结核分枝杆菌FtsZ抑制剂的筛选和活性研究.docx

结核分枝杆菌 ftsz 抑制剂的筛选和活性研究林媛，朱宁屿，蒋建东，司书毅【摘要】目的 筛选结核分枝杆菌 ftsz 的特异性抑制剂，为抗结核药物的研发提供先导化合物。方法 应用本实验室已经建立的结核分枝杆菌 ftsz 抑制 剂筛选模型对化合物库进行筛选，获得能够抑制 ftsz 的化 合物 202e，对其进行 ic50 以及分子水平活性测定，并利 用 ds 4.0 软件将化合物 202e 与 ftsz 的活性位点进行 对接。结果 化合物 202e 能够抑制结核分枝杆菌 ftsz 的 gtp 酶活性，其 ic50 为 15.46 mol/l。202e 还能够抑制 ftsz 蛋白的聚合。通过分子对接，发现 202e 能够与 ftsz 的 gtp 结合位点结合，抑制 ftsz 的 gtp 酶活性。结论 化合物 202e 是活性较好的结核分枝杆菌 ftsz 抑 制剂。【关键词】 结核分枝杆菌； 酶抑制剂； ftsz此，ftsz 被认为是一个很好的抗结核药物研究靶点5-6。本研究以 ftsz 为靶点，利用前期工作中建立 的结核分枝杆菌 ftsz 抑制剂筛选模型7，对国家 新药（微生物）筛选实验室化合物库进行筛选，寻 找到结构新颖的抗结核先导化合物，为抗结核药物 的研发奠定基础。1材料与方法1.1 材料1.1.1菌株 带有 ftsz 基因 的表达工程 菌pet16b-ftsz（bl21）由本室构建；耻垢分枝杆菌（mycobacterium smegmatis）mc2155 购自美国标准 生物品收藏中心（atcc）。1.1.2 试剂与培养基 孔雀绿、gtp、dmso 购 自美国 sigma 公司；30% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶 液、4 分离胶缓冲液、4 浓缩胶缓冲液、r-250 考马斯亮蓝染色液购自北京普利莱基因技术有限 公司；7h9 培养基、adc 增菌液购自美国 bd 公 司；化合物 202e 购自北京百灵威科技有限公司； 筛选所用化合物库来自国家新药（微生物）筛选实 验室，纯度 95%。中国医药生物技术, 2015, 10(2):109-112结核病近年来在全球范围有卷土重来的趋势，主要原因是多重耐药结核杆菌（mdr）的出现以及 结核分枝杆菌与人类免疫缺陷病毒（hiv）的联合 感染。在过去的几十年中，几乎没有新型高效的抗结核药物被研发出来1 。直到2012 年底，美国1.1.3仪器 envision2014 型酶 标仪为美国 fda 批准二芳基喹啉上市，虽然其具有抗结核活性，但是体内毒性较大2。因此，寻找新的有效的 抗结核药物成为我国乃至世界结核病防治的重要 任务。perkinelmer 公司产品。1.1.4 对接软件 discovery studio（ds）4.0 购 自美国 accelrys 公司。1.2 方法1.2.1 耻垢分枝杆菌对化合物库进行初筛 由于 结核分枝杆菌生长速度过慢，无法满足大量的体外 筛选要求，因此我们选择与结核分枝杆菌高度同源细菌结构蛋白ftsz 是真核细胞微管蛋白类似物。细胞分裂时，在 gtp 存在下，ftsz 在细胞内膜中心聚合成多聚体，形成高度螺旋结构 z 环3-4。 之后，在其他分裂蛋白的参与下，使 z 环逐渐缩 小导致隔膜形成，最终导致细胞分裂。ftsz 在包括结核分枝杆菌在内的原核细胞分裂过程中都发 挥着重要的作用，并且几乎所有原核细胞的 ftsz 都是高度保守的，因此，以 ftsz 为靶点的药物能 够抑制多种病原微生物。同时，原核细胞的 ftsz 与 真核生物的同种功能蛋白之间有较大差异，因基金项目：国家自然科学基金（81302816）作者单位：100050 北京，中国医学科学院药物研究所天然药物活性物 质与功能国家重点实验室（林媛、蒋建东）；中国医学科学院医药生物 技术研究所国家新药（微生物）筛选实验室（朱宁屿、司书毅） 通信作者：司书毅，email：收稿日期：2014-09-02110中国医药生物技术 2015 年 4 月第 10 卷第 2 期chin med biotechnol, april 2015, vol. 10, no. 2的耻垢分枝杆菌 mycobacterium smegmatis mc2155作为体外筛选的模式菌（结核分枝杆菌 h37rv 与 耻垢分枝杆菌 mycobacterium smegmatis mc2155 的 ftsz 蛋白相似性达 95%），对化合物库 2 万个 样品进行初步筛选。筛选方法如下：耻垢分枝杆菌 用 7h9 培养基（含 10% adc 增菌液）培养，接 种于 96 微孔板中，接菌量为 5 105 cfu/ml，每孔200 l。化合物库的筛选终浓度为 10 g/ml。37 培养 24 h 观察结果。将抑制耻垢分枝杆菌生长的 化合物建立初筛阳性库。1.2.2 以结核分枝杆菌 ftsz 抑制剂筛选模型筛定在 96 微孔板中进行，耻垢分枝杆菌用 7h9培养基（含 10% adc 增菌液）培养，接菌量为5 105 cfu/ml，每孔 200 l。化合物的终浓度为0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10 g/ml（0.7、1.4、2.75、5.5、11、22 mol/l）。37 培养 24 h 观察 结果。1.2.6 活性化合物与 ftsz 蛋白活性位点的对 接采用 discovery studio4.0 软件进行分子对接。 