羧基化磁性纳米微球的表面生物修饰方法 Surface Biological Modification Research on Carboxylated Magnetic Nanoparticles.pdf

羧基化磁性纳米微球的表面生物修饰方法 石良，王锡昌，刘源，卢瑛+ ( 上海海洋大学食牖学院，j ：海2 0 1 3 0 6 ) 摘要：采用a 和b 两种羧基化磁珠，以山羊抗小鼠i g g 为模式蛋白，优化了e d c s u l f o n h s 法 的羧基磁珠表面抗体的修饰条件，对比分析了抗体修饰前后磁珠粒径和多分散系数( p d l ) 的变 化，并利用竞争性免疫层析法评价了磁珠表面修饰抗体的生物学活性。优化结果显示，不同粒径 和厂家的羧基磁珠，其表面的最佳抗体修饰条件是不同的。磁珠a 抗体修饰前后的平均水力学 粒径变化率为6 5 5 ，p d l 分别为0 0 1 1 和0 0 4 6 ，变化微小，而磁珠b 在抗体修饰前后的平均 水力学粒径变化率为1 3 5 5 5 ，分散性能变差。生物学活性评价结果显示优化条件下制备的磁 珠a 和b 表面的抗体均具有较好的抗原结合活性，磁珠b 的磁信号强于磁珠a 。综上所述，抗 体修饰磁珠用于免疫层析检测时，抗体修饰前后磁珠粒径和分散性能的变化、材料的磁响应性能 对于检测灵敏度和层析速度具有重要意义。 关键词：磁珠；生物修饰；e d c ；免疫层析 中图分类号：q8 1 9 文献标识码：a 文章编号：1 6 7 3 1 6 8 9 ( 2 0 1 2 ) 0 1 - - 0 7 1 - - 0 7 s u r f a c eb i o l o g i c a lm o d i f i c a t i o nr e s e a r c ho nc a r b o x y l a t e d m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s s h il i a n g ，w a n gx i c h a n g ，l ，uy u a n ，l uy i n g 。 ( c o l l e g eo ff o o ds c i e n c ea n dt e c h n o l o g y ，s h a n g h a io c e a nu n i v e r s i t y ，s h a n g h a i2 0 1 3 0 6 ，c h i n a ) a b s t r a c t ：u s i n gg o a ta n t i m o u s ei g gm o n o c l o n a la n t i b o d ya sm o d e lp r o t e i n ，a n t i b o d ym o d i f i c a t i o nc o n d i t i o n so nt h es u r f a c eo fc a r b o x y l a t e ds u p e r p a r a m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s ( s m n ) aa n db w e r eo p t i m i z e d 。t h e nh y d r o d y n a m i cs i z e sa n dp o l y d i s p e r s i t yi n d e x ( p d i ) o fs m n aa n dbb e f o r ea n da f t e ra n t i b o d ym o d i f i c a t i o nw e r ec o m p a r e d a d d i t i o n a l l y ，t h eb i o l o g i c a la c t i v i t yo f m o d i f y i n ga n t i b o d i e sw a sa s s e s s e db yac o m p e t i t i v ef o r m a tl a t e r a lf l o wi m m u n o a s s a y ( l f i a ) o p t i m i z a t i o nr e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eb e s tm o d i f i c a t i o nc o n d i t i o n sw e r ed i f f e r e n tf o rs m n so f d i f f e r e n ts i z e sa n dm a n u f a c t u r e s b e f o r ea n da f t e rm o d i f i c a t i o n ，t h eh y d r o d y n a m i cs i z ec h a n g e r a t eo fs m n aw a s6 5 5 ，p d lw e r e0 0 11a n d0 0 4 6 ，r e s p e c t i