免疫电泳技术.doc

第二章 免疫电泳技术（Immunoelectrophoresis technique）一、 基本概况（一）原理蛋白质是一种两性电解质,它同时具有游离氨基和羧基。每种蛋白质都有它自己的等电点。等电点的高低取决于蛋白质的性质，在等电点时，蛋白质所带的正负电荷相等。在pH大于等电点溶液中，羧基解离多，此时蛋白质带负电荷，带负电荷的蛋白质在电场中向正极移动。反之，在pH小于等电点的溶液中，氨基解离多，此时蛋白质带正电荷，在电场中向负极移动。 这种带电质点在电场中向着带异相电荷的电场移动，称为电泳。带电质点所以能在电场中移动以及具有一定的移动速度，取决于其本身所带的电荷、电场强度、溶液的pH值、粘度以及电渗等因素。（二）影响电泳的因素 不同带电质点在同一电场中的迁移率（或泳动度）不同，影响迁移率的因素有：带电质点的性质：即颗粒所带净电荷的量，颗粒大小及形状等。带电荷越多，分子越小，泳动速度越快；电场强度：电场强度是单位厘米的电位差。电场强度越大，带电质点泳动速度越快。反之亦然；溶液中pH值：溶液的pH值决定了带电质点的解离程度，也决定了物质所带电荷的多少。对蛋白质、氨基酸等两性电解质而言，pH值离等电点越远，颗粒所带的电荷越多，电泳速度也越快。反之则越慢。蛋白质在酸性溶液中易变性，在偏碱溶液中比较稳定，所以蛋白质电泳大多用pH8.28.8的巴比妥或硼酸缓冲液，在这种pH中，血清蛋白一般都带负电荷；溶液的离子强度：溶液的离子强度越高，颗粒泳动速度越慢，反之越快。血清电泳一般最适宜离子强度在0.0250.075之间。离子强度越低，缓冲液的电流下降，扩散现象严重，使分辨力明显降低。离子强度太高，将有大量的电流通过琼脂板，由此而产生的热量使板中水分大量蒸发，严重时可使琼脂板断裂而导致电泳中断。溶液中离子强度与溶液的浓度成正比。=1/2CZ2(为离子强度，C为克分子浓度，Z为离子的价数)；电渗作用：电渗是在电场中液体对于固体支持物的相对移动。由于琼脂中含有SO42-，带负电荷，造成静电感应致使附近的水带正电荷，而向负极移动，所以电泳时有两种力，即电泳力和电渗力。如果物质原来带正电荷，向负极移动，则因电渗作用向负极移动得更快。如果物质向正极移动，所带电荷少，电泳力抵不过电渗力，则也向负极移动，血清中的球蛋白就是如此；吸附作用：即介质对样品的滞留作用。它导致了样品的拖尾现象而降低了分辨率。纸的吸附作用最大，醋酸纤维膜的吸附作用较小或无；电泳时间：电泳时间与迁移率成正比。（三）电泳中常用仪器1电泳仪2电泳槽 一般采用闭合式，即为了防止在电泳过程中产热，而使琼脂凝胶水分过度蒸发的设施。作电极用的铂金丝必须与电泳槽等长，这样电场才能均匀。电泳槽容量不宜过小，以防止溶液的浓度、pH值或离子强度发生改变，影响电泳条件的恒定性。（四）琼脂的选择和制备 电泳是利用一种支撑物作为一种介质让带电粒子通过，而其本身不发生变化。支撑物一般是采用琼脂或琼脂糖、纤维素膜、滤纸以及聚丙烯酰胺凝胶等。 1支撑物的条件惰性物质，电泳后本身不发生变化。制成凝胶后，其分子排列均匀，孔径大小一致便于带电质体自由通过。透明、无杂质、电渗作用小，并且有一定的粘度与脆性。价格便宜。一般多用琼脂粉或琼脂糖。琼脂糖是琼脂粉进一步提炼而成，很少或几乎无电渗作用。2凝胶板的制备 称取所需要量的琼脂粉，加入缓冲液（琼脂浓度一般1%2，琼脂糖0.75%1.5），同时加万分之一的硫柳汞防腐。