猪圆环病毒病的实验室诊断.pdf

疾病防治 d o i ： 1 0 3 9 6 9 j i s s n 1 0 0 8 - 4 7 5 4 2 0 1 5 0 6 0 3 1 猪圆环病毒瘸的实验宣诊断 李敏 ， 秦立鑫 ( 哈药集团生物疫苗有限公 司 黑龙江哈尔滨 1 5 0 0 6 9 ) 回顾养猪业 3 0年 ，传统传染病如猪瘟 、口蹄 疫 、 猪丹毒等得到有效控制 ， 而一些新发疾病蓝耳 病 、 副猪 嗜血杆菌病 、 圆环病毒病 等持续暴发 ， 单一 病原感染向多种疾病混合感染发展， 疫病防控与诊 断难度增加 。圆环病毒病侵害猪 的免疫 系统 、 造成 免疫抑制 ， 打开 了其他疾病入侵的 门户 ， 对 于这种 疾病早期诊断确诊 、 早期有效治疗尤为重要 。由于 疾病复杂程度增高 、 兽医仅凭 临床表现和病理解剖 难以全面把握 ， 文章综述猪圆环病毒病常用实验室 诊断方法 ， 分析各种方法学优 、 略势 。 1圆环病毒概述 猪 圆环病毒 ( p o r c i n e c i r c o v i r u s ， p c v) 属 于单股 d n a圆环病毒科圆环病毒属成员 ，二十面体结构 、 无囊膜 、 由衣壳蛋 白和 d n a组成 ， 为已知 的最小动 物病毒之一 ， 分 为 i 型 ( p c v1 ) 和 i i 型 ( p c v 2 ) 两个 型。 p c v1 基 因大小为 1 7 5 9 b p ， p c v 2分为两个基因 型 、 大小分别为 1 7 6 7 1 7 6 8 b p ， p c v1 和 p c v 2两种 基 因型在核苷酸序列上相似度低于 8 0 、 但抗原之 间仍存在交叉反应 。p c v 1最早在 1 9 7 4年发现 、 被 证 明没 有致病性 ； p c v 2于 1 9 9 7年被分离 出来 ， 可 引起 了淋巴细胞凋亡 、 a p c递 呈抗原能力 的减 弱 、 同时降低 了 b细胞 和 c d 4 + t 细胞 的机能。p c v 2 具有免疫抑制性 ，感染 p c v 2的猪一般都发生免疫 缺陷 ， 可引起断奶仔猪多系统衰竭综合症 、 新生仔猪 先天性震颤 、 猪皮炎肾炎综合症 、 呼吸系统综合症 、 母猪繁殖障碍等。 2病原学诊断 2 1病毒 的分离与鉴定 圆环病毒传播主要以粪 口途径为主，病毒先定 居于扁桃体 、 之后 随血液遍布全身淋 巴结及各个器 官组织 ， 可取病死猪的脾脏 、 肺脏 、 肾脏 、 淋巴结等作 为病原 的分离材料。将取材进行研磨离心 、 氯仿抽 提 ， 接种于 p k1 5 细胞。p k 1 5为猪 肾细胞 ， 圆环病毒 可在 p k 1 5细胞上 良好生长而不产生细胞病变， 培养 些实际问题是可以的， 否则基层会认为高不可攀。 2 3 规范四种行为 ， 促进 工作开展 2 3 1规 范软件资料 乡镇建立动物防疫专卷 ，并对 卷中内容分类存放 ， 使其查阅方便 ； 根据基层实际 ， 制定便于携带 、 易于保存 、 填写方便 的散户档案。对 一 些有争议性的填写进行合理规范 ； 统一规范疫 苗 台帐 、 各类物资进 出登记 、 测温记录填写方式 ， 特别 是疫苗管理做到了帐物相符 ， 记录完整 。 2 3 2规 范大户管理 强化第一责任人主体地位 ， 明 确业主和监测指导人员的权限与职责； 加强制度建 设 ， 制订全区免疫技术和消毒技术规范并发至基层 照章实施 。 2 3 3规 范应急管理 一是促进乡镇调整充实 了应急 预备队 ， 规范建立监测报告 、 疫情报告 、 应急值班等 制度 。二是促进应急物资储备 ， 及时采购必备物资， 5 2中国动物保健 2 o 1 5年( 第 1 7卷) 第 6期 明确专人保管， 定期测试清理， 做到有备无患； 三是 强化疫情风险意识 ，每季度组织疫情分析评估会 ， 形成评估报告 ， 及时化解疫情风险。 2 3 4规 范督导行为 一要保证时间。对每个 乡镇用 2 d时间开展检查 、 督导 ， 有足够 时间对计划检查项 目、 需要 检查 的地方和重要环节进行查验 ， 避免跑 马观花现象发生。 二是工作仔细。 列表对“ 春防安排 部置、 物质保管 、 免疫档案建立、 制度建设 、 免疫工 作开展 、 疫病监测 、 工作创新 ” 等大项及其延伸的 2 0 多个小项一项一项看现场、 查资料、 搞走访， 决不在督 导工作中 、行 塞责。三是严格奖惩。视问题大小对村 级防疫员和在职职工实行处罚 ， 必须 明确限期改正 时间或惩扣绩效工资多少 ， 使其产生震慑作用 。四 是重视整改。对每一过错现场提出整改意见 ， 而且 必须 回访 ， 使问题得到彻底纠正。( 编辑 ： 狄慧) 疾病防治 过程 中可加 入 d 一氨基葡萄糖 能够促进 病毒 的增 殖 ， 细胞培养进行传代 1 3次后应进行 p c v 2抗原 或核酸的检测加以鉴定 。 