硒化壳寡糖的合成及抗氧化性研究.doc

大连民族学院2011届生物工程专业本科毕业论文摘 要【目的】以亚硒酸钠和壳寡糖为原料，合成硒化壳寡糖，并对其进行表征以及对其抗氧化活性性进行研究。【方法】硒化壳寡糖的合成，采取化学方法，以亚硒酸钠和壳寡糖为原料进行。通过紫外及红外对合成的硒化壳寡糖进行表征。硒化壳寡糖的抗氧化活性通过邻二氮菲-氧化法，邻苯三酚自氧化法，以及总抗氧化能力试剂盒进行测定。【结果】成功制备了硒化壳寡糖产品，紫外和红外光谱结果表明，合成的硒化壳寡糖产品成功在壳寡糖中引入了硒；两种方法测的硒化壳寡糖中硒含量分别为9.02mg/ml和8.82mg/ml；对壳寡糖和硒化壳寡糖的抗氧化能力测定结果显示壳寡糖和硒化壳寡糖具有明显的抗氧化能力且硒化壳寡糖抗氧化能力高于壳寡糖。【结论】本实验证实以亚硒酸钠和壳寡糖能够成功合成硒化壳寡糖，且合成的硒化壳寡糖比壳寡糖具有更好的抗氧化能力，为研究低毒性、有效的有机补硒产品提供了思路。关键词：硒化壳寡糖；硒含量；抗氧化Study on Antioxidant Activity of Chitooligosaccharide -Se4+ Abstract【Objective】 We use sodium selenite and Chitooligosaccharide as raw materials to synthesis Chitooligosaccharide-Se4+ and study it on its characterization and antioxidant activity.【Method】Sodium selenite and Chitooligosaccharide are used to synthesis Chitooligosaccharide- Se4+ in this experiment by chemical method. It was characterizde by ultraviolet and infrared method. Its antioxidant activity was studied by phenanthroline - Fe oxidation, pyrogallol autoxidation,and T-AOC kit.【Results】The UV spectrum and FTIR showed that the synthesis Chitooligosaccharide- Se4+ is successful. The two methods showed that the content of Selenium in Chitooligosaccharide- Se4+ were 9.02mg/ml and 8.82mg/ml.The results of study on antioxidant activity of Chitooligosaccharide-Se4+ showed that both Chitooligosaccharide and Chitooligosaccharide -Se4+ have antioxidant activity and Chitooligosaccharide-Se4+ presented higher antioxidant activity than Chitooligosaccharide.【Conclusion】This expetiment presented that Chitooligosaccharide-Se4+ can be prepared successfully ,and whats more it has higher antioxidant activity than Chitooligosaccharide.This can lead us to study more low toxicity and effective products witch can provide the idea of organicselenium. Keywords:Chitooligosaccharide-Se4+;Selenium content ;Antioxidant activity 目 录摘 要IAbstractII引 言- 1 -1 综述- 2 -1.1壳寡糖简介- 2 -1.1.1壳寡糖的理化性质- 2 -1.1.2壳寡糖的主要功能- 2 -1.1.3壳寡糖的应用- 3 -1.2 硒简介- 4 -1.2.1硒- 