氏碱性美蓝染液的载玻片上，将孢子等印浸在染液中，制成印片。用油镜观察孢子的形状、孢子丝等。（3）取干净载玻片一块，在玻片中央加一小滴加拿大树胶，使树胶摊成一薄层，放置数分钟，使略微晾干（但不要过分干燥）。然后用小刀切取放线菌培养体一块（带培养基切下）。将培养体表面贴在涂有树胶的玻片上，用另一玻片轻轻按压（不要压碎），然后将放线菌培养体小心弃去，注意不要使培养体在玻片上滑动，否则印痕模糊不清。将制好的印片通过火焰固定，用石炭酸复红染色1分钟，水洗，晾干（不能用吸水纸吸干）。用油镜观察孢子丝的形态及孢子排列情况。五、实验报告1.绘图说明你所观察到的放线菌形态特征。2.在自然界和实际应用中放线菌有什么作用？实验四霉菌的个体形态观察一、目的要求掌握观察霉菌形态的基本方法，并观察其形态特征。二、基本原理霉菌菌丝较粗大，细胞易收缩变形，而且孢子很容易飞散，所以制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。此染色液制成的霉菌标本片其特点是（a）细胞不变形；(b)具有杀菌防腐作用，且不易干燥，能保持较长时间；（c）溶液本身呈蓝色，有一定染色效果。霉菌的菌丝、分生孢子梗和分生孢子的形态常作为分类的重要依据。三、器材曲霉（Aspergillus sp.），青霉 (Penicillium sp.)，根霉(Rhizopus sp.)，毛霉(Mucor sp.)；乳酸石炭酸棉蓝染色液，20%甘油，马丁氏（Martin）培养基平板或查氏培养基平板，无菌吸管，载玻片，盖玻片，U形棒，解剖刀，玻璃纸，滤纸等。四、操作步骤1一般观察法（1）将培养34天的霉菌培养皿打开，放在显微镜低倍镜下寻找菌落的边缘，直接观察菌丝，分生孢子梗和分生孢子。（2）于洁净载玻片上，滴一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从霉菌菌落的边缘外取少量带有孢子的菌丝置染色液中，再细心地将菌丝挑散开，然后小心地盖上盖玻片，注意不要产生气泡。置显微镜下先用低倍镜观察，必要时再换高倍镜。2载玻片观察法（1）将略小于培养皿底内径的滤纸放入皿内，再放上U形玻棒，其上放一洁净的载玻片，然后将二个盖玻片分别斜立在载玻片的两端，盖上皿盖，把数套（根据需要而定）如此装置的培养皿叠起，包扎好，用1.05/2，121.3灭菌20分钟，备用。（2）将67ml灭菌的马丁氏（Martin）琼脂培养基倒入直径为9的灭菌平皿中，待凝固后，用无菌解剖刀切成0.512的琼脂块，用刀尖铲起琼脂块放在已灭菌的培养皿内的载玻片上，每片上放置2块。（3）用灭菌的尖细接种针，取（肉眼方能看见的）一点霉菌孢子，轻轻点在琼脂块的边缘上，用无菌镊子夹着立在载玻片旁的盖玻片盖在琼脂块上，再盖上皿盖。（4）在培养皿的滤纸上，加无菌的20%甘油数毫升，至滤纸湿润即可停加，将培养皿置28培养一定时间后，取出载玻片置显微镜下观察。3.玻璃纸透析培养观察法（1）向霉菌斜面试管中加入5ml无菌水，洗下孢子，制成孢子悬液。（2）用无菌镊子将已灭菌的、直径与培养皿相同的圆形玻璃纸覆盖于查氏培养基平板上。（3）用1ml无菌吸管吸取0.2ml孢子悬液于上述玻璃纸平板上，并用无菌玻璃刮棒涂抹均匀。（4）置于28温室培养48小时后，取出培养皿，打开皿盖，用镊子将玻璃纸与培养基分开，再用剪刀取一小片玻璃纸置载玻片上，用显微镜观察。五、实验报告1.绘图说明你所观察到的霉菌形态特征。2.霉菌对人类生活和生产能产生哪些积极作用和消极作用？3.玻璃纸应怎样进行灭菌？为什么？实验五 酵母菌的个体形态观察一、目的要求1.观察酵母菌的细胞形态及出芽生殖方式。2.学习掌握区分酵母菌死、活细胞的染色方法。二、基本原理酵母菌是多形的、不运动的单细胞微生物，细胞核与细胞质已有明显的分化，菌体比细菌大。繁殖方式也较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖，仅裂殖酵母属是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本实验通过用美蓝染色浸片来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的，用它来对酵母的活细胞进行染色，由于细胞中新陈代谢的作用。使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色，而对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，用美蓝水浸片不仅可观察酵母的形态，还可以区分死、活细胞。