v e l y ，t h ec h a n g ew a sm i n o r ， w h i l eh y d r o d y n a m i cs i z ec h a n g er a t eo fs m n bw a s1 3 5 5 ，a n dt h ed i s p e r s i v i t yb e c a m e w o r s e f u r t h e r m o r e ，t h ea n t i b o d ym o d i f y i n go ns m n aa n dbb o t hs h o w e dg o o db i o l o g i c a la c t i v i t i e sb yl f i at e s t ，a n ds m n ai n d i c a t e db e t t e rl a t e r a lf l o wp e r f o r m a n c e b r i e f l y ，i fa n t i b o d ym o d i f y i n gs m n sw e r ec h o s e na sl a b e l si nl f i at e s t ，s i z ea n dd i s p e r s i v i t yc h a n g eb e f o r e a n da f t e rm o d i f i c a t i o n ，m a g n e t i cs i g n a li n t e n s i t yo ft h em a t e r i a lh a dg r e a tm e a ni ni m p r o v i n g 收稿日期：2 0 1 1 0 3 3 l 基金项目：“十一五”国家科技支撑计划项目( 2 0 0 8 b a d 9 4 8 0 9 ) ；上海市教育委员会优秀青年教师基金项目( 1 3 - 8 1 0 1 0 9 0 0 3 6 ) ；上海市科技 兴农重点攻关项目( 沪农科攻字( 2 0 0 9 ) 第6 一l 号) ；上海市教育委员会重点学科建设项目( j 5 0 7 0 4 ) 。 * 通信作者：卢瑛( 1 9 7 1 一) ，女，上海人，副教授，主要从事纳米生物学与食品安全风险评估研究。e m a i l ：y - l u s h o u e d u c n 食品与生物技术学报2 0 1 2 年第3 2 卷第1 期o 万方数据 s h il i a n g e ta l ：s u r f a c eb i o l o g i c a lm o d i f i c a t i o nr e s e a r c ho nc a r b o x y l a t e dm a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s d e t e c t i o ns e n s i t i v i t ya n da s s a yr a t e k e yw o r d s ：m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s ，b i o l o g i c a lm o d i f i c a t i o n ，e d c ，l a t e r a lf l o wi m m u n o a s s a y 超顺磁性纳米微球( s u p e r p a r a m a g n e t i cn a n o p - a r t i c l e s ，s m n s ，简称磁珠) 的主要特点是在外加磁 场的作用下可以被磁化而显示出磁性，能够被迅速 分离出来。当外加磁场撤离后它没有剩磁因而又 可重新分散到液体中，其生物相溶性和悬浮稳定性 较好e 卜2 。生物活性分子可通过磁珠表面的官能基 团结合到s m n s 上，应用于分离、检测和临床诊断 等领域中e l , a - e l ，是医学、分子生物学、免疫学等研 究中的重要载体工具。另外，研究显示s m n s 结合 免疫层析技术和磁性分析系统可以实现定量的快 速检测，目前在人促绒毛性腺激素、心肌肌钙蛋白 及h i v 病毒等的快速检测中已有相应报道 7 - 9 。 根据表面化学基团的不同，磁珠可采用不同的 化学交联剂，如醛类( 甲醛、戊二醛等) 、碳化二亚胺 类、双环氧类物质以及氰异酸盐等 1 0 进行生物分子 的修饰。羧基化磁珠表面生物分子的修饰以碳二 亚胺类中的1 一乙基一( 3 一二甲基氨基丙基( e d c ) 缩合 法最为常用。g 6 1 i n a s 等 1 1 成功地将d i e t h y l e n e t r i - a m i n e ( d e t a ) 配体固定到羧基化磁珠的表面，并 发现蛋白质在功能化磁珠表面的偶联率、生物学活 性及磁珠粒径的变化均会直接影响到其应用效 果 1 卜1 2 。作者以山羊抗小鼠( g o a ta n t i m o u s e ， g a m ) i g g 为模式蛋白，以e d c 与磺酸基琥珀酰 亚胺( s u l f o - n h s ) 为交联剂，对羧基化磁珠表面抗 体的修饰条件进行了优化。