2 2间接免疫荧光法 间接免疫荧光实验是检 测病毒 的常用方法 之 一 ，通常以薄片作 为载体 、 固定组织或细胞 、 再加入 待检标本 和荧光标 记物 、在荧光显微镜下观察结 果 。 a l l a n等利用间接免疫荧光法来检测圆环病毒 i i 型 ， 取病死猪的肺脏 、 淋 巴结 、 肾脏等组织病料研磨 离心处理后 以盖玻片为载体在 p k1 5细胞上培养 ， 丙酮 固定 ， 用荧 光素标记的兔抗高免血 清与细胞培 养物 中的 p c v 2抗原反应， 荧光显微镜下观察结果 ， 可 对 p c v 2 进行检测和分型。该方法对实验室设备及操作 人员技术要求较高， 专业实验室可操作 、 基层较难开展。 2 3 pcr 目前应用于 p c v检测的 p c r实验方法主要包 括常规 p c r方法 、多重 p c r方法 、巢式 p c r方法 等。在 p c r仪 中热稳定的 d n a聚合酶可使短链的 双股靶 d n a很快地复制成千上万倍 ，可以使 d n a 数量急剧增长而达到检测极限。 理论上 ， 可在 2 h内 将一个 d n a分子扩增 到 1 0 6 1 0 9倍 ， 从 而大大提 高了对其进行分析研究的速度 。吕艳丽等根据 p c v 的基 因序列设计一对特异的 p c r引物进行 p c v检 测 ， 建立 了特异的 p c v诊断方法 ， 该方法可 以检测 细胞和组织中的病毒核酸。 王忠 田等利用 p c r技术 对发病的规模化猪场进行 了 p c v感染 的调查 ， 同时 利用该方法研究了p c v病毒在自然感染猪体内的 分布情况。 多重 p c r是一种特殊的p c r检测方法， 可同时检测多种病毒 d n a， 即在同一反应体系中加 入不 同病毒引物 、 扩增不 同的 目标片段 ， 例如 圆环 病毒一伪狂犬病毒一细小病毒三联检 。 3血清学诊断 人工感染试验证明，由 p c v 2引起的血清转换 发生于感染后 1 42 8 d ， 所 以抗体检测有一段时间 的窗 口期 。另外 ， p c v1 和 p c v 2之间存在抗原交叉 反应 ，所 以制备针对 p c v 2的单克隆抗体是血清学 鉴定 的前提条件 。 3 1间接免疫荧光 将 p c v 2抗原与荧光素( 异硫氰酸 ) 进行结合 ， 制备出荧光素标记抗原 ，在反应板上加入待检标 本 ， 如存在 p c v 2抗体则产生抗原抗体复合物 ， 在荧 光显微镜下可观察 。如有待见卢银华等【 l _用猪 肾传 代细胞 系 p k 一 1 5增殖猪 圆环病毒 2型( p c v 2 ) 毒株 制备抗原 ， 建立 了检测 p c v抗体的间接免疫荧光试 验( i f a ) 。应用该方法对 6 4份临床送检血清样品进 行 了检测 。结 果 3 8份 血 清 呈 现 p c v抗 体 阳性 ( 5 9 ) 。但间接免疫荧光实验方法对操作技术要求 高 、 需要专 门的荧光显微镜 、 需要有 有经验的检测 人员 、 缺乏标准化的商业试剂盒 ， 因此该方法的大 范围临床应用受到了限制 。 3 2乳胶凝集实验( l at) 将 p c v病毒致敏乳胶颗粒 ，制备成诊断抗原 ， 取血清或全血标本 ，可在现场圈舍旁边检测抗体 ， 主要是检测 i g m， 使用于感染早期诊断圈 。该实验方 法操作容易 、实验条件简单 、 35 mi n出现结果 、 肉 眼判 断 、 不需要专 门培训 、 价 格低廉 、 适于 现场检 测 ， 在临床检验 中被广泛应用 。 3 3 eu sa 将病毒 、 纯化的蛋白质等抗原包被在酶联板上 ， 通过间接法 、 竞争法等程序检测抗体 。检测方法具 有诊断速度快， 敏感性高，特异性强等优点，适合大规 模检测 的要求 。有 人用 p c v 2抗原包被 9 6孔酶标 板 ， p c v 2 单克隆抗体作为酶结合物， 采用竞争法检 测 p c v 2 抗体 。该实验与传统的间接免疫荧光发相 比较检测 同样标本 ， e l i s a法敏感性达到 9 9 6 ， 而 间接免疫荧光法 只有 9 7 。张志慧等 3 1 对市场上 5 种 e l i s a试剂盒性 能做 了苹果， 发现差异较大。分析 为各i式剂盒原料、 工艺有较大差异 ， 方法学有竞争法有 夹心法 、 原料上有基 因合成 的 p c v 2 一 c a p 、 有重组 的 p c v 2 一 c a p ， 酶标抗体有单克隆抗体有多克隆抗体 。 中国兽药监察所对上市的几种抗体检测试剂 做 了评估 ， 发现特异性均达 到 8 7 以上 ， 但敏感性 从 5 8 到 1 0 0 不等 。( 编辑 ： 狄慧 ) 参考文献 ： 【 1 芦银 华， 谈 国营， 华修 国， 等 应用 间接免疫荧光试验检测 猪圆环 病毒抗体 f j 】 中国兽医科技， 2 0