改良的乳鼠心肌细胞分离与培养新方法.docx

广东药学院学报journal of guangdong pharmaceutical university jun201531(3)改良的乳鼠心肌细胞分离与培养新方法黄礼杰，陈耀旭，杨莹莹，殷春霞，陈睿，韩福平，唐羽欣，谭文 (华南理工大学生物科学与工程学院生物医药前孵化器广东省发酵与酶工程重点实验室， 广东广州510006)摘要：目的探讨一种简单有效的sd大鼠乳鼠心肌细胞分离与培养方法。方法取出生24 h以内的大鼠 心室o08的胰蛋白酶反复消化多次，离心收集心肌细胞，差速培养后5一溴脱氧尿嘧啶核苷纯化心肌 细胞。用全细胞膜片钳方法，记录心肌细胞动作电位，并用激光共聚焦显微镜观察钙瞬变、线粒体膜 电位。结果心肌细胞存活率大于93，心肌细胞纯度大于96，细胞形态良好，出现节律性搏动，钙瞬 变波形稳定、规律，动作电位和线粒体膜电位均正常。结论本研究方法分离心肌细胞存活率高、活性 好，是一种简单、高效的心肌细胞原代培养方法，可广泛应用于各种研究。 关键词：新生大鼠；心肌细胞；原代培养；钙瞬变；线粒体膜电位；动作电位 中图分类号：r一331文献标志码：a doi：103969jissn10068783201503023文章编号：10068783(2015)03038805an improved method for isolation and culture of neonatal rat cardiomyocytes huangjie，chen yaoxu，yang yingying，yin churlxia，chen rui，han fuping，tang yuxin，tan wen(school ofbioscience and bioengineering，south china university of technology，guangzhou 5 10006，china； preincubator for innovative drugs and medicine center，south china university of technology，guangzhou 510006，china；guangdong provincial key laboratory offermentation and enzyme engineering，guangzhou510006，china)abstract：objective to explore a simple and effective primary culture method of neonatal rat cardiomyocytesmethods the ventricular myocardium was removed from neonatal rat within 24 h after birththe cardiomyocytes were separated by repeated digestion with 008trypsin and collected by centrifugationdifferential adhesion method and 5-bromodeoxyuridine(brdu)were used in purifying cardiomyocytesthe action potential was measured by whole cell patchclampthe calcium transients and mitochondrial membrane potential of cardiomyocytes were observed by confocal microscoperesults the cell viability was more than 93the purity of cardiomyocytes was more than 96the morphology of cardiomyocytes appeared normalthe calcium transients were steady and regularthe mitochondrial membrane potential and action potential of cardiomyocytes were normalconclusion the primary culturemethod of neonatal rat cardiomyocytes is simple and effectivewhich could be applied to different cardiology researcheskey words：neonatal rat；myocardial cells；primary culture；calcium transients；mitochondrial membrane potential；action potential体外原代培养的乳鼠心肌细胞排除了神经、体 疾病研究的基本方法之一。乳鼠心肌细胞的分离过 液等因素的干扰，且具有良好的自发节律性和收缩 程中易受损伤，并且传统分离培养方法中缺乏对心 性已经被广泛应用于心血管相关疾病及药物研 肌细胞生理状态的评价。究1i。乳鼠心肌细胞的原代培养已经成为心血管本研究参照fu掣21的乳鼠心肌细胞分离培养方收稿日期：20150328 基金项目：广东省科技计划项目(20128011000050)；广州市重大专项科技项目(201300000051)作者简介：黄礼杰(1987一)，男，2012级硕士研究生，email：huanglijiew163coin；通信作者：谭文，男，教授，主要从事心血管分 子药理研究email：wentscuteducn。