此外，通过比较不同种 类磁珠在修饰甲壳类主要过敏原原肌球蛋白( t r o - p o m y o s i n ，t i n ) 特异性抗体后的生物学活性，探讨 了适用于免疫层析检测的羧基化磁珠的表面生物 修饰方法。 1 1 材料 刀额新对虾( m e t a p e n a e u se n s i s ) ：购自上海泥 城集贸市场。e d c 、s u l f o - n h s ：上海延长生化公司 产品；b s a ：上海生工产品、无水吗啉乙磺酸：m e s ， s h a n g h a im d m ys c i e n c e & t e c h n o l o g y 公司产品； 山羊抗鼠i g g ：杭州隆基生物公司产品；其它均为国 产分析纯试剂；原肌球蛋白及抗原肌球蛋白单抗为 实验室自行制备纯化；p r o t e i ng 亲和层析柱：g e 公司产品；羧基化磁珠a 、样品垫、结合垫、硝化纤 维膜、吸水纸、p v c 底板：美国m a g n a b i o s c i e n c e s 公 司产品；羧基化磁珠b ：上海奥润微纳公司产品。 磁信号检测仪( m a g n e t i ca s s a yr e a d e r ，m a r ) ： 美国m a g n a b i o s c i e n c e s 公司产品；h p p s 5 0 0 1 高性 能纳米粒度分析仪：英国m a l v e r n 公司产品。 1 2 方法 1 2 1 原肌球蛋白及其特异性单克隆抗体的分离 纯化虾类主要过敏原t m 的纯化参照蔡秋凤 等 1 3 1 的方法并稍作修改。抗t m 的单抗 1 4 为实验 室前期研究成果，采用p r o t e i ng 亲和层析柱，按照 产品所附操作说明进行纯化。 1 2 2 磁珠的表面生物修饰羧基化磁珠的表面 g a mi g g 生物修饰采用e d c 和n h s 的化学交联 方法，其反应原理如图1 所示。e d c 与磁珠表面的 羧基反应，形成氨基反应活性的旺酰基脲中间体， 抗体的伯胺可与磁珠的该中间体反应而修饰磁珠 ( 途径1 ) ；另外该中间体在水溶液中不稳定，易于水 解，可重新生成羧基磁珠( 途径2 ) ，可通过加入s u l f o n h s 可以将该中间体转化为氨基反应活性的 n h s 酯，加快与伯胺结合( 途径3 ) 。具体操作流程 如下：( 1 ) 活化反应：取lm g 羧基磁珠于2m l 离心 管中，用2 5 0 肚l5m m o l lm e s 溶液含0 0 5g d l t w e e n 一2 0 ( 简称m e s t ) 作为活化缓冲溶液洗涤 2 次后，加入e d c 与s u l f o n h s ，其最终反应体积 为2 5 0 “l ，混合均匀后室温旋转反应3 0m i n 。( 2 ) 偶联反应：以1m m o l l 的硼酸盐溶液含0 0 5g d l t w e e n - 2 0 ( 简称b s t ) 作为偶联缓冲液，先用b s t 溶液洗涤磁珠2 次，然后用适量b s t 溶液重悬磁 珠，加入1 0 0 仁gg a mi g g 抗体，最终反应体积为 2 5 0 肛l ，室温旋转反应4h 后回收反应上清用于蛋 白定量。( 3 ) 封闭处理：偶联结束后加入2 5 0 肚l 含 有1g d lb s a 的b s t 溶液( 简称b s t b s a ) 室温 反应3 0m i n ，以封闭残留的活化基团。最后用2 5 0 肛l 含0 0 2g d ln a 3 n 的b s t - b s a 重悬磁珠，4 冷藏备用。 万方数据 s u l f o o n h s t 。莞盏芦嚣毒i 。 s m n s o o h 羧基磁璩 c a r b o x y l a t c ds m n s 半稳定的氨基反应活性n h s 酶 s e m l - s m b ka 町cr m c 6 v v c k 八 抗体修怖碰玮 a 皿i b 0 由r d 轴q 图1粒基磁珠的e d c s u l f o - n l i s 法表面抗体修饰原理图 f i g i s c h e m eo fa n t i b o d ) m o d i f i c a t i o no i lt h es u r f a c eo fs m n sb ye d ca n ds u l f i 卜n h sm e t h “l 1 2 3 磁性纳米微球表面抗体修饰的务件优化 为探讨最佧的抗体修饰条件作者分别对不同p i i 值( 3 0 7 0 ) 的m e s t 活化缓冲液不h 活化反 幢时间( 1 0 5 0r a i n ) 不一j 交联剂e d c 的质量分数 ( 0 12 5 2 ) 不司e d c s u l f on h s 质量比( 4 ：1 l ：1 ) 不问p h 值( 7 0 9 j ) 的i j s t 偶联缓冲 液不同偶联反应时f j ( 1 6h ) 及4 ：同抗体加入髓 ( 2 5 15 0u g ) 均做了3 次甲行优化实验升通过检 测抗体修饰后羧基表而的抗体i i 即仙联鲑进行修 饰效果的评价具体实验操作司1 2 2 所述= 1 2 4 磁珠粒径上、布捡测生物修饰前后羧基磁 珠的水力学札径分布状况目1 描述聚合物试样相对 摩尔质量多分散程度的多分散系数( p o l y d i s p e r s i y i n d e x ，p d i ) 采用i i p p s s 0 0 1 型高性能纳水粒度分 析仪进行检测它基于悬浮液【 t 颗粒的无规! l ! | j 运动 ( 布朗运动) 和对激光束的光散射原理，水力学j t j 是包括颗粒表面水化层在内的粒径分市其巾p d i 值越小颗粒分散性越好测鲢条件为： 一6 3 28 1 3 f 1 1 丁一2 5 。 