三、器材酵母菌、0.1%吕氏碱性美蓝染液，显微镜，载玻片，盖玻片等。四、操作步骤1在载玻片中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染液，液滴不可过多或过少，以免盖上盖玻片时，溢出或留有气泡。然后按无菌操作法取在琼脂斜面上培养48小时的酵母菌少许，放在吕氏碱性美蓝染液中，使菌体与染液均匀混合。2用镊子夹盖玻片一块，小心地盖在液滴上。盖盖玻片时应注意，不能将盖玻片平放下去，应先将盖玻片的一边与液滴接触，然后将整个盖玻片慢慢放下，这样可以避免产生气泡。3将制好的水浸片放置3分钟后镜检。先用低倍镜观察，然后换用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况，同时可以根据是否染上颜色来区别死、活细胞。4染色半小时后，再观察一下死细胞数是否增加。5用0.05%吕氏碱性美蓝染液重复上述的操作。五、实验报告1.绘图说明你所观察到的酵母菌的细胞结构及出芽生殖方式。2.酵母菌在实际应用中有什么作用？ 实验六 原生动物和藻类个体形态的观察一、目的要求1进一步熟悉和掌握显微镜的操作方法2观察原生动物和藻类个体形态，掌握生物图的绘制方法二、基本原理1原生动物以细菌和颗粒状有机物或溶解性有机物为食，它对废水的净化起重要作用，原生动物易于通过显微镜观察和分辨，因而可作为指示生物，通过观察原生动物群落结构来评价水质污染程度。2借助显微镜观察藻类个体形态，通过实验了解藻类的特征，细胞等的构成，是藻类分类的重要依据。三、器材显微镜、原生动物装片、藻类装片、活性污泥混合液或各种水样；摄子、擦镜纸、吸水纸、玻璃小吸管、烧杯、载玻片、盖玻片等四、操作步骤1标本片的制作用压滴法制作原生动物标本片，取一片干净的载玻片放在实验台上，用一支滴管吸取活性污泥混合液或水样滴于载玻片的中央，用干净的盖玻片覆盖在液滴上（注意不要有气泡）即成标本片。2低倍镜观察将标本片置镜台上，用标本夹夹住，用粗调焦螺旋调焦后，再轻轻转动细调焦螺旋以便得到清晰的物像。如果观察的目标不在视野中央可调节标本移动器，使之位于视野中央，准备用高倍镜观察。3高倍镜观察用低倍镜调准焦距后，换高倍镜，若有点模糊，用细调节器调至清晰。4、观察原生动物的外形，行动器官等（见附注）5、观察藻类的外形，所含色素体和藻体形态构造等（见附注）。五、实验报告将你在显微镜下观察到的原生动物形态绘制成图，它属于哪一类（见本课教材和附注）？有何特征？六、附注（一）根据藻类所含的色素和植物体的形态与构造分成10门。1细胞具色素体；贮藏物质为淀粉或脂肪21细胞无色素体，色素分散在原生质中；贮藏物质以蓝藻淀粉为主蓝藻门（Cyanophyta） 2细胞壁由上、下两个硅质瓣壳套合组成；壳面具辐射对称或左右对称的花纹硅藻门（Bacillariophyta） 2细胞壁没有上、下两个硅质瓣壳组成33营养细胞或动孢子具横沟和纵沟或仅具纵沟43营养细胞或动孢子不具横沟和纵沟5 4无细胞壁或细胞壁由一定数目的板片组成甲藻门（Pyrrophyta）4无细胞壁或细胞壁不具板片隐藻门（Cryptophyta）5色素体为绿色，罕见灰色或无色；贮藏物质为淀粉或裸藻淀粉65色素体为红色、黄色、黄绿色，有时为淡绿色；贮藏物质为红藻淀粉、白糖素、脂肪或甘露醇8 6植物体大型，分枝，规则地分化成节和节间轮藻门（Charophyta） 6植物体为单细胞，群体的或多细胞的丝状体或叶状体，无节和节间的分化77植物体多为单细胞，少数为群体；运动细胞顶端具1、2或3条鞭毛；有时无色；贮藏物质为裸藻淀粉裸藻门（Euglenophyta）7植物体为单细胞的、群体的，丝状的或薄壁组织状的；运动的营养细胞或动孢子具2（少数属具4或8） 条等长的鞭毛；罕见无色的；贮藏物质为淀粉绿藻门（Chlorophyta） 8色素体为红色或有时为绿色；生活史的任何时期均无具鞭毛的细胞；贮藏物质为红藻淀粉红藻门（Rhodophyta） 8色素体不为红色；运动细胞或生殖细胞具2（罕见3）条不等长的鞭毛；贮藏物质为白糖素、油或甘露醇99色素体褐色；植物体常为大型的、丝状、壳状、叶状，有的具假根、假茎、假叶的分化；动孢子肾形，具2条侧生的鞭毛；贮藏物质为褐藻淀粉和甘露醇褐藻门（Phaeophyta）9色素体黄绿色、金褐色或淡黄色；植物体常为小型的，单细胞、群体或丝状；运动细胞具1、2或3条等长或不等长的鞭毛；贮藏物质为白糖素或油1010色素体金褐色或淡黄色；植物体通常为小型的、单细胞或群体；运动细胞具1条鞭毛或2条等长或不等长的鞭毛，罕见具3条鞭毛的；有些种类为变形虫状的金藻门（Chrysophyta）10色素体黄绿色；植物体为单细胞、群体或丝状；运动细胞具2条不等长的鞭毛；单细胞或群体种类细胞壁常由两瓣套合组成，丝状种类由两“H”字形节合成黄藻门（Xanthophyta）（二）根据原生动物行动器官的不同，可分为下列四类：（1）鞭毛虫类（Flagellata）：单细胞个体，具有一根或一根以上鞭毛作为行动工具。