从 pdb 数据库中下载 ftsz 的 pdb（id：2q1y） 文件，进行预处理，去水，加氢，处理蛋白，以补 充文件中氨基酸残基。将 ftsz 定义为受体，定义 gtp 结合位点和找到结合空腔，然后定义结合球， 确定结合区域坐标。对接时，采用 cdooker 程 序，将 ftsz 定义为受体，202e 定义为配体，选 择结合区域坐标，运行程序。完成后，可在结果中 获得结合能、形成键等多项参数。选初筛阳性库利用之前构建的结核分枝杆菌ftsz 抑制剂筛选模型对初筛阳性库进行筛选，方法同文献7：待测的化合物样品终浓度为 10 g/ml， 与 ftsz（12 mol/l）蛋白室温孵育 30 min，之后 加入 gtp（1 mmol/l），在 37 孵育 15 min。缓冲液选用加入 20050 mmol/l tris，5 mmol/l mgcl2，ph 7.5。l 酸性溶液终止反应，该酸性溶液的成2结果2.1耻垢分枝杆菌初筛阳性库结果用耻垢分枝杆菌对化合物库 2 万个样品进行 筛选，共得到 65 个初筛阳性化合物，建立初筛阳 性库。2.2 结核分枝杆菌 ftsz 抑制剂筛选模型筛选结果 用结核分枝杆菌 ftsz 抑制剂筛选模型对初筛 阳性库进行筛选，抑制率 50% 则认为阳性。共 得到 3 个对结核分枝杆菌 ftsz 有抑制作用的化 合物。其中抑制率较高的为 202e，结构见图 1。分包括 0.045%（w/v）孔雀绿，4.2% 钼酸铵（溶于 4检测 不加mol/l hcl），5（v/v）浓 hcl。用酶标仪650 nm 处的吸光值。同时设立空白对照：以ftsz 为阳性对照（即酶活性完全被抑制），以等体积的 dmso 为阴性对照（即未加抑制剂）。fn fs抑制率（%）= 100%fn fp其中，fn 是阴性对照孔吸光值；fs是样品实验孔吸光值；fp 是阳性对照孔吸光值。以抑制率 50% 为阳性。1.2.3 活性化合物 ic50 测定 将筛选得到的活 性化合物 202e 溶于 dmso 中，配置成 10 mg/ml（22 mmol/l）的母液。之后将化合物倍比稀释， 按照文献7分别获得不同浓度条件下的抑制率， 以抑制剂浓度的对数为横坐标，抑制率为纵坐标， 利用 graphpad prism5 软件计算 ic50。1.2.4 蛋白水平检测活性化合物对 ftsz 多聚体形成的影响ftsz 蛋白用聚合缓冲液（50 mmol/l mes、5 mmol/l mgcl2、100 mmol/l kcl，ph 6.5） 溶解至浓度为 5 mol/l，加入不同浓度（25、50、100 mol/l）活性化合物 202e，同时加入 1 mmol/l gtp，在 25 孵育 10 min，287 000 g 高速离 心 30 min，取沉淀样品，跑 sds-page 电泳。比 较加入阳性化合物前后 ftsz 多聚体形成的量。图 1figure 1化合物 202e 的结构structure of compound 202e2.3阳性化合物化合物 202e202eic50的测定对 ftsz 的 gtp 酶活性抑制作用如图 2 所示。随着 202e 浓度的增高，对 ftsz的 gtp 酶活性抑制作用越来越强，表现出明显1.2.5活性化合物对耻垢分枝杆菌的 mic 测中国医药生物技术2015 年 4 月第 10 卷第 2 期chin med biotechnol, april 2015, vol. 10, no. 2111对照 0 25 50 100 100（mol/l）control806040图 3 sds-page 电泳结果显示 202e 抑制 ftsz 的聚合figure 3 sds-page shows the inhibition of ftsz polymers by 202e20021012log202e10（mol/l）图 2 化合物 202e 对 ftsz ic50 的测定figure 2 ic50 of gtpase activity of ftsz by 202e接亲和力越大，同时也预测了小分子与受体结合的8活性也越高 。经过软件分析，化合物 202e 与结核分枝杆菌 ftsz 蛋 白间相互作用的能值为 160.52 kj/mol。对接分析结果表明，化合物 202e 与 ftsz 的 gtp 结合位点的结合主要是靠氢键结合 力，这也是小分子与蛋白间相互作用的主要结合 键。图 4a 显示的是 202e 与 ftsz 蛋白 gtp 结 合区的结合位置。图 4b 给出参与 202e 和 ftsz 相互作用的氨基酸和形成的氢键。的剂量依赖性。通过用软件 graphpad prism5曲线得知，202e 对 ftsz 的 gtp 酶 ic5015.46 mol/l。拟合约为2.4 化合物 202e 对 ftsz 多聚体形成的影响ftsz 蛋白单体在 gtp 存在的情况下可以聚 合成 ftsz 多聚体，而 ftsz 多聚体再进一步聚合 就可以形成细胞分裂过程中的隔板。经过检测，如 图 3 所示，未加入化合物的 ftsz 在含有 gtp 的 聚合缓冲液中，发生了明显的聚合。对照为未加入 gtp 的 ftsz，没有明显的聚合现象。而随着 202e 浓度的增高，形成的 ftsz 聚合物逐渐减少。提示 化合物 202e 抑制了 ftsz 的聚合。2.5 化合物 202e 对耻垢分枝杆菌活性测定经测定，化合物 202e 有抗耻垢分枝杆菌活 性，其 mic 为 2.5 g/ml（5.5 mol/l）。2.6化合物 202e 和结核分枝杆菌 ftsz 活性位 点的对接评价分子间相互作用通常以能值作为评判标 准。