1 2 5 抗体偶联量的测定 羧基磁珠丧【f i i 抗体修 饰后的蛋白质含最以偶联反应后的回收j 二清液为 样本，采j f 】经典的b r a d f o r d 法。检删篮n 质含量。 抗体偶联量按下述公式进行汁算： 磁珠偶联抗体链( ”g r a g ) 一( 倡联前加人量偶 联后抗体量) 磁珠质量 1 2 6 抗体修饰磁珠的生物学活性评价为评价 磁珠表而所修饰抗体的中物学活性利j h 优化后的 反应条件制备过敏原t m 的特掉性巾抗修饰磁珠 j r 以此作为标 己载体构建丁竞争性免疫层析试纸 条。实验所川的免疫层析试纸条p v ( 、底板、样 品垫、结合垫、硝化玎维膜和吸水纸构建而成；分刖 以p b s 溶液( a 1 和b 1 ) 、含u 0 5m g m l 。b s a 的 p b s 溶液( a 2 和b 2 ) 、含o0 5m g m i ，过敏原t m 的p b s 溶液f a 3 a 4 、m b 4 ) ( 图5 ) 喷点在硝化 纤维膜r 作为榆测线t 线2m r 1 7 1 i ，羊抗鼠i g g 喷点在硝化纤维膜形成控制线c 线对磁珠表面修 饰的抗体活性进行j 评价t 线和c 线的喷点量 均为1 oj z i ，7 c t l l 。检测时先取j ”l 单抗修饰磁珠 ( 2r a g m l ，) 点丁试纸条的结合垫处然后在样品垫 处加入1 0 0f - i p b s 溶液或荷含纯化后的过敏原 t m 的p b s 待测溶液事温层析2 0m i n 后川m a r 仪定量检测c 线和t 线的磁信号， 2 i 活化反应条件对抗体偶联量的影响 不i 卅活化反应条件时艘堆磁珠a 和i 表面抗 体偶联量的影响如同2 所爪。由罔2 ( a ) 可知磁珠 a 和h 表面的抗体偶联量随p 值的升高均呈现下 降趋势；在相i jp h 值时磁珠a 的抗体偶联量高 于磁珠h 说明磁殊a 的抗体修饰效果好十磁珠i j 。 随着活化反应时问的增加，磁珠a 和b 表面的偶联 量均显不出先显著增加后逐渐f 降趋势但是在相 食品与生物技术学报2 0 i2 q ：第3 2 卷第1 朗囝 也 ， n 0 一 妒。 o 。薮 万方数据 w l i a n g , e la l ：s ur f a c eb i o i o g i c a lm o d r l i c a l i o ns c s e a - c ho nc a r b o x y l a t e dm a g n e t i cn a n o p ar t i d e s 田互捌墨盘 同的活化时间，磁珠a 表面抗体偶联量高于磁珠 b 且两种磁珠表面的最高抗体偶联量所需要的活 化反应时间也是不同的。磁珠a 在活化反应2 0 r a i n 时其抗体偶联量最高，而磁珠b 则在活化反应 3 0m i n 时抗体偶联量最高( 图2 b ) 。相同偶联条件 下，磁珠a 表面抗体偶联量大于磁珠b ，这是因为 磁珠表面援基含量与抗体偶联量直接相关。磁珠 a 表面羧基含量为3 5 0f f m o l g 大于磁珠1 3 的2 0 0 f f m o l g 。南罔1 反应原理图可知羧基含量高使较 多的活性集团能与抗体伯胺进行交联。 在低p h 时交联剂e d c 与羧酸形成的中间体不 稳定，容易分解t “o ，但p h 值过高时，部分不稳定中 间物水解可能会释放出e d c 或者使半稳定的氨基反 应活性中问物的产量减少从而造成蛋白质与中间物 的取代反应速度下降，使蛋白质偶联量下降“。因 此在后续优化实验中，磁珠a 的活化反应条件为：p h 5 0m e s t 活化反应2 0m i n ；磁珠b 的活化反应条件 为：p h5 0m e s t 活化反应3 0r a i n 。 奄 量 ： 叠 甾 匿 蛙 挂 活化缓冲渣p h ( a ) 活化时间m i n ( b ) 图2 活化缓冲液p h l a ) 和活化时间( b ) 对抗体偶联量的影 响 f i g 2e f f e c to fa c t i v a t i o ns o l u t i o np h ( a ) ，a c t i v a t i o nt i m e ( b ) o na n t i b o d yc o u p l i n ga m o u n t 2 2 交联剂对抗体偶联量的影响 交联剂对磁珠表面抗体偶联量的影响实验结 果如图3 所示。