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东华大学 硕士学位论文 基于静电纺丝技术组织工程支架的生物相容性研究 姓名：王培伟 申请学位级别：硕士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：莫秀梅;王红声 20071201 摘要 基于静电纺丝技术组织工程支架的生物相容性研究 摘要 如何构建具有仿生天然细胞外基质( E C M ) 结构和功能的组织 工程支架，一直是组织工程及再生医学研究的热点。区别于传统纺丝， 静电纺丝是一种使带电荷的聚合物溶液或熔体在静电场中射流来制 备聚合物纳米级纤维的加工方法。以此技术制备的纳米纤维支架，具 有极高的比表面积、高孔隙率和相互连通的三维网络状结构，相对于 传统技术制备的材料支架能够更好地模拟天然细胞外基质的结构特 点。基于静电纺丝技术的纳米纤维有望成为理想的组织工程支架。生 物相容性可以解释为生物材料和人体组织接触后，在材料组织界面 发生一系列相互作用后最终被人体组织所接受的性能，生物相容性是 生物材料研究中始终贯穿的主题。细胞培养法因其检测生物相容性快 速、简便、重复性好又价廉的特点，在材料生物相容性评价中起着越 来越重要的作用。 本课题对基于静电纺丝技术组织工程支架的生物相容性进行了 初步研究。采用静电纺丝技术制备了新型的有别于传统技术的组织工 程支架仿生天然细胞外基质( E x t r a c e l l u l a rM a t r i x ，E C M ) ，如丝素蛋 基于静电纺丝技术组织工程支榘的生物相容性研究 白静电纺丝支架，壳聚糖胶原蛋白静电纺丝复合支架等，M T T 法检 测细胞粘附和增殖，S E M 形态学观察，在整体和细胞水平基础上深 入至分子水平，使用R T - P C R 分析了材料对内皮细胞相关基因表达的 影响。主要研究内容与结论如下： 以六氟异丙醇为溶剂，采用静电纺丝制备丝素蛋白纳米纤维，体 外接种内皮细胞，M T T 法结果显示纳米纤维能够有效促进内皮细胞 的粘附和增殖。共培养l d 、3 d 、5 d 和7 d 后，对照组内皮细胞增殖3 倍，材料组细胞增殖也达2 7 倍。R T - P C R 检测到P C N A 在实验材料 组和对照组的细胞中均有表达，与M T T 增殖结果相符。结果表明， 基于静电纺丝技术的丝素蛋白支架具有良好的生物相容性。 从仿生角度出发，通过对生物相容性良好的天然材料壳聚糖和胶 原蛋白的静电纺丝来从结构和功能上仿生天然细胞外基质。以六氟异 丙醇三氟乙酸为共混溶剂，成功制备出了壳聚糖胶原蛋白复合支架。 发现随着混合体系中壳聚糖含量的增加，静电纺纳米纤维的直径呈减 小趋势。选用戊二醛( G A ) 、水溶性碳二亚胺型缩合剂( E D C ) 、热 交联以及紫外照射( U Vi r r a d i a t i o n ) 交联等方式对支架预处理，S E M 照片显示经G A 交联后湿态条件壳聚糖胶原蛋白复合支架仍然保持 纤维形态，交联效果明显，满足了其保持纳米纤维结构以仿生组织细 胞外基质( E C M ) 的需要。 生物相容性是生物材料研究中始终贯穿的主题，采用细胞培养法 摘要 对壳聚糖胶原蛋白复合支架的生物相容性进行研究。H E 染色后可清 晰看到内皮细胞在材料表面贴附牢固，外形饱满，具有良好的生长状 态。S E M 显示细胞可进入三维网络状纤维内部孔隙，呈现立体迁移 生长。M T T 法结果表明，壳聚糖胶原蛋白质量比2 0 8 0 、5 0 5 0 材料 组表现出较其它3 组更好的细胞粘附与增殖能力。R T - P C R 检测细胞 I C A M 1 、P C N A 以及P 5 3 基因的表达变化，发现在管家基因 1 3 - 2 - m i c r o g l o b u l i n ( B 2 M ) 表达水平较一致的情况下，各个基因的表 达水平是有差异的；就同一基因表达而言，壳聚糖胶原蛋白各组相 互之间表达差异并不明显，且与T C P 相比亦无明显差异。结果表明， 基于静电纺技术的壳聚糖胶原蛋白复合支架具有良好的生物相容 性。 关键词：组织工程，静电纺丝，壳聚糖，胶原蛋白，丝素蛋白，生物 相容性 S T U D YO NB I o C o M l A T I B I L I T Yo FS C A F F o L D SF o R T I S S U EE N G I N E E I 江N GB A S E Do N E L E C T R o S P I N N I N G A B S T R A C T H o wt oc o n s t r u c tt h es c a f f o l df o rt i s s u ee n g i n e e r i n gt om i m i ct h e s 仃u c t u r ea n df u n c t i o no ft h en a t i v ee x t r a c e l l u l a rm a t r i x ( E C M ) i so fg r e a t i n t e r e s ti nt i s s u ee n g i n e e r i n ga n dr e g e n e r a t i o na l lt