4 -1.2.2硒的功能与作用- 4 -1.2.3硒产品的的开发及应用- 5 -1.3自由基简介- 5 -1.3.1自由基的产生- 5 -1.3.2自由基的危害- 6 -1.4研究意义- 6 -2 硒化壳寡糖的制备与表征- 8 -2.1硒化壳寡糖的制备- 8 -2.1.1 实验仪器- 8 -2.1.2 实验试剂- 8 -2.1.3实验方法- 8 -2.2结果与讨论- 9 -2.2.1制备结果- 9 -2.2.2 紫外光谱测定分析- 9 -2.2.3 红外光谱测定分析- 10 -3硒含量的测定- 12 -3.1实验仪器与试剂- 12 -3.1.1实验仪器- 12 -3.1.2实验试剂- 12 -3.2邻苯二胺比色法16- 12 -3.2.1溶液的配制- 12 -3.2.2实验步骤- 13 -3.2.3实验结果与分析- 13 -3.3 3，3-二氨基联苯胺测定法17- 14 -3.3.1溶液配制- 14 -3.3.2硒标准曲线的绘制- 14 -3.3.3 样品的测定- 14 -3.3.4结果与分析- 14 -4硒化壳寡糖的抗氧化性能力测定- 16 -4.1 实验仪器与试剂- 16 -4.1.1 实验仪器- 16 -4.1.2 实验试剂- 16 -4.2邻苯三酚自氧化法- 16 -4.2.1溶液的配制- 16 -4.2.2实验步骤- 17 -4.2.3实验结果与分析- 17 -4.3邻二氮菲Fe2氧化法- 19 -4.3.1溶液的配制- 19 -4.3.2实验步骤- 19 -4.3.3实验结果与分析- 20 -4.4总抗氧化能力测定试剂盒测定法- 22 -4.4.1样品溶液的配制- 22 -4.4.2实验方法- 22 -4.4.3 实验结果与分析- 23 -结 论- 24 -参考文献- 25 -致 谢- 26 -III引 言癌症，因其高发病率和高病死率而为世人所知，世卫组织（WHO）将其与心脑血管疾病和意外事故并列为人类三大死亡原因。有科学研究表明，癌症致患者死亡的主要原因，是癌转移。另有研究指出，活性氧化物在癌转移中发挥重要作用，因此通过抑制活性氧化物的积累，能够有效抑制癌转移。事实上，临床上的许多抗癌药物也正是基于此而研发的。壳寡糖是壳聚糖的单体，相对于壳聚糖而言，壳寡糖具有相对分子量小，可溶性高，生物活性高等优点。近年来，对壳寡糖的研究证实壳寡糖在提高人体免疫力，抗癌，降低血压、血脂、血糖，促进钙以及其他微量元素吸收等方面有显著的功效。硒是人体所必需的微量元素之一，由于其本身具有极高的抗氧化能力，因此它在延缓衰老，抗癌，增强人体免疫力等方面具有明显的功效，甚至被人赞誉为“抗癌之王”。但是，大多数无机硒化合物毒性比较大，最低致死量相对较小，因此应用受到极大的限制。所以，寻找生物活性相对较高且毒性相对较低的有机硒替代品就成为给机体补硒的首要任务。目前已有研究表明，有机硒多糖作为补硒剂不仅稳定性好，溶出性高，而且释放出硒后配体，配体多糖不会对机体产生毒副作用，是理想的补硒产品。本实验则是正是在此基础上进行的进一步研究，以多糖的单体寡糖与硒配合，合成的硒化壳寡糖与有机硒多糖相比，具有更高的抗氧化活性，为进一步研究活性更高，稳定性更好的有机硒产品提供了思路和依据。1 综述1.1壳寡糖简介 壳寡糖也叫壳聚寡糖，也称几丁寡糖，学名-1，4- 寡糖-葡萄糖胺，是壳聚糖经降解后形成的低聚寡糖1。1.1.1壳寡糖的理化性质根据脱乙酰度的不同，壳寡糖可以呈现出白色、淡黄色、黄色、黄褐色等不同颜色，相比于壳聚糖而言，壳寡糖具有更好的水溶性，溶于水呈弱碱性。而且更容易被机体吸收。1.1.2壳寡糖的主要功能 壳寡糖具有很多生物活性，如提高机体免疫力2,3，改善肠道微生物区系分布，刺激有益菌生长4等，总的来讲有如下几大方面的功能：（1）免疫调节壳寡糖进入人体后，形成阳离子基团，与人体形成亲和，进而通过体液、细胞和非特异性免疫三大免疫系统调节人体免疫力。另外，壳寡糖还能促进免疫细胞分化，从而改善人体的免疫能力。壳寡糖对自由基具有明显的清除能力，能够有效的清除人体内的各种自由基，从而起到延缓衰老，减肥，抗癌等功效。（2）调节血脂由于壳寡糖进入人体后会形成阳离子基团，而脂肪是带有阴离子的基团，壳寡糖可以通过阴阳离子的相互作用，与脂肪结合，排出体外，进而起到调节血脂的作用。（3）调节血压现代医学表明高血压很大程度上由于食用盐中的氯离子引起的，而壳寡糖可以凭借其阳离子的特性与带有负电荷的氯离子结合，进而排出体外。从而改善血液微循环，起到调节血压的作用。（4）强化肝脏功能壳寡糖对于肝脏的强化功能，基于其强大的吸附作用。