水浴煮沸，待琼脂完全溶化后，液体清凉，再煮一段时间。选择适当大小的、无油腻、无划痕的干净玻璃板，根据所需的厚度（一般为2mm4mm厚），计算好琼脂的用量。把玻片置于事先用水准仪测试的平台上，倒入熔化的琼脂，注意不要产生气泡。冷却后，按事先制好的图形大孔，用点水笔尖挑去孔内的琼脂，在火焰下轻烤以封底，以防止样品从琼脂底部泳过。然后加样，不用的琼脂板，放入冰箱中，注意防止干涸和冰冻。（五）缓冲液的选择与配制 常用的电泳缓冲液有以下两种。1 pH8.6离子强度0.025Mol/L0.075Mol/L的巴比妥缓冲液，配制方法如表2-1：表2-1 巴比妥缓冲液配制 离子强度 巴比妥钠(g) 巴比妥（g） 加水至（ml）0.07515.452.761 0000.05010.301.841 0000.02510.301.842 0002pH8.6硼酸缓冲液，离子强度0.05Mol/L 硼酸 6.70g 硼砂（Na2B4O710H2O） 13.40g H2O 加至 1 000ml 缓冲液配制后，加万分之一的硫柳汞防腐。两侧电泳槽加缓冲液至2345的槽体积，注意两侧一样多，以免造成液面差，产生虹吸作用，影响电泳。 当蛋白质泳动至槽内后，就应该更换缓冲液。有人认为长久电泳过的电泳液易于把血清中各成分分开，而新配制的则差一些。为了防止缓冲液离子强度的改变，可以在每次电泳时更换正负极（这是目前广泛采用的）；也可以在下一次电泳前，将两槽内的缓冲液混合后再用。但也有人认为不能混合再用，必须更新。（六）电场强度的显示 以Vcm长或Icm宽表示。电压的测量必须用电压表测量凝胶板两端的电压差，再除以板长，而不能以电泳仪上的电压数表示，当然这两者有一定的相关性。电泳仪上的电流强度除以凝胶板宽即可代表电场强度。在实际工作中，很难有两项指标都符合的调控，因此只能根据取其一个指标进行调控，一般多按电流计算。（七）结果观察与标本的保存 对于与免疫有关的电泳，一般能形成明显的抗原抗体复合物，因此可以直接观察。也可以染色观察。染色后同时也起到了保存标本的作用。具体步骤如下： 1将琼脂板放入生理盐水中4浸泡2天3天，每天换液数次，以洗去多余的蛋白质。 2染色 将洗好的琼脂板放入氨基黑或偶氮胭脂红染色液中染色15min30min。0.5氨基黑染色液的配制：氨基黑4B（10B也可） 0.50g甲醇 5ml冰醋酸 10mlH2O 40ml0.75偶氮胭脂红染色液的配制： 偶氮胭脂红 1.50g 甲醇 100ml 冰醋酸 20mlH2O 80ml先将染料放入研钵中，边研磨边加甲醇，使染料充分溶解，再加冰醋酸，最后加蒸馏水，以滤纸过滤，置棕色瓶保存。3脱色 染色后，将琼脂板放入脱色液中脱色，至琼脂板底色脱净为止，脱色液要勤换。脱色液的配制： 乙醇 45ml 冰醋酸 5ml H2O 50ml脱色液用过后，可用活性炭吸附染色颗粒，过滤后，可再使用。4漂洗 用蒸馏水漂洗。5制膜 把琼脂胶滑到玻璃纸上，下垫一玻璃块，展平玻璃纸。在琼脂表面上抹一层甘油（以防干裂），放37温箱烘干即可。也可以先制膜后染色。对于非免疫性电泳标本的染色基本同于免疫电泳。但不要进行漂洗，电泳后直接投入染色液中或固定后投入染色液中。6标本的保存 主要是染色后拍照保存，也可制膜保存。（八）电泳的分类1根据支撑物的不同可分为：凝胶电泳：如琼脂电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。