h et i m e U n l i k e c o n v e n t i o n a ls p i n n i n g ，e l e c t r o s p i n n i n gm a k e su s eo fc h a r g e st op r o v i d ea s t r e t c h i n gf o r c e t oac o l l e c t o rw h e r et h e r ei sap o t e n t i a lg r a d i e n t W h e na s u f f i c i e n th i g hv o l t a g ei sa p p l i e d ，aj e to fp o l y m e rs o l u t i o nw i l le r u p t f r o map o l y m e rs o l u t i o nd r o p l e t ，t h e nt h ee v a p o r a t i o no ft h es o l v e n tf o r p o l y m e rt os o l i d i f yt of o r mp o l y m e rf i b e r B e c a u s eo f t h em o r p h o l o g y f e a t u r eo fs m a l ld i a m e t e r , h i g hs u r f a c ea r e at ov o l u m er a t i oa n dh i 咖 p o r o s i t y , m e yC a nm a k eb e t t e rm i m e s i so ft h en a t u r a lE C Mc o m p a r e d I V S t u d yo nB i o c o m p a t i b i l i t yo fS c a f f o l d sf o rT i s s u eE n g i n e e r i n gB a s e do nE i e e t r o s p i n n i n g 谢也t h ec o n v e n t i o n a ls c a f f o l d s N a n o f i b e r sp r e p a r e db ye l e c t r o s p i n n i n g c a nb ea c ta se x c e l l e n ts c a f f o l df o rt i s s u ee n g i n e e r i n g B i o c o m p a t i b i l i t y C a l lb ed e f m e da st h ea b i l i t yo fam a t e r i a lt op e r f o r mw i t ha l la p p r o p r i a t e h o s tr e s p o n s ei nas p e c i f i ca p p l i c a t i o n B i o c o m p a t i b i l i t yi st h ek e y s u b j e c ti nb i o m a t e r i a lr e s e a r c hf i r s tm i d s ta n d l a s t I ti sq u i c k , c o n v e n i e n t ， g o o d r e p e a t i n ga n dc h e a pt h a te x a m i n i n gt h eb i o c o m p a t i b i l i t yt h r o u g h c e l l c u l t u r i n gm e t h o d ，a n di tp l a y sm o r ea n dm o r ei m p o r t a n tr o l ei n e v a l u a t i n gt h eb i o m a t e r i a l si nv i t r o T h i st h e s i sm a d eap r e l i m i n a r ys t u d yO i lb i o c o m p a t i b i l i t yo f s c a f f o l d sp r e p a r e db ye l e c t r o s p i n n i n gf o rt i s s u ee n g i n e e r i n g N a n o f i b e r s w e r ep r e p a r e db ye l e c t r o s p i n n i n gt om i m i ct h en a t i v eE C M ，s u c ha ss l i k f i b r o i ns c a f f o l d sa n dc h i t o s a n c o l l a g e nc o m p o s i t es c a f f o l d s C e l l a d h e s i o n ，p r o l i f e r a