由图3 ( a ) 可知，不论是磁珠a 还是 磁珠b ，当交联剂e d c 质量浓度小于0 5g d i 。时， 抗体偶联量呈现上升趋势，在0 5g d 1 时达到最高 值，其后随着e d c 质量浓度的增加抗体偶联量呈 现下降趋势。对于相同质量浓度的e d c ，磁珠a 的 抗体偶联量高于磁珠b 。对于e d c 和n h s 的不同 质量比，磁珠a 和b 均呈现出随着质量比的增加其 抗体偶联量也增加，并在l ：l 后呈现饱和趋势( 罔 3 b ) 。根据上述结果，在后续优化实验中e d c 浓度 选择为0 5g d l ，交联剂e d c 和s u l f o n h s 质量 比则为1 ：1 。 5 0 耄4 0 i 3 0 崔 墨 蛙2 0 磊 t o e d c 质量浓后t ( g m l l ( t ) 4 ：12 ：11 ：l1 ：2 l ：4 e d c i s u i f o - n h s 质量比 ( b ) 围3e d c 质量浓度( a ) 和e i ) c s u l f o - n h s 质量比( b ) 对抗 体偶联的影响 f i g 3 e f f e c to fe d cc o n c e n t r a t i o n a ) e i ) ca n ds u l f o - n h s m a s sr a t i o ( b ) o na n t i b o d yc o u p l i n ga m o u n t 2 3 偶联反应条件对抗体偶联量的影响 偶联反应条件对磁珠表面抗体偶联量的影响 结果如图4 所示。由图可见，磁珠a 和b 的表面抗 体偶联量均随着偶联缓冲液p h 值的增加而增加 曲j o u r n a lo ff o o ds c i e n c ea n db l o t e c h n o l o 目, v o l3 2n o12 01 2 万方数据 达到最大值后叉降低，磁珠a 和磁珠b 分别在 p h 8 5 和p h 9 0 时达最大抗体偶联量。另外，磁 珠a 和磁珠b 随着抗体加人量和偶联反应时间的 增加而增加，并逐渐趋向饱和。磁珠a 在抗体加入 12 5 “g 、偶联反应4h 时其抗体偶联量最高，而磁珠 b 则在】o o “g 抗体、偶联反应5 h 时出现最高偶联 量。在任一偶联反应点磁珠a 的抗体偶联量均高 于磁珠b 。根据上述结果，后续的优化实验中磁珠 a 和b 的偶联缓冲液p h 值分别选择8 5 和90 ， 磁珠a 的最适偶联反应时间选样了4h 而磁珠b 则为5h 。考虑到单抗较难制备且价格较贵因此 作者认为抗体加入量在7 5 1 0 0 “g 范围内进行选 择较为经济，磁珠a 和磁珠b 在这个范罔的表面抗 体密度为( 3 30 5 1 1 1 ) ( 4 3 6 1 3 5 ) g 。 偶联缓冲液p h ( a ) 图4 偶联缓冲液p h ( a ) ，偶联时间( b ) 对抗体偶联量的 影响 f i g 4 e f f e c to fc o u p l i n gb u f f e rp h ( a ) c o u p l i n gt i m e ( h j o i la n t i b 4 x l yc o u p l i n ga m o u n t 2 4 抗体修饰磁珠的粒径分布检测 磁珠经抗体修饰后的粒径变化用纳米粒度分 析仪进行检测，其结果如表l 所示。南表可知磁 珠a 在抗体修饰前后的平均水力学粒径分别为 2 4 8 6 和2 6 4 9n m ，其粒径变化率为6 5 5 ，p d l 分别为0 0 1 i 和0 0 4 6 变化微小，说明磁珠的单分 散性能较好；磁珠b 在抗体修饰前后的平均水力学 粒径分别为1 0 4 9 和2 4 7 1n m ，其粒径变化率为 13 5 5 5 ，p d i 由0 17 0 变为0 4 5 1 ，说明磁珠b 表 面修饰抗体后其单分散性能变差了。i g g 割抗体 在溶液中的最大长度为2 4n m 一，封闭液中的b s a 尺寸较小为9 5h i l l ”，以物理吸附方式结合在磁 珠表面；因此抗体的修饰埘磁珠的粒径变化会有些 许作用，但是磁珠b 在修饰抗体后其粒径m 现了显 著性增加，其原因很口r 能是生物分子的修饰过程使 磁珠粒子问的团聚从而造成其水力学尺、j 的变化， x u 等! 。报道了磁珠洗涤重悬的过程可能使其粒 径和多分散系数变大。 表1修饰抗体前后磁珠的特征 t a b 1c h a r a c t e r i s t i c so fs m n aa n dbb e f o r ea n da n e ra l l t i b o d ym o d i f i c a t i o n 无修饰2 4 8 60 0 1 l s m n a 6 5 5 修饰 2 6 4 90 0 4 6 无修饰 1 0 4 90 1 7 0 s m n b1 3 5 5 5 修饰 2 4 7 10 4 5 1 2 5 抗体修饰磁珠的生物学活性评价 t m 特异性单抗修饰磁珠的生物性活性评价结 果见图5 ( 定性) 和丧2 ( 定量) 。