通常有卵圆形、椭圆形、杯形、双锥形及多角形等等。有单生的也有各种形态的群体生活的。常见种类有：聚屋滴虫（Oikomonas socialis）、尾波豆虫（Bodo caudatus）、跳侧滴虫（Pleuromonas jaculans）、领鞭毛虫（Choanoflagellate）。（2）肉足虫类（Sarcodina）：原生质体赤裸，没有加厚的表膜或壳，伪足可以从质体任何地方伸出。内外质分界明显，外质透明，内质泡状或颗粒状。没有固定的形状，靠体内原生质流动形成伪足捕食。个体大小可由几个微米到几百个微米。常见种类有变形虫（Amoeba）。（3）纤毛虫（Ciliata）：纤毛虫是原生动物中进化到高一级的类群，在结构上比较复杂。个体大小差异很大，最小的只有10m，最大的可达3，000m。纤毛的多少和分布的位置不同，或周生于表面或一部分生长着许多纤毛，靠纤毛有节奏地摆动而游泳。通常可分自由游动纤毛虫，着生型纤毛虫和下毛虫。自由游动的纤毛虫：游泳时常匍匐爬行在杂质中，常见的有斜管虫（Chilodonella）、漫游虫（Litonotus）、前管虫（Prorodon）、肾形虫（Colpoda）、草履虫（Paramecium）等。着生型纤毛虫：固着在其他生物及杂质上，常见种类有钟虫（Vorticella）、累枝虫（Epistylis）、盖纤虫（Opercularia）、聚缩虫（Zoothamnium）、独缩虫（Carchesium）等。下毛虫（Hypotrichida）：背面隆起，腹面扁平，纤毛融合成触毛，分布在腹面一定的地区，又分前触毛、腹触毛、臀触毛、尾触毛和缘触毛，用触毛支撑虫体，负有“足”的作用。观察触毛在虫体的分布可区别其种类。常见种类有肋楯纤虫（Aspidisca costata）、尖毛虫（Oxytricha）、棘尾虫（Stylonychia）、瘦尾虫（Uroleptus）等。（4）吸管虫（Suctorida）：纤毛仅在个体发育中自由生活的幼体阶段才有，成体阶段已退化，“口”变成了许多吸管状的触手，分布在全身或分布在身体的一部分。常见的有壳吸管虫（Acineta）、足吸管虫（Podophrya）和锤吸管虫（Tokophrya）。实验七 细菌的单染色法一、目的要求1学习细菌的染色技术和无菌操作技术。2巩固显微镜的使用方法。二、基本原理单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易与带负电荷的细菌结合而使细菌着色。例如，美蓝（亚甲蓝）实际上是氯化亚甲蓝盐（methylene blue chloride,缩写为MBC），它可被电离成正、负离子：MBC methylene blue+chloride-带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫（crystal violet）、碱性复红（basic fuchsin）、番红（又称沙黄，safranine）等。细菌体积小，较透明，如未经染色常不易识别，而经着色后，与背景形成鲜明的对比，易于在显微镜下进行观察。三、器材显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶，擦镜纸，生理盐水，玻璃铅笔，吸水纸，试管架，火柴，小烧杯，酒精瓶等；吕氏碱性染色液，石炭酸复红染色液；金黄色葡萄球菌菌种，枯草芽孢杆菌菌种。四、操作步骤1涂片 取两块干净的载玻片，各滴一小滴生理盐水于载玻片中央，严格按无菌操作程序（图1），分别挑取金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌于二载玻片的水滴中（每一种菌制一片），调匀并涂成薄膜。注意滴生理盐水时不宜过多，涂片必须均匀，挑取菌种时切勿将培养基挑破。 图1 无菌操作及制片过程2干燥 于室温中自然干燥。3固定 涂片面向上，于火焰上通过23次，使细胞质凝固，以固定细菌的形态，并使其不易脱落。但不能在火焰上烤，否则细菌菌体变形。4染色 放标本于水平位置，滴加染色液于涂片薄膜上，染色时间长短随不同染色液而定。吕氏碱性美蓝染色液约染23分钟，石炭酸复红染色液约染12分钟。5水洗 染色时间到后，用自来水冲洗，直至冲下之水无色时为止。注意冲洗水流不宜过急，过大，水由玻片上端流下，避免直接冲在涂片处。冲洗后，将标本晾干或用吹风机吹干，待完全干燥后才可置油镜下观察。