t i o na n dm o r p h o l o g yw e r ee v a l u a t e dt h r o u g hM T T m e t h o da n dS E M T h e n , R T - P C RW a su s e dt oe x a m i n et h eg e n e e x p r e s s i o n S i l kf i b r o i nn a n o f i b e r sw e r ep r e p a r e db ye l e c t r o s p i n n i n g ，H F I Pa s s o l v e n t E n d o t h e l i a lc e l l sw e r es e e d e do ns c a f f o l d s ，M T Tr e s u l t ss h o w e d t h a tt h en a n o f i b e r sc o u l de n h a n c ec e l la d h e s i o na n dp r o l i f e r a t i o n A f t e r 7 dC O c u l t u r e ，E C so nT C P p r o l i f e r a t e dt h r e ef o l d ，a n dt h a to nn a n o f i b e r s a l s op r o l i f e r a t e dt w op o m $ e V e nf o l d P C N AW a se x p r e s s e di nc e l l sb o 血 V O i ln a n o f i b e r sa n dt h ec o n t r o l ，i nk e e p i n gw i t ht h er e s u l t so fc e l l p r o l i f e r a t i o n I t s h o w e dt h a tt h ee l e c t r o s p t ms i l kf i b r o i nh a dg o o d F r o mt h ep o i n to f o f 。，e l e c t r o s p i n n i n go fbiocompatiblethep o i n to tv i e wo tm i m i ce l e c t r o s p m m n go tb l o c o m p a U O l e ， c h i t o s a na n dc o l l a g e nw a ss t u d i e dt ob i o m i m i ct h en a t u r a lE C Mf r o m b o t hs t r u c t u r ea n df u n c t i o ni nt h i sp a p e r C h i t o s a n c o l l a g e nc o m p o s i t e n a n o f i b e r sw e r es u c c e s s f u l l yp r e p a r e db ye l e c t r o s p i n n i n g ，H F I P T F Aa s s o l v e n t I tW a sf o u n dt h a tt h ed i a m e t e ro fs p u nf i b e r sb e c a m ef i n ew i t h t h ei n c r e a s eo ft h er a t i oo fc h i t o s a nt oc o l l a g e n G A , E D C ，U Va n dh e a t c r o s s l i n k i n g w e r ec h o s et os t a b i l i zt h ec h i t o s a n c o l l a g e n c o m p o s i t e s c a f f o l d S E Ms h o w e dt h a tt h es t a b i l i z e ds c a f f o l d sc o u l dk e 印t h e i r d i m e n s i o n a la n ds t r u c t u r a ls t a b i l i t yi nw e ts t a g ea f t e rG A c r o s s l i n k i n g B i o c o m p a t i b i l i t yi s t h ek e ys u b j e c ti nb i o m a t e r i a lr e s e a r c hf i r s t m i d s ta n dl a s t C e l l c u l t u r i n gm e t h o dW a su s e dt oe v a l u a t et h e b i o c o m p a t i b i l i t yo fc h i t i s a n c o l l a g e nc o m p o s