网络出版时间：20150520 10：07网络出版地址：http：wwwcnkinetkcmsdetail441413r201505201007001html万方数据第3期黄礼杰，等改良的乳鼠心肌细胞分离与培养新方法 389法并加以改进，探讨乳鼠心肌细胞的分离培养方法。 人终浓度为01 mmoll的brdu抑制成纤维细胞增 除观察心肌细胞形态，鉴定心肌细胞纯度外，还对心肌 殖加双抗(100 kul青霉素，100 kul链霉素)防 细胞动作电位、钙瞬变、线粒体膜电位3个指标进行观 止细胞污染。将心肌细胞置于恒温培养箱中培养， 察验证所获心肌细胞是否处于良好生理状态。 3648 h换液1次，培养34 d后使用。1材料与方法 14心肌细胞质量评价141心肌细胞存活率检测在接种到培养皿之11 动物 前，将原代心肌细胞悬液与o4台盼蓝9：1的比例出生24 h以内的sd大鼠的乳鼠，雌雄不拘，由稀释，混匀后于倒置显微镜下观察计数。细胞存活广州中医药大学实验动物中心提供，生产许可证号：率=活细胞数(未染成蓝色的细胞)细胞总数scxk(粤)20130020。10012试剂与仪器142形态学观察细胞培养3 d后，于倒置显微dmemf1 2 glucose(thermo scientific公司)；镜下观察细胞形态。025trypsinedta(1ife technologies公司)；5一溴脱 143心肌细胞纯度鉴定取出培养3 d的乳鼠心 氧尿嘧啶核苷(5-bromo一2deoxyuridine，brdu，美国肌细胞，4(p)的多聚甲醛固定20 rain，用pbs漂洗 sigma公司)：penicillinstreptomycin solution、newborn2次。01(d)triton x100处理20 rain，5bsa室calf serum、pbs缓冲液、flu04一am、f127(1ife温封闭30 rain。滴加otsa多克隆抗体(1：100)。4 technologies公司)；横纹肌肌动蛋白多克隆抗体 过夜，二抗37避光孵育90 rain。dapi染色，于激 (osarcomeric actin antibody，博士德生物)；驴抗兔光扫描共聚焦显微镜下观察。随机取6个视野计数igg(h+l)(alexa fluor488)二抗、dapi(1ife阳性细胞及细胞总数。阳性细胞率=阳性细胞数technologies公司)；jc一1(美国sigma公司)；nu一细胞总数x100。4950e co，恒温培养箱(美国nuaire公司)；bjcd144动作电位观察将已培养23 d乳鼠心肌seires单人超净台(上海博讯实业)；ix83倒置显细胞置于1 ml浴液中测动作电位。玻璃微电机由微镜(日本olympus)；l500台式低速离心机(湖南拉制仪分5步拉制而成，充灌内液后电阻为25 湘仪实验室仪器开发有限公司)；spl31825磁力加热搅拌器(thermo scientific公司)；lsm710激光扫 mq。选取细胞膜完整边缘清晰的细胞，调节微操描共聚焦显微镜(德国carl zeiss)；细胞光电联合记 综器使电极人液，点击patchmaster软件中set up按 录分析系统、epci0放大器(德国heka公司)；p97 钮使基线归零。当电极尖端接触细胞时发现电极电 电极拉制仪(美国sutfer instrument co)；抛 阻增加，至电阻增加约05 mq时给予轻微负压，细 光仪(日本narishige)。 胞很快封接至吉欧(gtl)。补偿电极电容，稳定片13原代心肌细胞的分离与培养 刻施加负压(或按zap按钮电击)打破细胞膜。刺无菌条件下取出24 h以内的sd大鼠乳鼠，用 激信号的控制，数据的采集均由patchmaster软件完 75(妒)酒精棉球消毒皮肤，开胸取出心脏，在预冷 成，数据的处理采用origin软件完成。记录动作电 pbs中清洗3次，分离心室部分，转移至装有预冷 位的刺激采用900 pa电流，持续5 ms。 pbs的闪烁瓶中，将心室肌组织剪为1 mm3大小，加 145激光共聚焦显微镜钙成像将已经培养3 入008胰酶(每只大鼠05 ml)，置于冰上冷消化20d的乳鼠原代心肌细胞与钙荧光指示剂fluo一4一am rain。在闪烁瓶中加入磁子，水浴37，250 rmin，消 (1：1 000)、表面活性剂f127(1：1 000)在避光条件 化4 rain后弃去第一次的上清液。加入008胰酶，下共同孵育40 rain后，再换为1 ml台式液于37， 37酶解消化4 min反复消化至组织块变白后不再 孵育30 rain3。加载好荧光染料的细胞置于zeiss 减小。收集各次消化后的上清液，加入等体积含lsm710激光扫描共聚焦显微镜(波长488 nm的氩 10(p)血清的dmemf12终止消化，2 400 rmin 激光，10倍物镜)的活细胞培养系统中。活细胞培 离心6 rain，收集所有细胞加入含10血清的养系统设置为：37 occo，浓度为5，湿度为 dmemf12，吹打成单细胞悬液，接种于培养瓶中， 100。共聚焦显微镜的成像方式主要采用二维平将培养瓶置于co，恒温培养箱中，差速贴壁培养 面扫描方式。15 h分离非心肌细胞，所得未贴壁细胞即心肌细 146线粒体膜电位观察将已经培养34 d的胞，计数。按实验需要接种于培养皿中，培养液中加 乳鼠原代心肌细胞与jc1(终浓度1 p。moll)孵育万方数据390广东药学院学报第31卷20 rain，换成正常培养基，于激光扫描共聚焦显微镜24心肌细胞动作电位下观察。乳鼠心肌细胞动作电位时程为(3727+241)ins，2结果动作电位幅度为(107923)mv，且动作电位波形稳 定规律(图3)，说明心肌细胞状态稳定、活力较强。21细胞存活率计算在倒置显微镜下用血球计数板计数，细胞总数 为417个，其中着色的为29个，计算得到细胞存活 率大于93。22细胞形态观察心肌细胞未贴壁时为小球状。