6显微镜观察利用低倍镜、高倍镜和油镜观察细菌的个体形态。五、实验报告1绘出你所观察到的经单染色的两种细菌形态图。2根据实验体会，你认为制备染色标本时，应注意哪些事项？2制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？实验八细菌的革兰氏染色法一、目的要求1了解细菌革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的制片技术。2观察细菌的各种形态结构。3巩固课堂知识，增强感性认识。二、基本原理革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料(basic dye)初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。媒染剂的增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95%的酒精（ethanol）。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群。三、器材大肠杆菌菌种（1号菌种），枯草芽孢杆菌菌种（2号菌种）；革兰氏染色的四种染液，载玻片，显微镜，接种环，双层瓶，擦镜纸，生理盐水或无菌水，玻璃铅笔，吸水纸，火柴，小烧杯，酒精瓶，酒精灯，试管架，摄子等。四、操作步骤1涂片前在载玻片上做标记。2涂片本实验采用“三区”涂片法。在载玻片的左右两端，各加1滴水，严格按无菌操作程序，用无菌接种环挑取少量1号菌种与左边水滴充分混合成仅有1号菌的区域，并将少量菌液由左向右延伸至玻片的中央，把接种环上残留的菌烧掉。再用无菌的接种环挑取少量2号菌种与右边水滴充分混合成仅有2号菌的区域，并将少量菌液由右向左延伸至玻片的中央，使1号菌和2号菌在玻片的中央混合成含有两种菌的混合区。3干燥和固定涂片自然干燥后，手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，玻片在微火上通过34次（用手指触涂片反面，以不烫手为宜），待冷却后再加染液。（注意涂片不可过于浓厚）4染色（1）初染 加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。（2）媒染 滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。（3）脱色 将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约2030秒钟，立即用水冲净酒精。（4）复染 用番红液染12分钟，水洗。（5）镜检 干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。五、实验报告1在你所作的革兰氏染色制片中，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌各染成何色？它们是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌？图示菌体形态。2作革兰氏染色涂片时为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？3当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？实验九 显微镜直接计数法一、目的要求1明确显微镜计数的原理。2学习使用血球计数板进行微生物计数的方法。二、基本原理利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法的优点是直观、快速。将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的（0.13），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。（图2） 图2 血球计数板的结构图 A.正面图 B.侧面图计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，共400小格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格，总共也是400小格。所以无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的。每一个大方格边长为1，则每一大方格的面积为12，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1，所以计数室的容积为0.13。