i t es c a f f o l d s T h eM T T r e s u l t ss h o w e dt h a tn a n o f i b e r sC a no b v i o u s l ye n h a n c et h ep r o l i f e r a t i o no f c e l l s ， a n dt h ec e l l sh a v eag o o ds p r e a d i n ga n da t t a c h m e n to nt h e c o m p o s i t en a n o f i b e r s S E Ms h o w e dt h a tt h eE C sc o u l dm i g r a t ei n t ot h e f i b r o u s - n e t w o r ks t r u c t u r ea n dg r e wi nt h et h r e e d i m e n s i o n a l s p a c e S i m u l t a n e o u s l y , g e n ee x p r e s s i o nw a se x a m i n e db yR T - P C I LI C A M 一1 ， V I S t u d yo nB i o c o m p a t i b i l i t yo fS c a f f o l d sf o rT i s s u eE n g i n e e r i n gB a s e do nE l e c t r o s p i n n i n g _ P C N Aa n dP 5 3w e r ee x p r e s s e di nc e l l so ne l e c t r o s p u nc h i t o s a n c o l l a g e n c o m p o s i t es c a f f o l d sa n dt h ec o n t r o l s T h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eg e n e e x p r e s s i o nw a sd i f f e r e n ta m o n gd i f f e r e n tg e n e A sf a ra st h es a m eg e n e W a sc o n c e r n e d ，t h ee x p r e s s i o nW a ss i m i l a ri nc e l l so nc h i t o s a n c o U a g e n s c a f f o l d si nd i f f e r e n tm a s sr a t i o s ，a n di th a dn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e w h e nc o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o l s I ts h o w e dt h a tt h ee l e c t r o s p u n c h i t o s a n c o l l a g e nc o m p o s i t es c a f f o l d sh a dg o o db i o c o m p a t i b i l i t y K E YW O R D S ：t i s s u ee n g i n e e r i n g ，e l e c t r o s p i n n i n g ，c h i t o s a n ，c o l l a g e n ， s i l kf i b r o i n ，b i o c o m p a t i b i l i t y V 东华大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位 论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文中已明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体 已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对 所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：丑培南 日期：2 0 03 年o1 月。一7 日 东华大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允 许论文被查阅或借阅。本人授权东华大学可以将本学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本版权书。 本学位论文属于 不保密卣。 学位论文作者签名：培傍 日期：矽明年0 1 月。