众所周知，刚脏是人体内排毒的重要器官，而壳寡糖由于具有极其强大的吸附能力，因此可以可以吸附体内的重金属一起其他有害毒素，排出体外，进而减少这些毒素对肝脏的损伤。同时，壳寡糖还能修复受损肝细胞，并且能够诱导其产生肝炎病毒抗体，从而预防肝炎的发生。（5）防治糖尿病壳寡糖是动物性膳食纤维，可以减缓糖尿病人对糖的吸收，增强胰岛功能，促进胰岛素的产生与分泌，从而提高机体的降糖能力。因此具有防治糖尿病的功效。（6）抗癌作用壳寡糖因其显著的抗氧化作用，能够有效清除体内自由基，减少自由基对体内细胞的攻击，降低细胞癌变的可能性。此外，壳寡糖强大的吸附作用与抗氧化作用共同作用，可以有效的抑制癌变细胞的转移，因此具有明显的抗癌作用。（7）排毒、养颜、祛斑壳寡糖的可以吸附体内重金属及其他毒素，并且促进其排出体外，从而能够起到很好的排毒、养颜以及祛斑功效。壳寡糖的保健功效，已经被医学界和学术界认识和承认，并且被中华预防医学会和微生态学会分会却认为有待开发研究的新益生元。1.1.3壳寡糖的应用 近年来壳寡糖因其水溶性高等优点，作为壳聚糖的替代品在化工、环保、食品、医药、化妆品、农业等领域得到越来越广泛的应用5。（1）精细化工领域壳寡糖由于来源于生物提取物，其特殊的分子结构，决定了它具有优良的保湿增湿功能，而且它还具有除菌作用，能够活化皮肤，因此在美容、护肤品、化妆、抗衰老等精细化工领域有着广泛的应用。（2）生物医药领域壳寡糖有效的抗氧化作用，强大的吸附能力都是抗癌药物的理想特点，因此壳寡糖被广泛应用于抗肿瘤药物的生产与临床使用中。此外，壳寡糖还在降血压、血糖、血脂以及保护肝脏等方面具有独特的功效因此也被应用于这些方面的临床药物及保健药物的生产。（3）保健食品领域壳寡糖因具有调节机体免疫力的功效，且具有易被机体吸收，无残留、无毒副作用的优良特点，被广泛应用于保健食品药品领域。（4）农林畜牧领域科学研究表明，壳寡糖具有明显的抗病虫害作用，而且安全、微量、高效、无残留等优点。以壳寡糖为基础的生物农药有着广阔的发展空间。1.2 硒简介1.2.1硒硒(Se)是一种有灰色金属光泽的固体化学物质。在空气中燃烧发出蓝色火焰，生成二氧化硒（SeO2）。也能直接与各种金属和非金属反应，包括氢和卤素。不能与非氧化性的酸作用，但它溶于浓硫酸、硝酸和强碱中。溶于水的硒化氢能使许多重金属离子沉淀成为微粒的硒化物。硒是人、动物和微生物的必需营养元素。国内外大量资料表明, 环境缺硒严重影响人和动物的健康。硒被科学家称之为人体微量元素中的“抗癌之王” 。硒有很强的抗氧化性，正是由于这一特点，使得硒具有抗辐射，抗衰老的作用6，同时，硒还具有保护心血管和抗肿瘤的作用。对甲状腺激素的调节作用;维持正常免疫功能;抗艾滋病作用;维持正常生育功能。1.2.2硒的功能与作用近年来医学领域的大量研究证实，许多疾病的发生与硒的摄入量偏低有关，适量补硒可以提高人体对某些疾病的抵御能力7。（1）抗癌作用硒被科学家称之为人体微量元素中的“抗癌之王”8。大量研究表明，人的血液中硒含量水平的高低与癌的发生息息相关，一个地区食物和土壤中硒含量的高低与癌症的发病率有直接关系，如果该地区的食物和土壤中的硒含量高，癌症的发病率和死亡率就低，反之，这个地区的癌症发病率和死亡率就高。（2） 防止克山病、大骨节病、关节炎。缺硒是克山病、大骨节病、两种地方性疾病的主要病因，补硒能防止骨髓端病变，促进修复，而在蛋白质合成中促进二硫键对抗金属元素解毒。对这两种地方性疾病和关节炎患者都有很好的预防和治疗作用9.10。（3） 解毒、排毒 硒与金属的结合力很强，能抵抗镉对肾、生殖腺和中枢神经的毒害。硒与体内的汞、锡、铊、铅等重金属结合，形成金属硒蛋白复合而解毒、排毒11。（4）防止糖尿病 硒是构成谷胱甘肽过氧化物酶的活性成分，它能防止胰岛细胞氧化破坏，使其功能正常，促进糖份代谢、降低血糖和尿糖，改善糖尿病患者的症状。（5） 防治肝病、保护肝脏 中国医学专家于树玉历经16 年的肝癌高发区流行病学调查中发现，肝癌高发区的居民血液中的硒含量均低于肝癌低发区，肝癌的发病率与血硒水平呈负相关，在江苏启东县居民中进行补硒预防癌症试验补硒可使肝癌发生比例下降，使有肝癌家史者发病率下降 。（6）防止白内障 硒可保护视网膜，增强玻璃体的光洁度，提高视力，有防止白内障的作用。 （7）防止心脑血管疾病 人体血硒水平的降低，会导致体内清除自由基的功能减退，造成有害物质沉积增多，血压升高、血管壁变厚、血管弹性降低、血流速度变慢，送氧功能下降，从而诱发心脑血管疾病的发病率升高，然而科学补硒对预防心脑血管疾病、高血压、动脉硬化等都有较好的作用。 