由图5 可见a i a 2 和h l b 2 试纸条在检测线( f 线) 处无条带其 丁线的磁f 等号也 # 常弱( 表2 ) ，与定性结果相一致 说明抗体修饰磁珠在t 线未被捕获；a 3 和b 3 试纸 条在t 线处有明显的条带。而a 4 和b 4 试纸条则 显示出微弱条带f ； 表2 可知a 3 和h 3 在t 线处的 磁信号为33 8 1 2 和80 3 9 5m a r ，a 4 和h 4 分别 为2 17 8 和4 3 1 8m a r ，定量检测结果与肉眼观察 的定性结果相吻合。 作者对单抗修饰磁珠的生物学评价采f 的是 竞争性抗原抗体反应原理即t 线上不喷点抗原 时试纸条上的抗体修饰磁珠因为没有抗原抗体的 结合反应而不能停留在t 线上，若t 线上喷点有抗 食品与生物技术学报2 0 i2 年第3 2 卷第1 期o 万方数据 s “| l , a n g e la l ：s ur f a c eb i o l a g i t a lm o d r f i c a t i o n 一。a ，。nc a ，n 。x v a t e 。m 一。n e t cn a n o p ar t i c l e s l i l ；j i j l ；i ：j i j l j l j l 重：i j i 幽 原时，t 线处就会有抗体修饰磁珠因特异性反应而 被捕获从而停留在此处，此时t 线就会显示出磁珠 所带的颜色停留量与颜色强弱成正比。a l 和b 1 榆测线处喷点的是p b s 溶液t 线无条带而c 线有 条带说明试纸条体系是有效的；a 2 和b 2 检测t 线 处喷点有含0 0 5r a g m i b s a 的p b s 溶液，检测 后t 线未出现条带说明抗体修饰磁珠a 和b 均无 假阳性反应。a 3 a 4 、b 3 b 4 试纸条在t 线喷点 的是过敏原t m 溶液冈a 3 和b 3 样本是p b s 溶 液无竞争性反应，而a 4 和b 4 样本巾含有过敏原 t m ，有竞争性反应阂而t 线条带的颜色弱于a 3 和 b 3 ，上述样本的定量检洲结果与肉眼观察结果相一 致，说明优化后的修饰方法制备所得抗体修饰磁珠 a 和b 均具有较好的抗原结合活性，町应用于后续 的免疫学检测中。 表2 抗体修饰磁珠a 和b 的磁信号比较 t a b 2 c o m p a r i s o no fm a g n e t i cs i g n a lb e t w e e na n t i b o d y m o d i f y i n gs m n - aa n db 吸水纸卜 n c 膜 结合垫卜 样品垫 30 5 31 3 933 8 1 z 52 1 7 8 01 1 2 1 0 80 3 9 5 94 3 1 8 a 1a 2a 3a 4 阑 ( a ) b 1b 2b 3 b 4 ( b ) c 线 。t 线 f 雾 向 ，i 线喷点溶液：非t i n ( a 1 b i 为p is s a 2 ，i s 2 为0o jm g m i b s a 的p b s ) ；t m 溶液( a 3 a 4 b 3 m 为on5m g n l f ，r m 的p b s ) ； a l a 3 b i b 3 均检测阴性样品而a 4 、b 检测t m 质量浓度为 5 “g m 1 的| ；【i 性样本。 图5 抗体修饰磁珠a ( a ) 和b ( b ) 免疫层析效果比较 f i g 5c o m p a r i s o no fl f i ab e t w e e na n t i b o d ym o d i f y i n g s m n a la ) a n db ( b ) 作者以g a mi g g 为模式蛋l7 对羧基化磁珠的 表面生物修饰疗法进行了研究修饰反应的优化实 验结果显示不同束源的磁珠其表而的最佳抗体偶 联条件是不同的；此外，发现在相同的条件f 。磁珠 a 表面抗体偶联量均大丁i 0 分析其原因除下磁 珠表面的羧基含量直接相关外还可能与磁珠的单 分散性能相关，磁珠的同聚会使其表面暴露的活性 集f i 减少从而造成生物分子偶联量的降低。免疫 层析检测结果表明这两种磁珠在生物修饰后其表 面的抗体均具有较好的抗原结合活性。但是b 3 的 t 线磁信号( 80 3 9 5m a r ) 大大高丁- a 3 ( 33 8 1 2 m a r ) 而c 线磁性号大大低于磁珠a 3 。其原因 很可能是因为磁珠b 经抗体修饰后其多分散性能 下降磁珠问发生了一定的团聚，从而对层析造成 r 物理屏障而使磁珠被截留引起的。虽然磁珠b 的分散性较磁珠a 差但是其磁响应性强( b 3 和 a 3 ) ，这有助于提高定量检测灵敏度。但是在实际 应用时往往以c 线的强弱来判断试纸条的有效性， 因此c 线信号过弱易造成结果误判。 综l 所述，对丁：不同厂家的同类型磁珠，即便 是修饰同一生物分子，其生物分子所需的最佳修饰 条件是不一j 的，会受到粒径、官能基团含量等因素 的影响。冈此在应用此类磁珠进行免疫层析检测 0j o u r n a lo ff o o ds d e n c ea n db i o t e c h n o l o dv o l3 2n o12 0 1 2 嘟 蛳 ! 