碉 指导教师签名：魄 日期秽年f 月护 第一章绪论 第一章绪论 组织工程( T i s 吼l cE n g i n e e r i n g ) 是近年来正在兴起的- - f 新兴学科，它是应 用生命科学和工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状 态下结构与功能关系的基础上，研究开发用于修复、维护、促进人体各种组织 或器官损伤后的功能和形态生物替代物的科掣1 1 。 组织工程的核心就是建立细胞与生物材料的三维空间复合体，即具有生命 力的活体组织，用以对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替 代。其基本原理和方法是将体外培养扩增的正常组织细胞，吸附于一种生物相 容性良好并可被机体吸收的生物材料上形成复合物，将细胞生物材料复合物植 入机体组织、器官的病损部分，细胞在生物材料逐渐被机体降解吸收的过程中 形成新的在形态和功能方面与相应器官、组织相一致的组织，而达到修复创伤 和重建功能的目的。 1 1 组织工程支架研究背景 自1 9 8 7 年首次提出和建立组织工程这一概念以来，尤其是L a n g e r 和V a c a n f i 在S c i c I l c e 上撰文介绍组织工程以来【l 】，组织工程在国际上已得到迅猛发展。美国 首先由国家科学基金组织资助建立了一系列组织工程实验室，集中了一大批顶 级研究机构、大学和公司如N A S A 、N I H 、M I T 、H a r v 绷d 、A d v m c dT i s s u e 等， 1 9 9 5 年筹建组织工程学会，并出版了正式刊物“组织工程学。德国、日本、 加拿大、奥地利、瑞士和英国等也开展了大量组织工程相关的研究工作。组织 工程尽管只有十多年的研究历史，但其基础研究和临床应用均已取得了许多有 意义的成果。在美国已形成了价值6 0 多亿美元的产业，并以每年2 5 的速度递 增。第一种组织工程产品组织工程皮肤A p l i 鲫f 已被美国食品与药物管理局F D A 批准上市，正式进入临床应用【2 3 】；软骨组织工程、骨组织工程、血管组织工程 等已处于临床试验或临床应用的前期准备阶段；其它组织工程方面，如肌腱组 织工程、角膜组织工程、肝脏组织工程、胰腺组织工程和心脏瓣膜组织工程等 方面的研究也已取得了较大的突破。 组织工程是材料科学、生命科学和临床医学相互交叉与融合的一个新领域。 作为- - f 交叉学科，其发展涉及到细胞学、组织学、生理学、病理学、生物化 学、生物力学和材料学等多种学科领域。尽管它的研究发展十分迅速，并已取 基于静电纺丝技术组织工程土颦的生物相容性研究 得了许多有意义的科研成果，但要将组织工程的科技成果转化为能广泛治疗干 百万患者疾病的产品，还面临着很多问题。其中，最关键的问题之是如何制 造出理想的仿生细胞外基质p4 1 0 细胞外基质( E x b ：a e e l l u l a rM a t r i x ，E C M ) ( 图1 - I ) 是在机体发育过程中由细 胞分泌到细胞外空间的各种大分子经进一步发生物理和化学变化而成为组成间 质和上皮- 血管中基质的不溶性结构成分，包括各型胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、 层粘蛋白、软骨粘蛋白、蛋白多糖等糖蛋白和透明质酸、6 _ 硫酸软骨素、硫酸皮 肤索及硫酸类肝素等耱胺聚糖。它们往往在细胞周围构成高度水合的凝胶或纤 维状网络p J 。天然E C M 在组织和器官中起骨架作用，使细胞聚集，构筑组织，控 制组织结构，调控细胞表型；同时，E C M 也是生长因子的储存库，生长因子由 此被控释放至相邻细胞。 囤1 1 细胞外基质结构示意图 支架在组织工程研究中充当人工细胞外基质( E C M ) ，为细胞的粘附、生长、 繁殖、新陈代谢、形成新的组织和器官提供各式支持，是决定组织工程成败的 关键因素之一。如何得到理想的仿生E C M 的组织工程支架，一直是国内外组织 工程科研工作者不懈努力的目标。理想的组织工程支架应具有以下几个特点：1 ) 良好的生物相容性；2 ) 生物可降解性，要求所使用的聚合物有能被水解的不稳 定键合。降解产物应该没有毒性，并能通过新陈代谢方式除去。降解速率可调， 能根据细胞类型、组织类型进行调整；3 ) 合理的构造、孔隙结构和三维外形， 为细胞的生长提供空间；4 ) 良好的力学稳定性，且力学性能与相应的组织匹配： 5 ) 不引起机体的排斥反应；6 ) 易于加工、成形、灭菌等。 目前用于制各组织工程支架的材料和方法有很多。材料方面：有天然高分 子材料，如胶原、壳聚糖；合成高分子材料，如聚乳酸、聚乙醇酸；陶瓷材料， 如羟基磷获石、生物活性玻璃；复合材料，如羟基磷灰石腋原复合物、羟基磷 燃 第一章绪论 灰石聚乳酸复合物：生物衍生材料，如天然骨、珊瑚等【6 棚。制备方法方面：有 纤维连接法、溶剂浇铸颗粒沥滤法、膜迭片法、熔融模法、聚合物陶瓷纤维复 合泡沫法、相分离法、原位聚合法、静电纺丝法等【8 】。每种方法各有其特点，下 文将对这些方法进行简要介绍。 1 1 1 纤维连接法 纤维连接法就是将大量纤维连接成纤维网结构。这一技术一般选用两种加 热时不相互熔的聚合物，且这两种聚合物对某种溶剂具有不同的溶解性能。将 一种聚合物纤维包埋在另一种聚合物基质中，加热后使聚合物纤维在交差点处 因熔融发生连接，然后再溶解去除作为基质的那种聚合物，最后剩下纤维网。 