1.2.3硒产品的的开发及应用 近年来富硒产品被大量开发应用，主要为在富硒茶、富硒矿泉水、富硒畜禽产品、富硒农产品、富硒烟。此外，还有富硒中草药（绞股蓝、黄芪、西洋参、灵芝、丹参，枸杞、天麻等等）、富硒食用菌、富硒麦芽、豆芽、富硒酵母、富硒蜂蜜等产品的报道12。1.3自由基简介自由基（free radical），化学上也称为“游离基”，是外层轨道上有不成对电子的原子、原子团或分子的总称。其中95%以上是氧自由基,也称为活性氧,是指机体内或者自然环境中由氧组成且性质活泼的物质。主要有超氧阴离子自由基、羟自由基(OH) 、脂质自由基(LO,LOO)和氮氧自由基(NO)等13。1.3.1自由基的产生人体内自由基的产生有两种途径,分别是内源性和外源性产生,例如电离辐射、环境污染、创伤、吸烟、吸毒等外界因素都会使生物体内产生外源性自由基。内源性自由基的产生归咎于体内代谢和酶促反应,如吞噬细胞系统、线粒体和微粒体电子传导系统、脂质过氧化过程等。 人体在呼吸代谢过程中不断的消耗氧,产生自由基,与此同时往往发生酶促氧化还原反应产生O-2。例如,在黄嘌呤氧化酶的催化下,黄嘌呤可通过将单电子给予O-2的方式氧化为尿酸,生成O-2黄嘌呤氧化酶。黄嘌呤+ 2O2 +H2O尿酸+ 2O-2+ 2H+一些蛋白质如血红蛋白,低分子化合物如核黄素、肾上腺素、辅酶自动氧化也可以产生O-2。血红蛋白自动氧化时,首先形成的是氧合血红蛋白,然后1个电子从Fe2+ 转移到O2 ,低铁血红蛋白变为高铁血红蛋白,O2变为O-2:HbFe2 + +O2 HbFe2+ O2 HbFe3+ +O-2此外,机体在有氧代谢过程中产生的O-2会进一步生成具有高度化学反应活性的羟自由基HO单线态1O2、过氧化氢(H2O2 )。1.3.2自由基的危害自由基在生物体内广泛存在，并参与各种生物氧化反应，在多数情况下，对机体产生损伤作用。其对机体的损伤，源于自身的高度氧化活性。研究证实，自由基是人体疾病、衰老和死亡的直接参与和制造者。尤其可怕的是，自由基若入侵细胞核，会破坏DNA使基因产生突变，从而引起多种疾病，如心脏病、老年痴呆症、帕金森病和肿瘤。自由基更是癌症、老化的元凶。（1）加速衰老自由基衰老理论认为，衰老来自机体正常代谢过程中产生自由基随机而破坏性的作用结果14，由自由基引起机体衰老的主要机制可以概括为以下的三个方面： 生命大分子的交联聚合和指褐素的累积、器官组织细胞的破坏与减少以及免疫功能的降低。（2）诱发癌症自由基引起的脂质过氧化产物不但能致癌还能致突变，这两者在分子水平上的机理是相同的。在化疗过程中，由于药物的毒性导致细胞内产生大量的自由基这往往会引起骨髓损伤、白血球减少，致使化疗减慢、药量减少或被迫停止化疗。若使用自由基清除剂，则可防止骨髓进一步受氧自由基的破坏，加速骨髓和白血球量的恢复，有利于化疗的继续。（3）引发眼疾科学研究表明老年性眼睛衰老(特别是白内障)与自由基反应有关。老年人由于全身机体的衰老使得眼球晶状中自由基清除剂的含量与活性降低，导致对自由基侵害的抵御能力下降。事实表明，白内障的起因和发展与自由基对视网膜的损伤导致晶状体组织的破坏有关。 此外，自由基还与炎症过程、肺气肿以及缺血后重灌流损伤等疾病的发生有关。1.4研究意义众多研究证实，癌症与体内自由基的产生、积累不无关系。自由基本身的强氧化能力很大程度上是诱发癌变的罪魁祸首，抗癌药物研发的一种思路就是通过抗氧化剂来清除体内的自由基，从而达到抗癌目的。硒和壳寡糖都具有一定抗氧化活性。硒作为人体必需的一种微量元素，在增强人体免疫力，抗癌方面具有实际应用价值。但是，大多数无机补硒剂毒性相对较大，最低致死量相对较小，也使得其应用受到局限。已有文献报道成功合成有机硒多糖样品，并且证实了，有机硒多糖作为补硒剂，不仅具有极好的抗氧化能力，而且毒性较低，释放出硒后，配体多糖并不会对机体产生毒副作用，是较为理想的补硒产品。壳寡糖作为壳聚糖的单体，首先在理化性质上有着比壳聚糖更为明显的优点，例如溶解性高于壳聚糖，抗氧化能力强等。如果合成硒化壳寡糖产品，并研究其基本性质，将会对寻找更加合适的有机硒产品起到良好的促进作用。2 硒化壳寡糖的制备与表征2.1硒化壳寡糖的制备2.1.1 实验仪器JY3003 电子分析天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司SHB-循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司UV-2450紫外可见分光光度计 SHIMADZU CORPORATION傅立叶变换红外光谱仪 上海精密科学仪器有限公司2.1.2 实验试剂亚硒酸钠98%，分析纯 上海华亭化工有限公司壳寡糖样品 大连民族学院实验室无水乙醇，分析纯 沈阳新兴试剂厂冰乙酸，分析纯 天津科密欧化学试剂有限公司2.1.3实验方法（1） 硒化壳寡糖的制备依据徐春兰等介绍的方法进行制备15。