纸或纤维素膜电泳：如滤纸电泳、醋酸纤维膜电泳、硝酸纤维素膜电泳等。粉末电泳：如淀粉、纤维素粉电泳等。2根据电场强度的不同可分为：低压电泳：电场强度1V/cm5V/cm，电泳时间较长，可数小时至十几小时。中压电泳：电场强度5V/cm20V/cm，电泳时间一般数分钟至数十分钟。高压电泳：电场强度20V/cm200V/cm，电泳时间短，一般为数分钟至数十分钟。3根据离子强度的不同而分为：连续电泳：是指电泳槽缓冲液的类型与离子强度和玻璃板上支撑物的一致。非连续电泳：使电泳槽内缓冲液的类型与离子强度和玻璃板上支撑物的不一致。一般常采用琼脂板的离子强度为电泳槽的一半。4根据电泳的目的可分为：区带电泳、免疫电泳 胞电泳等 5根据形状可分为火箭电泳、圆盘电泳等。二、琼脂平板电泳琼脂凝胶结构均匀，含水量大，吸附量小，因此电泳速度快，电泳结果区带整齐，分辨率高，易染色，制成薄膜标本保存方便。所以琼脂凝胶电泳最常用。（一）试剂及材料1pH8.6离子强度0.05巴比妥缓冲液2优质琼脂3玻板、打孔器等（二）操作方法1以巴比妥缓冲液配成1%1.5琼脂，溶化后制成2mm3mm的琼脂板。2打孔 在玻片的13处打孔，孔径3mm6mm。也可用剃须刀片挖一小槽。3加样 将血清样品直接加入孔内，如非血清样品则尽可能用pH7.4PBS透析后加样。也可以不打孔，用滤纸片蘸取样品直接插入以小刀划开的琼脂裂缝中。4电泳 将样品端放入负极，用滤纸（纱布、棉布均可）23层搭桥（与玻片同宽度），电压3V/cm6V/cm，电流强度1.5mA/cm3mA/cm。5断电 电泳2h4h，断电。6固定、染色、观察结果。 白蛋白 1 2 加样孔正常血清经琼脂平板电泳后分成的区带如图2-1：图2-1 血清经琼脂平板电泳后分成的区带 （三）注意事项1为了观察泳动情况，以掌握断电时间，可在加样的同时，加一滴伊文斯兰染色液即可。2开始电泳时，电压要小一些，以逐渐升至所需要得强度。2 为了获得较好的区带结果，采用较小的电压（或电流），适当延长时间是可取的。二、 醋酸纤维膜电泳 醋酸纤维膜电泳是一项简便而又迅速的方法。它的优点是：电泳区带分离清楚，比琼脂平板电泳分辨率高；可以定量；样品用量少，只需要几微升即可。（一）材料与试剂1pH8.6离子强度0.05巴比妥缓冲液20.5氨基黑染色液3透明液：冰醋酸 3 份95乙醇 2 份混合即可 4醋酸纤维膜（二）操作方法1将醋酸纤维膜条浸于巴比妥缓冲液中，浸透后用竹镊子夹到滤纸上，吸去过多的水分。将膜的光滑面向下搭在电泳槽两侧的滤纸桥上，注意搭平。2加样 用微量加样器于负极端1.5cm处加样1l3l，注意样品要成一条直线且垂直方向。也可用血球计数板盖玻片蘸取样品轻轻点上。3电泳 电压10V/cm15V/cm或0.4mA/cm0.6mA/cm电泳45min60min，至电泳区带展开约2.5cm3.5cm时，关闭电源。4染色 将膜浸于氨基黑染色液中，染色数分钟。5透明 将染色的醋酸纤维膜浸于透明液中，漂洗5min 10min，至背景呈乳白色为止。为了防止膜上出现许多气泡，可以逐渐升高透明液浓度10、20以至30。6结果观察及保存 透明后，将膜贴于玻璃上，干后取下，即可观察结果并保存。7定量 将各区带剪下，分别浸于4Mol/L NaOH 4ml中，振摇数次，约2h，色泽被浸出，于580nm620nm比色，测出各区带的OD值。