其计算方法如下：11625的计数板计算公式细胞数 ml=(100小格内的细胞数 100)4001000稀释倍数22516的计数板计算公式细胞数 ml=(80小格内的细胞数 80)4001000稀释倍数三、器材酵母菌悬液，血球计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管等。四、操作步骤1稀释将酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。2镜检计数室在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗后才能进行计数。3加样品将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），使菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。静置510分钟即可计数。4显微镜计数将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有510个菌体为宜。若选用2516规格的计数板则每个计数室选5个中方格，可选4个角和中央的中格（即80个小格），若选用1625规格的计数板，则数四个角：左上、右上、左下、右下的四个中方格，（即100小格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。5清洗血球计数板使用完毕后，将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其化沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。五、实验报告1将结果记录于下表中。A表示五个中方格中的总菌数；B表示菌液稀释倍数。 各中格中菌数AB菌数/ml二室平均值12345第一室第二室2为什么用两种不同规格的计数板测同一样品时，其结果一样？实验十微生物大小的测量一、目的要求掌握用显微测微尺测量微生物大小的基本方法。二、基本原理微生物细胞大小，是微生物的形态特征之一，也是分类鉴定的依据之一。由于菌体很小，只能在显微镜下测量。用来测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺（图3）和镜台测微尺（图4）。镜台测微尺（图4）是中央部分刻有精确等分线的载玻片。一般将1等分为100格（2等分为200格），每格长度等于0.01（即10m）。是专用于校正目镜测微尺每格长度的。图3 目镜测微尺A目镜测微尺；A 旋开接目镜透镜，放入目镜测微尺；B 将接目镜插回镜筒目镜测微尺（图3，A）是一块可放在接目镜内的隔板上的圆形小玻片，其中央刻有精确的刻度，有等分50小格或100小格两种，每5小格间有一长线相隔。由于所用接目镜放大倍数和接物镜放大倍数的不同，目镜测微尺每小格所代表的实际长度也就不同，因此，目镜测微尺不能直接用来测量微生物的大小，在使用前必须用镜台测微尺进行校正，以求得在一定放大倍数的接目镜和接物镜下该目镜测微尺每小格的相对值，然后才可用来测量微生物的大小。三、器材枯草芽孢杆菌染色玻片标本，目镜测微尺，镜台测微尺，显微镜，擦镜纸，香柏油二甲苯等。四、操作步骤1目镜测微尺的标定（1）放置目镜测微尺 取出接目镜，旋开接目镜透镜，将目镜测微尺的刻度朝下放在接目镜筒内的隔板上（图3，B），然后旋上接目透镜，最后将此接目镜插入镜筒内（图3，C）。图4 目测微尺和镜台测微尺目镜测微尺镜台测微尺镜台测微尺的中心部放大镜台测微尺标实目镜测微尺时两者重叠A.目镜测微尺 B.镜台测微尺（2）放置镜台测微尺 将镜台测微尺置于显微镜的载物台上，使刻度面朝上。（3）校正目镜测微尺 先用低倍镜观察，对准焦距，当看清镜台测微尺后，转动接目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使目镜测微尺和镜台测微尺的某一区间的两对刻度线完全重合，然后计数出两对重合线之间各自所占的格数。例如实验图4中A(目镜测微尺)上5格对准B镜台测微尺上的2格，B的1格为10m,2格的长度为20m,所以目镜测微尺上1小格的长度为4m 。根据计数得到的目镜测微尺和镜台测微尺重合线之间各自所占的格数，通过如下公式换算出目镜测微尺每小格所代表的实际长度。两对重合线间镜台测微尺格数10两对重合线间目镜测微尺格数目镜测微尺每小格长度（m）=2105=4m 同法校正在高倍镜和油镜下目镜测微尺每小格所代表的