准确称取壳寡糖1.0g,溶于49mL的去离子水中，加入1ml冰乙酸，搅拌溶解至澄清。取亚硒酸钠1.33g，溶于10mL的水中，缓慢加入到壳寡糖溶液中。搅拌混匀以后放置2h，使其充分反应。加入三倍体积的无水乙醇，室温条件下过夜醇析。抽滤，并用无水乙醇洗涤两次，晾干即得硒化壳寡糖样品。（2）紫外光谱法测定将壳寡糖和硒化壳寡糖用去离子水配成0.04mg/ml的溶液，用去离子水为参比，在紫外分光光度仪下进行紫外光谱测定，波长扫描范围为190400nm。（3）红外光谱测定将少量的壳寡糖和硒化壳寡糖用KBr压片，在红外光谱仪下进行红外吸收光谱测定，测定范围为5004000cm-1。2.2结果与讨论2.2.1制备结果经测定，实验最后制得的硒化壳寡糖样品质量为0.873g，计算的产率为37.26%。2.2.2 紫外光谱测定分析壳寡糖和硒化壳寡糖的紫外光谱分析结果见图2.1：吸 收 值图 2.1 壳寡糖和硒化壳寡糖的紫外吸收光谱图如图所示，上方为硒化壳寡糖紫外吸收光谱，下方为壳寡糖紫外吸收光谱。通过光谱比较我们可以发现，硒化壳寡糖与壳寡糖相比吸光值在200225nm处下降趋势更为明显，且在300nm左右出现一个明显的吸收峰。从而表明在壳寡糖中成功引入了亚硒酸根。2.2.3 红外光谱测定分析壳寡糖和硒化壳寡糖的红外光谱分析结果如下图（图2.2,2.3,2.4）所示：图 2.2 壳寡糖红外光谱图图 2.3 硒化壳寡糖红外光谱图图 2.4 壳寡糖与硒化壳寡糖红外光谱对比从壳寡糖与硒化壳寡糖的红外光谱图的对比中可以看出，亚硒酸根主要连接在位的氨基和的羟基上。主要由以下光谱图形和光谱数据变化得到证明：硒化后壳寡糖的氨基（）的剪式振动吸收峰由1627.92移动到1629.85；壳寡糖分子中的羟基（）的变角振动吸收峰由1033.85移动到1035.77；此外，在硒化壳寡糖的红外光谱中观测到位于806.25的Se=O双键振动峰。据此推断，合成的硒化壳寡糖可能在位的氨基和的羟基上引入了亚硒酸根。3硒含量的测定3.1实验仪器与试剂3.1.1实验仪器BA210S 型 电子分析天平 北京赛多利斯天平有限公司DKZ系列电热恒温振荡水槽 上海一恒科学仪器有限公司Seven Easy型PH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司UV-2100型分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司3.1.2实验试剂邻苯二胺盐酸盐，分析纯 Aladdin chemistry co.Ltd硒粉，分析纯 Aladdin chemistry co.Ltd盐酸，分析纯 沈阳市华东试剂厂NaOH，分析纯 天津市科密欧化学试剂有限公司硝酸 ，分析纯 沈阳市华东试剂厂3,3-二氨基联苯胺，分析纯 Aladdin chemistry co.Ltd甲苯 ，分析纯 北京化工厂EDTA-2Na（乙二胺四乙酸二钠）,分析纯 天津市科密欧化学试剂有限公司硒化壳寡糖样品 实验室制得3.2邻苯二胺比色法163.2.1溶液的配制（1）1%的邻苯二胺溶液：准确称取0.500g邻苯二胺，用去离子水定容至50ml；（2）1：1HCl溶液：取50ml的浓HCl与50ml的去离子水混匀；（3）10%硝酸：取10ml浓硝酸于100ml容量瓶中，加水定容；（4）硒标准溶液（4g/ml）:准确称取0.100g硒粉置于具塞试管中，加入5ml的浓硝酸使硒粉溶解，然后转入100ml的容量瓶中，用10%的硝酸溶液定容，此即为贮备液。取0.4ml贮备液加水定容至100ml,得4g/ml的硒标准溶液。3.2.2实验步骤（1）硒标准曲线的绘制取7个具塞的玻璃瓶，编号为07。分别取0，1，2，3，4，5，6的硒标准溶液于玻璃瓶中，加去离子水至24ml。用1：1HCl调其PH为2左右，再加入2ml1%的邻苯二胺溶液，振荡，放置黑暗处一个小时。一个小时后取出，加入10ml甲苯，振荡30s，静置10分钟后取甲苯萃取层（上层），于335nm波长处测其吸光值，并以甲苯为参比。（2）样品溶液的测定称取0.010g硒化壳寡糖，溶于50ml水中，配制成0.2mg/ml的样品溶液。从上述样品溶液中取出1ml置于玻璃瓶中，加水至25ml,其后的操作同硒标准曲线绘制相同，测其吸光值A1。