例如把P G A 纤维包埋在P L A 基质中，加热让P G A 纤维连接，以三氯甲烷为溶剂溶 出P L A ，得到P G A 的纤维网。纤维连接法所制得支架由大量纤维构成，比其它形 貌具有更大的比表面积，能为细胞的生长提供更多的表面。但这一技术对溶剂 和聚合物熔融温度的要求限制了这一技术广泛应用于大多数聚合物，目前这一 技术基本只用于P L A 与P G A 聚合物例。 1 1 2 溶剂浇铸颗粒沥滤法 溶剂浇铸颗粒沥滤法是将可沥出的盐粒分散在聚合物溶液中，并浇铸成形， 然后浸入水中沥去盐粒，即可得多孔支架，并可通过适当的处理，调节孔隙率、 比表面积、孔径大小及结晶度等。它克服了纤维连接法的一些不足，可应用于 任何一种聚合物，只要能找到适合的溶剂。但这一技术主要缺陷是孔隙会受到 致孔剂形状影响，孔隙间贯通程度不高，大小和形状不规则，不可控制，且存 在有机溶剂和致孔剂残留问题，可能影响细胞的生长【l 仉1 1 】。 1 1 3 膜迭片法 膜迭片法是通过将多孔膜按所要构建支架的三维外形叠加起来，形成一定 几何外形的组织工程支架。这一技术的优点是能按预先设计好的三维外形构建 支架，其缺点在于不能一次成形，且制备过程中确保原始膜片的孔隙结构不变、 层与层间密不可分有较大难度l l 引。 1 1 4 熔融模法 熔融模法类似溶剂浇铸颗粒沥滤法，只不过它不是将聚合物溶解在溶剂中， 而是将聚合物粉末预先与可沥去相混合，然后倒入模具中加热至聚合物玻璃化 温度以上，成形后取出在水中浸泡除去可沥去相，即可得到多孔具有模具三维 外形的支架。例如，采用凝胶作为沥去相制备P L G A 多孔支架。这一技术可以根 据需要制得具有特殊三维外形的支架。但由于制过程中需对材料进行加热，可 基于静电纺丝技术组织工程支架的生物相容性研究 能引起聚合物性质改变，如制备聚乳酸支架时，材料可能出现热降解。加热对 可沥去相也有影响，如凝胶作为可沥去相时，加热可能导致凝胶溶解性交差， 不能从支架中溶出【1 3 】。 1 1 5 聚合物陶瓷纤维复合法 骨组织的修复和重建要求其组织替代支架具有不规则三维外形和较好的力 学强度，为了满足这一要求，科研工作者们将羟基磷灰石( H A ) 的短晶与聚Q 羟基酯进行复合，制得纤维增强的支架。H A 聚Q 羟基酯复合支架的制备采用溶 剂浇铸法，将H A 短纤维和致孔剂分散在聚Q 羟基酯的溶液中，并浇铸成形，然 后沥去致孔剂，即可得到H A 聚a 羟基酯的复合支架。这种支架兼有陶瓷和高分 子材料的一些优点，且能得到三维几何外形，但制备中仍存在致孔剂和溶剂残 留问题p 】。 1 1 6 相分离法 相分离法是将聚合物溶液通过一种可控方式进行骤冷，得到连续的聚合物 固相和溶剂固相，然后将固化的溶剂相通过升华的方式去除，得到多孔的聚合 物支架。由于这个过程是在低温下进行，因此可以在制备过程中在支架中复合 生物活性分子，解决药物运载问题。复合亲水或疏水生物活性分子的多孔的 P L L A 或聚磷酸酯支架已使用这一技术制得。但这一技术设备和实验条件要求较 高，孔隙尺寸不易控制，不利于细胞的迁移【9 】【1 4 1 5 1 。 1 1 7 原位聚合法 原位聚合法是一种能在缺损部分直接构建支架并迅速实现力学稳定性的方 法。如聚甲基丙烯酸甲酯( 孙n 厦A ) 、聚丙乙烯( P P E ) 、磷酸盐骨水泥等通过注 射或浇铸达到骨缺损部位，固化后能起到填充和提供力学支持的作用。但这一 方法中，原料固化时大量放热，会导致周围组织坏死【1 6 ，1 7 1 。 1 1 8 静电纺丝法 静电纺丝( 也称电纺，E l e = c t r o s p i n n i n g ) 是一种简便易行的新型组织工程支 架制备方法。电纺支架具有独特的微观结构和适当的力学性能，由于具有与天 然细胞外基质相近的纳米级结构，电纺支架能够仿生细胞外基质的结构特点， 使之有望成为理想的组织工程支架。本研究正是采用这项技术构建组织工程支 架，下文将对这一技术进行详细介绍。 第一章绪论 12 静电纺丝技术介绍 1 21 静电纺丝技术的原理 这项技术历史可以追溯至t 1 9 3 4 年，F o r m a l a s 在一篇专利中首次介绍了利用静 电斥力获得聚合物纤丝的方法。其原理( 见图1 2 ) 是利用外加电场力使聚合 物溶液或熔体克服表面张力在纺丝喷头毛细管尖端形成射流，当电场强度足够 高时，在静电斥力、C o u l o m b 和表面张力的艿同作用下，聚合物射流沿不稳定的 螺旋轨迹弯曲运动，在几十毫秒内被牵伸千万倍，随溶剂挥发，射流固化形成 亚微米至纳米级超细纤维【1 9 1 。2 0 世纪8 0 年代，R e n e k e r 等1 2 0 1 进行了大量的实验和 理论探索，建立了较为完整的静电纺技术体系。近年柬随着纳米科技的不断发 展，电纺已成为一种重要的纳米材料I J I A - 技术。目前已有上百种天然和人工合 成高分子材料被成功地电纺成纳米纤维，所得单根纤维的直径从4 0 2 0 0 r i m ，甚 至可以跨越1 0 - 1 0 4 的量级，即微米、亚微米或纳米尺度范围划。 静电纺丝过程的影响因素很多，如溶液的浓度、电导率、表面张力等；喷 丝头内流体力学性质、电势、喷丝头与接收装置间距离；环境条件如温度、湿 度、空气流速等1 2 3 - 2 6 1 。 