能值的负绝对值越大，证明受体与底物的对3 讨论本实验利用已建立的结核分枝杆菌 ftsz 抑制剂的筛选模型筛选抗结核先导化合物，得到一个阳 性化合物 202e。202e 可以在酶水平抑制结核分枝 杆菌 ftsz 的 gtp 酶活性，也可以在蛋白水平抑 制 ftsz 的聚合。分子对接显示，202e 可以与 ftsz 蛋白的 gtp 结合位点形成相互作用键，阻碍 ftsz 与 gtp 结合之后发挥生物学功能。活性化合物202e 未在之前的文献中报道有抗结核活性。discovery studio（简称 ds）是新型的以生物 大分子、有机小分子为主要研究对象的专业分子模 拟与设计软件。主要功能包括：同源建模、分子动ab图 4 化合物 202e 与 ftsz 的对接结果（化合物 202e 以杆状结构表示，参与小分子相互作用的氨基酸标注氨基酸编号，红色表示氢键。a：化合物 202e 对接入 ftsz 的位置；b：化合物 202e 与 ftsz 形成的键）figure 4 docking result of compound 202e and ftsz (compound 202e was shown in rod structure. the interaction amino acids were labeled with serial number. hydrogen bond was indicated with red. a: the position of compound 202e inserted into ftsz; b: the bonds of compound 202e and ftsz)抑制率（%）inhibition rate (%)112中国医药生物技术 2015 年 4 月第 10 卷第 2 期chin med biotechnol, april 2015, vol. 10, no. 2力学模拟、基于结构药物设计工具（包括配体-蛋白相互作用、全新药物设计和分子对接）、基于小分 子的药物设计工具（包括定量构效关系、药效团、 数据库筛选、admet），应用学科涵盖生命科学、 组合化学、药物化学、计算化学等。分子对接就是 把配体分子放在受体活性位点的位置，然后按照几 何互补、能量互补以及化学环境互补的原则来实时 评价配体与受体相互作用的好坏，并找到两个分子 之间最佳的结合模式。新药的研发是一个漫长的过 程，如果每一个新化合物都进行药理实验研究，将 浪费很多的人力、物力、财力。计算机辅助药物 设计的建立，开拓了新的药物研究领域和方法，从 分子水平研究药物与受体的相互作用。为后续实验 研究提供重要的信息，使实验研究具有较强的导向性9-10。本研究为以 ftsz 为靶点的抗结核药物研究提 供了较好的分子探针。在后续实验中，会进一步测 定活性化合物的抗结核作用和对其他微生物的抗 菌作用，以及开展体内、外药效学研究。我们还将 对活性化合物继续进行结构改造，进行深入的构效 关系、分子药理学研究，以期获得结构新颖、效果 显著的新型抗结核药物先导物。参考文献1lin y, li y, zhu y, et al. identification of antituberculosis agents that target ribosomal protein interactions using a yeast two-hybrid system. proc natl acad sci u s a, 2012, 109(43):17412-17417.osborne r. first novel anti-tuberculosis drug in 40 years. natbiotechnol, 2013, 31(2):89-91.scheffers dj, driessen aj. immediate gtp hydrolysis upon ftszpolymerization. mol microbiol, 2002, 43(6):1517-1521.margalit dn, romberg l, mets rb, et al. targeting cell division: small-molecule inhibitors of ftsz gtpase perturb cytokinetic ring assembly and induce bacterial lethality. proc natl acad sci usa,2004, 101(32):11821-11826.dasgupta d. novel compound with potential of an antibacterial drug targets ftsz protein. biochem j, 2009, 423(1):e1-e3.kapoor s, panda d. targeting ftsz for antibacterial therapy: a promising avenue. expert opin ther targets, 2009, 13(9):1037-1051. lin y, zhu n, han y, et al. identification of anti-tuberculosis agents that target the cell-division protein ftsz. j antibiot (tokyo), 2014,67(9):671-676.kalyaanamoorthy 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