3.2.3实验结果与分析硒标准曲线的绘制，各浓度的吸光值如表3.1所示：甲苯吸光值A0：0.043表3.1 不同硒标准溶液含量的吸光值管号0123456硒含量0102030455060吸光值A0.0450.1290.1990.3120.3820.4550.554A- A00.0020.0860.1560.2690.3390.4120.511图 3.1 硒标准曲线实验测得硒化壳寡糖样品吸光值为：0.890，计算得出该样品中硒含量为9.02mg/g。3.3 3，3-二氨基联苯胺测定法173.3.1溶液配制（1）10% NaOH：称取10g片状NaOH固体于烧杯中，加入少量水溶解，转入100ml容量瓶中，定容；（2）1：1HCl：取50ml浓盐酸，加水定容到100ml即可；（3）0.5%3,3-二氨基联苯胺：准确称取0.250g3,3-二氨基联苯胺于50ml容量瓶中，用1：1HCl定容；（4）1g/ml的硒标准溶液：称0.100g硒粉于具塞试管中，加入2ml浓硝酸中使硒粉溶解，转入100ml容量瓶中用1：1HCl定容,得1mg/ml的硒溶液。再取上述溶液50l于50ml容量瓶中，加去离子水定容，得硒标准液（1g/ml）；(5)5%的EDTA-2Na溶液：取5g EDTA-2Na于100ml容量瓶中，加水定容。3.3.2硒标准曲线的绘制取6个100ml带塞的玻璃瓶，编号为16。分别加入硒标准溶液0ml,1ml,2ml,4ml,6ml和8ml。加水稀释至25ml。再分别加入5%的EDTA-2Na溶液1ml，用1：1盐酸调PH至23；调好PH后，加入0.5%3,3-二氨基联苯胺4ml，摇匀后在暗处放置20min。再用10%的10% NaOH调至中性，然后加入10ml的甲苯振荡2分钟，静置10分钟。取甲苯萃取层在波长为420nm处测吸光值A，并以甲苯为空白对照A0。以硒含量为横坐标，以A- A0为纵坐标绘制硒标准曲线。3.3.3 样品的测定取0.010g壳寡糖样品于50ml容量瓶中，加水溶解并定容，得0.2mg/ml的样品溶液。从中取出1ml放入玻璃瓶中，加水稀释到25ml。其余操作同硒标准溶液的处理，在420nm波长处，测吸光值。3.3.4结果与分析甲苯吸光度A0为0.043表3. 2各浓度硒标准溶液吸光值管号012345硒含量（mg/g）02.55101520吸光值A0.0440.0560.0640.0840.1030.125A-A00.0010.0130.0210.0410.0600.082图 3.2 硒标准曲线实验测得硒化壳寡糖样品吸光值为0.487，计算得出硒含量约为8.82mg/g。与联苯二铵法测得的硒含量9.02mg/ml相差不大。4硒化壳寡糖的抗氧化性能力测定 壳聚糖及其衍生物具有明显的抗氧化作用18，我们推测合成的硒化壳寡糖具有相应的抗氧化活性。测定方法参考除春兰,钦传光等的方法19。4.1 实验仪器与试剂4.1.1 实验仪器BA210S 型 电子分析天平 北京赛多利斯天平有限公司DKZ系列电热恒温振荡水槽 上海一恒科学仪器有限公司Seven Easy型PH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司UV-2100型分光光度计 尼柯（上海）仪器有限公司4.1.2 实验试剂邻苯三酚 国药集团化学试剂有限公司浓盐酸，分析纯 沈阳市华东试剂厂Tris base30%H2O2，分析纯 天津市科密欧化学试剂有限公司邻二氮菲，分析纯 天津市科密欧化学试剂有限公司无水乙醇，分析纯 沈阳新兴试剂厂FeSO4，分析纯 天津市双船化学试剂厂Na2HPO4，分析纯 天津市科密欧化学试剂有限公司NaH2PO4，分析纯 天津市科密欧化学试剂有限公司抗坏血酸（VC），分析纯 沈阳新兴试剂厂总抗氧化能力试剂盒4.2邻苯三酚自氧化法4.2.1溶液的配制(1)10mmol/lHCl：用移液枪取83L浓盐酸，定容到100ml；(2)1.5mol/l PH为8.2的Tris-HCl：称取9.083g Tris base，用去离子水定容到50ml，然后用浓盐酸调PH为8.2即可；(3)2.5mmol/l邻苯三酚：准取称取0.0315g邻苯三酚，用（1）中所配的10mmol/lHCl定容到100ml；(4)壳寡糖样品溶液的配制：称取壳寡糖0.050g于100ml容量瓶中，定容得1mg/ml的样品溶液。分别取上述溶液10ml，5ml，2.5ml，1.25ml稀释到20ml,得0.25mg/ml，0.125mg/ml，0.0625mg/ml和0.0313mg/ml的壳寡糖样品溶液。