兰 细 弧 3 3 1 3 5 5 5 m 舵 舭 m m 磁 阱 卧 万方数据 时，尚需要考虑材料的磁性成分含量、多分散性能 等因素，研究结果显示抗体修饰前后磁珠粒径和分 参考文献( r e f e r e n c e s ) ： 石良等：羧基化磁性纳采微球的表面生物修饰方法 散性能的变化、材料的磁相应性能对于检测灵敏度 和层析速度具有重要意义。 1 j a i ntk ，m o r a l e sma 。s a h o osk 。l e s l i e - p e l e c k ydj 。l a b h a s e t w a rv i r o no x i d en a n o p a r t i c l e sf o rs u s t a i n e dd e l i v e r y o fa n t i c a n c e ra g e n t s j m o l e c u l a rp h a r m a c o l o g y ，2 0 0 5 。2 ( 3 ) ：1 9 4 2 0 5 2 王燕佳，蒋惠亮，方银军，等新型磁性纳米颗粒同定脂肪酶的研究 j 食品与生物技术学报，2 0 0 8 ，2 7 ( 6 ) ：9 8 1 0 2 w a n gy a n - j i a ，j i a n gh u i l i a n g ，f a n gy i n - j u n ，e ta 1 s t u d yo nt h ei m m o b i l i z a t i o no fl i p a s ew i t hn o v e lm a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s e j j o u r n a lo ff o o ds c i e n c ea n db i o t e c h n o l o g y ，2 0 0 8 ，2 7 ( 6 ) ：9 8 1 0 2 ( i nc h i n e s e ) 3 t a ehk ，j a ikk ，w o o y o u n gs ，e ta 1 t r a c k i n go ft r a n s p l a n t e dm e s e n c h y m a ls t e mc e l l sl a b e l e dw i t hf l u o r e s c e n tm a g n e t i cn a n o p a r t i c l ei nl i v e rc i r r h o s i sr a tm o d e lw i t h3 - tm r i j m a g n e t i cr e s o n a n c ei m a g i n g ，2 0 1 0 ，2 8 ( 7 ) ：1 0 0 4 1 0 1 3 4 s a i y e dzm ，t e l a n gsd ，r a m c h a n dcn a p p l i c a t i o no fm a g n e t i ct e c h n i q u e si nt h ef i e l do fd r u gd i s c o v e r ya n db i o m e d i c i n e j b i o m a g n e t i cr e s e a r c ha n dt e c h n o l o g y ，2 0 0 3 ，( 1 ) ：2 5 t a p a s r e ers ，j o s e p hi c a r b o x y l - c o a t e dm a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sf o rm r n ai s o l a t i o na n de x t r a c t i o no fs u p e r c o i l e dp l a s m i d d n a j a n a l y t i c a lb i o c h e m i s t r y 。2 0 0 8 。3 7 9 ( 1 ) ：1 3 0 一1 3 2 6 d e n i zau ，a a l e vk ，s i n a na ，e ta 1 m a g n e t i ch y d r o p h o b i ca f f i n i t yn a n o b e a d sf o rl y s o z y m es e p a r a t i o n j m a t e r i a l s s c i e n c ea n de n g i n e e r i n gc ，2 0 0 9 ，2 9 ( 7 ) ：2 1 6 5 2 1 7 3 7 x uqf ，x uh ，g uhc ，e ta 1 d e v e l o p m e n to fl a t e r a lf l o wi m m u n o a s s a ys y s t e mb a s e do ns u p e r p a r a m a g n e t i cn a n o b e a d sa sl a b