3 d后贴壁的心图3乳鼠心肌细胞的心肌细胞动作电位 肌细胞呈多棱角，并成簇聚集，立体感强，较多自发figure 3action potential of neonatal rat eardiomyoeytes 搏动，且出现成簇细胞同步搏动，频率、强度稳定，收25心肌细胞钙瞬变观察缩明显有力(图1)。但不同簇的细胞搏动频率并不乳鼠心肌细胞搏动性收缩与心肌细胞钙瞬变有都相同。搏动频率大约10。60次rain。成纤维细密切联系，心肌细胞钙瞬变的稳定性也是心肌细胞胞无上述现象。良好状态的标志。通过flu04一am钙离子染色，在共聚焦显微镜下观察乳鼠心肌细胞自发性的钙瞬变 (图4a)，钙瞬变的平均荧光强度随时问呈现稳定、 规律的波动性变化(图4b)。a原代培养的乳鼠心肌细胞形态；b心肌成纤维细胞形态。 图1原代培养3 d的乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞的形态比较(100x)figure 1morphology of primary cultured cardiomyocytes anda心肌细胞自发钙瞬变(荧光强度最大时)；b心肌细胞内myocardial fibroblasts(100x)特定区域平均荧光强度随时间的变化曲线。23心肌细胞纯度图4原代培养的乳鼠心肌细胞钙瞬变(100x)仅一横纹肌肌动蛋白免疫荧光染色后，绿色荧光figure 4 calcium transients of primmy cultured cardiornyoc”es指示仅一横纹肌肌动蛋白。染色结果为，有绿色荧光 26心肌细胞线粒体膜电位 的细胞表示心肌细胞，无绿色荧光的细胞表示心肌线粒体膜电位是乳鼠心肌细胞能量代谢正常的 成纤维细胞。实验结果显示。培养的心肌细胞中绝 重要指标，本研究通过jc一1染料染色后，将乳鼠心 大多数细胞呈现绿色荧光染色阳性，而心肌成纤维 肌细胞置于共聚焦显微镜下观察(图5)。乳鼠心肌 细胞对照组则为阴性(图2)。心肌细胞占细胞总数 细胞表现为红色荧光密度较高，绿色荧光密度较低， 的比例大于96。说明线粒体膜电位处于正常值范围。心肌细胞b肌成纤维细胞注：dapi染细胞核(蓝色)；or一横纹肌肌动蛋白多克隆抗体作 注：红色代表jc一1在线粒体内的聚合体形式，表示线粒体膜 为一抗进行免疫荧光标记，绿色表示仅一横纹肌肌动蛋白。 电位完整；绿色代表jc1在线粒体内的单体形式，表示线粒 图2心肌细胞和心肌成纤维细胞仪一横纹肌肌动蛋白免疫 体膜电位降低。荧光染色比较(100x)图5乳鼠心肌细胞线粒体膜电位(400x)figure 2immunofluorescenee of dsarcomeric aetin in primaryfigure 5mitochondrial membrane potential of neonatal ratcultured cardiomyocytes and myocardial fibroblasts r 100x)cardiomyoeytes(400x)万方数据第3期黄礼杰，等改良的乳鼠心肌细胞分离与培养新方法 391表1不同大鼠乳鼠心肌细胞原代培养方法比较table 1 different primary cultured methods of neonatal rat cardiomyocytes还对影响心肌细胞收缩的几个指标进行考察。3讨论心肌细胞的收缩首先由动作电位的传递开始，乳鼠心肌细胞的原代培养中，心肌的酶消化和心 起搏细胞传递来的动作电位引发心室肌细胞膜的去 肌细胞的纯化是至关重要的2个步骤。据报道，多次 极化，去极化又导致胞外钙离子内流，内流的钙离子 短时问胰酶消化比单次长时间消化更能提高健康心 通过钙致钙释放机制诱发细胞内的钙瞬变，按照肌 肌细胞的产量4。胰酶消化的时间取决于所剩心肌 丝滑行学说。大量钙离子在水解atp作用下，使心 组织块的大小。多次消化虽然能提高产率，但是消化 肌细胞产生收缩1 0|。因此，心肌细胞的良好收缩状 时间过长也会使细胞活性降低2。不同的大鼠乳鼠 态取决于规律正常的心肌细胞动作电位、稳定的钙 心肌细胞分离方法与本研究的对比见表15-9。 瞬变、充足的atp供应。传统的乳鼠心肌细胞分离培养方法中，选择的 本研究所测得动作电位时程、幅度均与文献报 乳鼠大都是3 d以内，心肌组织的消化较多采用多 道一致11i。钙瞬变强健、稳定、规律；由jc1染心 种酶，每轮消化时间大都是8 rain以上(表1)。乳 肌细胞膜电位图像可知红绿比例与文献中正常乳鼠 鼠出生后3 d内都可用于心肌细胞培养，但若出生心肌细胞一致，线粒体膜电位正常1 2|。本研究对所 时间较长。心肌细胞成活率则较低，贴壁生长较差。 得乳鼠心肌细胞的动作电位、钙瞬变、线粒体膜电位 并且，每轮消化的消化时间过长，会降低细胞活性和 的观察，完整地验证了心肌细胞的良好收缩状态。 产率。另外，传统心肌细胞的鉴定大部分是通过仪然而，本研究虽然缩短了每轮消化的时间，有效 横纹肌肌动蛋白免疫荧光染色完成，无法判断心肌 地防止了细胞的过消化。但是，较短的每轮消化时间细胞的收缩功能是否正常。却增多了消化的次数，致使整个消化过程用时较长。 本研究选择出生24 h内的新生大鼠，采用单一在利用乳鼠心肌细胞进行的各类研究之前。除胰酶消化心肌组织，且缩短每轮消化中的消化时间， 进行心肌细胞鉴定外，由于存在分离条件、培养环境 有效地防止了细胞的过消化，提高了细胞活性和产 等的不同，还应该对心肌细胞的动作电位、钙瞬变、 率，也保证了细胞的良好状态。本研究除通过仅横 线粒体膜电位或其他相关指标其中之一或几项进行 纹肌肌动蛋白免疫荧光染色方法鉴定心肌细胞外， 检测，以确保所分离心肌细胞处于良好的生理状态。