(5硒化壳寡糖的配制：准确称取硒化壳寡糖0.100g，用去离子水定容至100ml，得浓度为1mg/ml的样品溶液。梯度稀释，方法同壳寡糖，制得浓度分别为0.50mg/ml，0.25mg/ml，0.125mg/ml，0.0625mg/ml的稀释液。(6)10mmol/ml抗坏血酸（Vc）样品溶液的配制：准确称取0.176g抗坏血酸，加水定容至100ml，得10mmol/ml的Vc样品溶液。分别取上述溶液10ml，5ml，2.5ml，1.25ml稀释到20ml,得5mmol/ml, 2.5 mmol/ml, 1.25 mmol/ml 和0.625 mmol/ml的抗坏血酸样品溶液。 4.2.2实验步骤（1）取4.5mlTris-HCl+0.1ml样品溶液，混匀后在25下预热20min;然后加邻苯三酚0.4ml，在25下继续保持4min，加0.5ml浓盐酸终止反应。在325nm波长处测吸光度为Ai；（2） 用0.4ml的去离子水代替（1）中的0.4ml邻苯三酚,其余操作同上，测其吸光度为Aj；（3）空白管：用0.1ml去离子水代替0.1ml样品溶液，吸光值为A0。 （4） 计算各管对超氧阴离子的清除率（d）32: d4.2.3实验结果与分析：0.475实验测得的Vc、壳寡糖、硒化壳寡糖对超氧阴离子的清除能力如下表、图所示：表4.1抗坏血酸样品对超氧阴离子的清除率 浓度（mmol/l）吸光度 清除率（%）0.6250.41911.791.2500.41512.632.5000.36423.375.0000.28340.421.0000.13172.42图4.1抗坏血酸样品对超氧阴离子的清除率曲线图表 4.2 壳寡糖和硒化壳寡糖对超氧阴离子的清除能力浓度（mg/ml）壳寡糖浓度（mg/ml）硒化壳寡糖清除率（%）清除率（%）0.03130.4870.0538.630.06250.4370.03515.370.06250.4670.05112.420.1250.4040.04023.370.1250.4400.05418.740.2500.3800.04529.470.2500.4150.05925.050.500.3560.05937.470.5000.3860.06632.631.000.3290.06744.84图 4.2 壳寡糖和硒化壳寡糖对超氧阴离子的清除率曲线分析以上结果可以得出如下结论：通过与Vc对比可以看出，壳寡糖与硒化壳寡糖的确都具有清除超氧阴离子的抗氧化作用。并且通过图4.2我们可以看出硒化壳寡糖相对于壳寡糖而言对超氧阴离子具有更好的清除能力。壳寡糖和硒化壳寡糖对超氧阴离子的清除能力都随着浓度的升高而升高。4.3邻二氮菲Fe2氧化法4.3.1溶液的配制（1）0.2mmol/LPSB溶液：准确称取7.160g Na2HPO4 于100mL容量瓶中，定容，即为A液；称量3.120g NaH2PO4 于100mL容量瓶中定容，此为B液。取19mLB液加81 mLA液混匀，得PBS原液。用移液器取100L加水定容至100mL，得0.2mmol/L的PBS应用液。（2）0.01%H2O2：取30%H2O234L于100ml容量瓶中，加水定容。（3）0.75mmol/LFeSO4：称取0.0114g FeSO4于100ml容量瓶中，加水定容。（4）0.75mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液：取邻二氮菲（即1，10-菲咯啉）0.015g,用无水乙醇定容至100ml。 （5）壳寡糖样品溶液的配制：称取壳寡糖0.050g于100ml容量瓶中，定容得1mg/ml的样品溶液。分别取上述溶液10ml，5ml，2.5ml，1.25ml稀释到20ml,得0.25mg/ml，0.125mg/ml，0.0625mg/ml和0.0313mg/ml的壳寡糖样品溶液。（6）硒化壳寡糖的配制：准确称取硒化壳寡糖0.100g，用去离子水定容至100ml，得浓度为1mg/ml的样品溶液。梯度稀释，方法同壳寡糖，制得浓度分别为0.50mg/ml，0.25mg/ml，0.125mg/ml，0.0625mg/ml的稀释液。（7）抗坏血酸样品溶液的配制：准确称取0.176g抗坏血酸，加水定容至100ml，得10mmol/ml的Vc样品溶液。分别取上述溶液10ml，5ml，2.5ml，1.25ml稀释到20ml,得5mmol/ml, 2.5 mmol/ml, 1.25 mmol/ml 和0.625 mmol/ml的抗坏血酸样品溶液。