e l s f o rr a p i dq u a n t i t a t i v ed e t e c t i o no fc a r d i a ct m p o n i ni 口 m a t e r i a l ss d 哪艘a n de n g i n e e r i n gc ，2 0 0 9 ，2 9 ( 3 ) ：7 0 2 7 0 7 8 w a n gyy ，x uh ，w e im ，e ta 1 s t u d yo fs u p e r p a r a m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sa sl a b e l si nt h eq u a n t i t a t i v el a t e r a lf l o wi m m u n o a s s a y j m a t e r i a l ss c i e n c ea n de n g i n e e r i n gc ，2 0 0 9 ，2 9 ( 3 ) ：7 1 4 7 1 8 9 s h o nw ，s u s a nkw ，c h o upp ，e ta 1 r a p i dd e t e c t i o no fh i v - 1p 2 4a n t i g e nu s i n gm a g n e t i ci m m u n o - c h r o m a t o g r a p h y ( m i c t ) j j o u r a lo fv i r o l o g i c a lm e t h o d s ，2 0 0 9 ，1 6 0 ( 1 2 ) ：1 4 2 1 1 0 王迎军，杨春蓉，汪凌云e d c n h s 交联对胶原物理化学性能的影响 j 华南理工大学学报，2 0 0 7 ，3 5 ( 1 2 ) ：6 6 7 0 w a n gy i n g - j u n ，y a n gc h u n - r o n g ，w a n gl i n g y u n i n f l u e n c eo fe d c n h sc r o s s l i n k i n go np h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e so fc o l l a g e n j j o u r n a lo fs o u t hc h i n au n i v e r s i t yo ft e c h n o l o g y ( n a t u r a ls c i e n c ee d i t i o n ) ，2 0 0 7 ，3 5 ( 1 2 ) ：6 6 7 0 ( i nc h i n e s e ) 1 1 s t 6 p h a n i eg ，j a m e saf ，a n d r e wjv ，e ta 1 c o u p l i n go fd i e t h y l e n e t r i a m i n et oc a r b o x y lt e r m i n a t e dm a g n e t i cp a r t i c l e s j c o l l o i d ss u r f a c e sa ，2 0 0 0 ，1 6 4 ( 2 3 ) ：2 5 7 2 6 6 1 2 y us ，c h o wgm c a r b o x y lg r o u p ( 一c 0 2 h ) f u n c t i o n a l i z e df e r r i m a g n e t i ci r o no x i d en a n o p a r t i c l e sf o rp o t e n t i a lb i o - a p p l i c a t i o n s j j o u r n a lo fm a t e r i a l sc h e m i s t r y ，2 0 0 4 ，1 4 ( 1 8 ) ：2 7 8 1 2 7 8 6 13 l uy ，t o s h i a k io ，h i d e k iu ，y u k ih ，k a z u os i m m u n o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fm o n o c l o n a la n t i b o d i e sa g a i n s ts h e l l f i s h m a j o ra l l e r g e nt r o p o m y o s i n j f o o dc h e m i s t r y ，2 0 0 7 ，1 0 0 ( 3 ) ：1 0 9 3 1 0 9 9 1 4 蔡秋凤。王锡吕。刘光明，等口虾蛄主要过敏原原肌球蛋白的免疫活性 j 水产学报，2 0 1 0 ，3 4 ( 3 ) ，4 1 5 4 2 0 c a iq i u f e n g ，w a n gx i c h a n g ，l i ug u a n g m i