G 口l l e c t k m F J e c u i c F - l e k l 、 P o d S o l O n | 、 j H I n “k 、 篓生一山on 门 T n r g e t 也 舞】! 牌玑o oJ 1 二l 睡 1 2 2 静电纺丝技术的发展过程及研究现状 近年来，随着纳米技术的发展，静电纺丝日益受到广泛关注。有关静电纺 丝技术的发展过程如表1 1 。许多国家都在积极地研究静电纺丝，研究内容从对 聚合物的静电纺丝到理论模拟，再到静电纺丝纤维及其膜的应用都有涉及。截 基于静电纺丝技术组织工程支架的生物相容性研究 至2 0 0 7 年，有关“静电纺丝”的杂志出版物如图1 3 。 丌一。一一啊鄹3 ； i 脚 豳 沙 。 围 一 。 淄 碉 一 啦。厦翻刎如刮渤。么 b e 似e 如D 12 0 哎2 3 扣o 皓2 0 舢 Y l u 图l - 3 有关“静电纺丝的杂志出版物( S e e r a mR a m a k r i s l m a ) 我国对这方面的研究始于2 0 世纪末，一些科研所、大学等对静电纺丝进行 研究。2 0 0 0 年，张锡玮等【27 】承担的国家自然科学基金项目曾成功纺制了聚丙烯 腈纤维；2 0 0 3 年天津工业大学的姚海霞等【2 8 】曾经用静电纺丝法制备了超吸水纤 维；同时，天津大学袁晓燕等【2 9 J 承担的国家自然科学基金项目，以丙酮为溶剂， 对聚丙交酯( P L A ) 及与己内酯共聚物( P L A C L ) 进行了静电纺丝研究，并分 析了影响纤维形态结构的因素。东华大学莫秀梅等p 邺3 】对静电纺进行了大量的 实验研究，研究内容从对聚合物的静电纺丝到理论模拟，生物材料用于组织工 程支架的制备，再到纳米纤维的生物安全性评价以及再生医学等方面。他们系 统研究了壳聚糖作为多糖材料与蛋白质材料( 胶原蛋白和明胶) 共混时分子间 的相互作用，以及基于此特殊的分子间相互作用而引出共混材料优异的力学性 能。首次用红外光谱法证实了在壳聚糖与明胶之间存在着壳聚糖中的N H 2 与明 胶中的C O O H 基团之间的相互作用；以丙酮为溶剂，该小组发现电纺P ( L L A C L ) 支架具有良好的生物相容性和力学性能，能够支持内皮细胞和平滑肌细胞 ( S M C s ) 的粘附、增殖以及维持正常的细胞形态和表型 3 3 l 。另外，吉林大学、 四川大学、苏州大学等科研院所也在进行静电纺丝研究【刈。 从国内外研究状况来看，近几年来对静电纺丝制备纳米纤维的研究热点已 由原来对纺丝介质及工艺参数的探索发展到纺丝过程的理论分析及所得纤维的 鲫 瑚 鼬 种 伽 m 。 c善兰盂j-o摹o暑 第一章绪论 应用等方面。由于静电纺丝技术能够连续制备纳米或亚微米级超细纤维，在组 织工程支架制备方面具有独特的优势，静电纺丝技术已受到越来越多的重视。 表1 - 1 静电纺丝技术的发展过程 1 2 3 静电纺丝技术用于制备组织工程支架的优势及其应用 + 目前，静电纺已经被广泛应用在组织工程研究的各个领域。与其它组织工 程支架制备技术相比，静电纺技术主要有以下几个特点：( 1 ) 能够制备直径与 天然E C M ( 其中胶原纤维的直径为5 0 - 5 0 0n m 4 6 1 ) 相近的连续超细纤维，因而支 架可以最大程度地仿生人体内E C M 结构；( 2 ) 能够简捷地制备各种聚合物支架， 支架材料可以是单一的聚合物，也可以是多种聚合物的复合体，并可以在支架 中引入无机粒子( 如羟基磷灰石等) 、生长因子、细胞调控因子甚至活细胞；( 3 ) 制备的支架具有较高的孔隙率和较好的孔道连通。通过调节加工参数，电纺纳 米纤维的孔隙率可达9 0 左右，能够满足细胞生长对材料孔隙率的要求，由纳 米纤维层层堆积而成的结构也确保了支架具有良好的孔道连通性。此外，纳米 基子静电纺丝技术组织工程支架的生物褶容性研究 纤维具有极大的比表面积。这些都为细胞的生存提供了良好的微环境，有利于 细胞的粘附、分化、增殖和分泌E C M ：( 4 ) 通过选择适当的材料和加工参数， 可以获得降解率可控的纳米纤维支架，并能对材料表面进行理化修饰，提高支 架的生物相容性；( 5 ) 通过调节溶液浓度、纺丝参数等可以很好控制支架的厚 度、三维结构和力学性能。 能够电纺成组织工程支架的材料分为天然材料、合成高分子材料以及它们 的复合物。天然材料包括胶原、明胶、蚕丝、蜘蛛丝、几丁质及其衍生物、纤 维蛋白和生长因子等；合成高分子材料主要是一些可降解材料包括P L A ，P G A ( 聚羟基乙酸) ，P L G A ，P C L ；少量的非降解材料如P E O ，P U 等也被用来加工 血管支架。由于静电纺纳米纤维具有极高的比表面积、高孔隙率和相互连通的 三维网络状结构，相对于传统技术制备的材料支架能够更好地模拟天然E C M 的 结构特点，因此基于静电纺技术的纳米纤维有望成为理想的组织工程支架。在 短短的几年时间里，静电纺丝技术已经被广范应用在，包括软骨f 4 7 巧、骨瞄，矧、 血管 3 3 1 1 5 4 - 5 9 、心脏6 0 6 、神经【6 2 6 3 1 、皮肤【“，6 5 1 和膀胱【蛔等组织工程研究的各 个领域。 表1 - 2 静电纺支架在组织工程中的应用 第一章绪论 1 2 3 1 软骨 L i 等用P L G A 4 7 1 、P C L 4 8 ，删等电纺成软骨组织工程支架。