4.3.2实验步骤（1）取一支试管编号为P，依次加入0.2mmol/L的PBS溶液2ml,去离子水1ml，摇匀；加入0.75mmol/LFeSO41ml，充分混匀后再加入0.75mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液1ml，在37水浴中放置60min。用分光光度计于536nm处检测反映体系的吸光值33，即Ap；（2）以1ml的取离子水代替步骤（1）中的1ml H2O2,其余条件同（1）。测其吸光值为Ab；（3）分别以不同的壳寡糖样品溶液和硒化壳寡糖的样品溶液1ml代替（1）中的1ml去离子水，测其吸光值分别为和；（4）分别以不同浓度的抗坏血酸样品溶液1ml代替步骤（1）中的1ml取离子水，测其吸光值AS2；（5）按以下公式计算样品糖及对照物抗坏血酸对OH的清除率（d）d（6）根据数据绘制样品浓度-清除率曲线4.3.3实验结果与分析实验测得的Vc、壳寡糖、硒化壳寡糖对OH的清除能力如下表、图所示 表4.3Vc样品对OH的清除率分组（mmol/ml）吸光度清除率（%） 0.025 0.278 0.625 0.058 13.04 1.250 0.072 18.58 2.500 0.149 49.01 5.000 0.223 78.26 10.00 0.265 94.86图4.3抗坏血酸对OH的清除率曲线图表 4.3 壳寡糖和硒化壳寡糖OH的清除能力壳寡糖硒化壳寡糖浓度（mg/ml）吸光度（）清除率（%）浓度（mg/ml）吸光度（）清除率（%）0.06250.0260.360.06250.0281.080.1250.0270.720.1250.0332.880.2500.0281.080.2500.0384.680.5000.0301.800.5000.0529.711.0000.0426.121.0000.06414.03图 4.3 壳寡糖和硒化壳寡糖OH的清除率曲线根据以上结果，可以得出如下结论：壳寡糖和硒化壳寡糖都具有一定的抗氧化能力；壳寡糖和硒化壳寡糖的抗氧化能力都随着浓度的升高而增强；相同浓度的硒化壳寡糖抗氧化能力明显高于壳寡糖，且随浓度升高，这种趋势愈明显。4.4总抗氧化能力测定试剂盒测定法4.4.1样品溶液的配制 分别取0.100g的壳寡糖和硒化壳寡糖，加水定容到100ml,配制成1mg/ml的样品溶液。4.4.2实验方法按表4.5加入试剂： 表4.5 总抗氧化能力测定试剂盒加样表试剂测定管U（ml）对照管C（ml）试剂一11待测样品0.1试剂二22试剂三应用液0.50.5涡旋混匀器充分混匀，37水浴30分钟试剂四0.10.1待测样品0.1充分混匀后，放置十分钟，蒸馏水调零，1cm光径，在520nm处测各管的吸光值。T-AOC（总抗氧化能力）单位定义及计算：（1）定义：在37时，每分钟每毫升样本中使反应体系的吸光度（OD）值每增加0.01时，为一个总抗氧化能力单位。（2）公式： 总抗氧化能力 （单位/毫升 ） 式中： ODU 测定管吸光度值； ODC 对照管吸光度值； N 反应体系稀释倍数（反应总体积/取样量）； n 样本测试前稀释倍数。 4.4.3 实验结果与分析表4.6 抗氧化试剂盒测定结果壳寡糖硒化壳寡糖ODU0.0140.015ODC0.0120.010 根据公式计算总抗氧化能力： 在本实验中，N=3.70.1；n=1 计算得，（1）壳寡糖的T-AOC为0.247单位/毫升；（2）硒化壳寡糖的T-AOD为0.617单位/毫升。 总抗氧化能力试剂盒测定结果显示，硒化壳寡糖的总抗氧化能力高于壳寡糖。 另，配制浓度为100mmol/ml的抗坏血酸，按照上述方法检测，测得：ODU为0.037，ODC为0.015，计算得100mmol/ml的抗坏血酸总抗氧化能力为2.71单位/毫升。远高于壳寡糖和硒化壳寡糖。结 论本实验以亚硒酸钠和壳寡糖为原料合成硒化壳寡糖样品，紫外和红外光谱分析结果显示，硒化壳寡糖中成功引入亚硒酸根，主要在位的氨基和的羟基上发生反应。二氨基联苯胺和邻苯二铵法测定的硒化壳寡糖中硒含量分别为8.82mg/ml和9.02mg/ml。对壳寡糖和硒化壳寡糖的抗氧化能力测定结果表明，壳寡糖和硒化壳寡糖均具有明显的抗氧化能力。硒化壳寡糖抗氧化能力明显高于壳寡糖，并且随浓度升高这种趋势愈加明显。同时，通过结果对比可以发现，壳寡糖和硒化壳寡糖对于羟自由基的清除能力要比其对超氧阴离子的清除能力弱。以浓度为0.500mg/ml的壳寡糖和硒化壳寡糖为例，在此浓度下，壳寡糖和硒化壳寡糖对超氧阴离子的清除率分别为32.63%和37.47%，甚至高于浓度为2.5mmol/ml的抗坏血酸对超氧阴离子的