万方数据392广东药学院学报第31卷本研究通过对已有心肌细胞分离培养方法的改 chronotropic response to isoproterenoljcirc res，1 982，良，创建了一种新型的方法，该方法所得心肌细胞生50(1)：101116理状态良好，并且简单、廉价、高效、重复性好，是一7kojima k，moriguchi h，hattori a，et a1twodimensional network formation of cardiac myocytes in agar种较优良的乳鼠心肌细胞分离培养方法。microcuhure chip with 1480 nm infrared laser photo参考文献：thermal etchingjlab chip，2003，3(4)：2922961lam m l，bartoli m，claycomb w cthe 21一day 8kovacic s，soltys c l m，barr a j，et a1akt activity postnatal rat ventricular cardiac muscle cell in culture as an negatively regulates phosphmtlation of ampactivated experimental model to study adult cardiomyocyte gene protein kinase in the heartjj biol chem，2003，278 expressionjmol cell biochem，2002，229(12)：5162 (41)：39422394272fu jiajia，gao he，pi rongbiao，et a1an optimized9liu xiao，guo qulian，zhang zhong，et a1effect ofprotocol for culture of cardiomyocyte from neonatal ratj emulsified isoflurane on apoptosis of anoxiareoxygenationcytotechnology，2005，49(23)：109116 neonatal rat cardiomyocytesjasian pac j trop med，3gee k r，brown k a，chen w n u，et a1chemical2013，6(12)：977981and physiological characterization of fluo一4 ca2+一indicator 10bers d mcardiac excitationcontraction couplingj dyesjcell calcium，2000，27(2)：97106 nature，2002，415(6868)：1982054mark g e，strasser f fpacemaker activity and 11zhang peng，lader a s，etcheverry m a，et a1 mitosis in cultures of uewbom rat heart ventricle cellsj crotoxin potentiates l-type calcium currents and exp cell res，1966，44(2)：217233 modulates the action potential of neonatal rat5cheng t h，shih n l，chen s y，et a1reactive oxygeneardioinyocytesjtoxicon，2010，55(7)：12361243species modulate endotheliniinduced cfos gene 12 bao yuyan，wang xueying，li wei，et a120一hydro expression in cardiomyocytesjcardiovasc res，1999，41 xyeicosatetraenoic acid induces apoptosis in neonatal rat (3)：654662 cardiomyocytes through mitochondrial-dependent pathways6simpson p，savion sdifferentiation of rat myocytes injj cardiovasc pharm，2011，57(3)：294301single cell cultures with and without proliferating (责任编辑：幸建华)nonmyocardial cellscrossstriations，uhrastructure，and(上接第382页)13mullen c a，kilstrup m，blaese r mtransfer of 17chen c y，chang y n，ryan p，et a1effect of herpes the bacterial gene for cytosine deaminase to mammalian simplex virus thymidine kinase expression levels on ceils confers lethal sensitivity to 5-fluorocytosine：aganciclovirmediated cytotoxicity and the”bystander negative selection systemjproc natl acad sci usa，effect”jhunt gene ther，1995，6(1 1)：14671476 1992，89(1)：33-371 8moolten f ltumor ehemosensitivity conferred by14senter p d，su p c，