实验表明，P L G A 支架具有良好的孔隙结构和力学性能，适合细胞的粘附、生长和增殖，可望作 为软组织再生的支架【蛔；电纺P C L 支架能够支持体外培养的干细胞分化为软骨细 胞、维持细胞表型并促进细胞增殖【铝“9 】。两个不同的小组分别采用I I 型胶原电 纺支架体外培养关节软骨细胞【孤5 1 1 ，结果均表明细胞能够顺利长入支架内部， 动态培养的结果还显示来自胶原支架的力学刺激能够促进细胞增值和分泌 E C M 5 2 1 。 1 2 3 2 骨 V a c a n t i d 、组【5 2 1 研究表明，骨髓基质干细胞( M S C ) 与电纺P C L 支架复合培 基于静电纺丝技术组织工程支架的生物相容性研究 养时，细胞能够长入支架内部，经诱导分化为成骨细胞，并在培养4 周时产生矿 化组织和分泌I 型胶原【5 引。同样方法培养4 周的复合支架植入L e w i s 大鼠的网膜 内，植入4 周后取出标本，切片并进行组织学、免疫组化和扫描电子显微镜观察， 显示植入物已矿化为骨组织并可能形成血管化组织。 1 2 3 3 血管 B o w l i n 等致力于从生物力学角度构建人工血管【5 5 】。他们将电纺P L A 无纺 布和螺旋状缠绕的胶原纤维束加工成内径小于6 m m 的血管支架，螺旋状的胶原 纤维束产生的张力使整个支架具有一定的残余应力，体外细胞实验表明，培养 的人动脉平滑肌细胞( S M C s ) 能够在P L A 支架上粘附和增殖，并沿着胶原纤维 束的方向排列【5 5 1 。他们还构建了由I ，型胶原和弹性蛋白( E l a s t i n ) 电纺纤维 组成的三层支架，通过微重力条件下的体外细胞培养，显示这种由天然材料构 建的人工血管能够模拟人体动脉血管的复杂结构【5 4 1 。 R a m a k r i s h n a 等对P L 【“矧和P ( L L A C L ) 【3 3 】【5 7 弓9 】电纺血管支架进行了大量 的实验研究，发现P L L A 支架的表面粗糙度对血管内皮细胞的功能有一定的影 响，平滑的表面更有助于增强内皮细胞的功能【5 3 1 ；电纺P ( L L A C L ) 支架具有 良好的生物相容性和力学性能，能够支持内皮细胞和平滑肌细胞( S M C s ) 的粘 附、增殖以及维持正常的细胞形态和表型( 见图1 4 ) 【3 3 】；采用尖角圆盘定向收 集装置( 图1 5 ) ，该小组在P ( L L A C L ) 电纺血管支架研究方面还获得了一些更 有价值的发现，如培养的平滑肌细胞( S M C s ) 能够沿着定向排列的纤维粘附和 迁移并呈纺锤状细胞表型( 图1 6 ) ，显微观察表明其细胞骨架蛋白与纳米纤维走 向平行，与浇铸法得到的材料相比，定向纳米纤维支架上培养的细胞的粘附和 增殖能力明显增强【5 7 1 ；他们也尝试了对电纺支架进行表面修饰的可行性，将聚 甲基丙烯酸甲酯( P M M A ) 和明胶( G e l a t i n ) 分别接枝到聚对苯二甲酸乙二醇 酯( P E T ) 电纺纤维上，体外细胞实验结果证实，明胶修饰的P E T 电纺纤维能够 明显改善内皮细胞的伸展和增殖能力，并维持其细胞表型 j 。 第章绪论 图l _ 4s E 蛳观察平滑肌细胞( 岛) 在电纺P ( L L A - C L ) 支架表面的生长形貌1 ( ) 培养l d ：( B ) 培养7 d j 江 戮 隧 基于静电纺4 技术组织I 程立集的生物相喜性研究 123 4 心脏 以P L A ，P L G A 和P E G P L A 等静电纺丝纤维构建心脏支架的研究也获得进展 6 0 1 培养7 d 的心肌细胞( C M s ) 能够进入支架内部生长，并导致支架结构的重 建，研究表明细胞在疏水性较强的表面能够生长得更好。S h i n 等删I e w i s 大鼠 的心肌细胞体外接种到用N i C r 金属线环收集的P C L 电纺纤维网上，培养3 d 后发 现心肌细胞在纤维网上开始收缩( 或眺动) 培养1 4 d 后细胞能够很好地粘附并 表达心肌特异性蛋白，表明通过该方法有望在体外培养具有足够生理功能的心 肌结构。进一步将血管生成因子等引入到具有适当三维结构的细胞，电纺复合支 架上，还有可能在体外培养出具有血管化的心肌组织。 12 3 5 神经 R a m a k r i s h n a 等也将定向排列的P L L 纤维支架用于神经组织工程研究。在 鼠神经干细胞( N S C s ) C 1 72 与支架的共培养实验中，发现细胞的伸长和神经突 的生长与支架中纤维的排列方向密切相关，而纤维的直径对其没有显著影响； 但细胞的分化程度则正好相反，细胞在纳米级纤维上的分化率明显高于微米级 纤维，而与纤维的排列方向无关f 6 2 l 。他们还将电纺P L G A 导管用于W i s t a r 大鼠的 右侧班骨神经修复，植A 1 个月后，7 例植入物中有5 例成功实现了神经再生【6 w 。 12 36 其他方面 P a r k 等通过静电纺构建蚕丝蛋白三维组织工程支架，发现成纤维细胞 ( 3 T 3 ) 在支架孔隙结构内部生长良好( 图I - 7 ) ，可望作为3 - D 细胞培养支架。 近年来，明胶“6 ”、弹性蛋白【鳓、胶原m 司、几丁质