同时剪一块大小相似无蛋白的透明膜同样处理，做为对照。计算各区带蛋白含量百分比（以血清为例）总OD值TA+1+2+白蛋白=A/T100以此类推。（三）注意事项1醋酸纤维膜孔隙小，含水量少，且较薄，因此它对热很敏感，故应注意控制电压、电流。2样品不可过多，只需几微升即可。3加样一定要呈直线、垂直、分布均匀，这样泳动的区带整齐、不歪。4注意醋酸纤维膜的质量，浸泡很久仍有大块白色硬点者可弃之不用。四、免疫电泳（一）原理 免疫电泳是琼脂平板电泳和双相免疫扩散两种方法的结合。将抗原样品在琼脂平板上先进行电泳，使其中的各种成分因电泳迁移率的不同而彼此分开，然后加入抗体做双相免疫扩散，把已分离的各抗原成分与抗体在琼脂中扩散而相遇，在二者比例适当的地方，形成肉眼可见的沉淀弧。该方法可以用来研究：抗原和抗体的相对应性；测定样品的各成分以及它们的电泳迁移率；根据蛋白质的电泳迁移率，免疫特性及其它特性，可以确定该复合物中含有某种蛋白质；鉴定抗原或抗体的纯度。（二）试剂与器材同琼脂平板电泳。（三）操作方法 1在玻璃板的中央放置一小玻棒（d=2mm3mm），然后用0.05mol/L pH8.6巴比妥缓冲液配制1琼脂，制成琼脂板，板厚2mm.。 2在玻棒的两侧，板中央或13处，距玻棒4mm8mm各打直径3mm6mm的孔。 3在孔内加满血清。 4将玻璃板置电泳槽上进行电泳。电流为2mA/cm3mA/cm（或电压3V/cm6V/cm），电泳时间4h6h。 5停止电泳，用小刀片在玻璃板两侧切开，取出玻璃棒，加抗血清样品。 6于湿盒内37（或常温）扩散24h，取出观察。7于生理盐水中浸泡24h，中间换液数次，取出后，加0.05氨基黑染色5min10min，然后以1mol/L冰醋酸脱色至背景无色为止。8制膜、观察、保存标本。（四）免疫电泳结果分析 1常见的沉淀弧 由于经电泳已分离的各抗原成分在琼脂中呈放射状扩散，而相应的抗体呈直线扩散，因此生成的沉淀一般多呈弧形，常见的弧形如下：交叉弧：表示两个抗原成分的迁移率相近，但抗原性不同；平行弧：表示两个不同的抗原成分，它们的迁移率相同，但扩散率不同；加宽弧：一般是由于抗原过量所致；分枝弧：一般是由于抗体过量；沉淀线中间逐渐加宽并接近抗体槽，一般由于抗原过量，在白蛋白位置处形成；其它还有弯曲弧、平坦弧、半弧等。 2沉淀弧的曲度 匀质性的物质具有明确的迁移率，能生成曲度较大的沉淀弧。反之有较宽迁移范围的物质，其沉淀弧曲度较小。 3沉淀的清晰度 沉淀线的清晰度与抗原抗体的特异性程度有关，也与抗体的来源有关。抗血清多来源于兔、羊、马。兔抗体的特点是形成沉淀线宽而淡，抗体过量对沉淀线影响较小，而抗原过量，沉淀线发生部分溶解。马抗血清所形成的沉淀线致密、清晰，抗原或抗体过量时，复合物沉淀溶解、消失，而且产生继发性的非特异性沉淀。因此使用抗原抗体时，一定要找好适当的比例。 4沉淀弧的位置 高分子量的物质扩散慢，所形成的沉淀线离抗原孔较近；而分子量较小的物质，扩散速度快，沉淀弧离抗体槽近一些。抗原浓度高沉淀弧偏近抗体槽，反之，抗体浓度过高，沉淀弧偏近抗原孔。（五）注意事项 1免疫电泳分析法的成功与否，主要取决于抗血清的质量。抗血清中必须含有足够的抗体，才能同被检样品中所有抗原物质生成沉淀反应。 2抗血清虽然含有对所有抗原物质的相应抗体，但抗体效价有高有低，因此要适当考虑抗原孔径的大小和抗体槽的距离。 3免疫电泳要求分析的物质一方为抗原，另一方为沉淀反应性抗体。因此没有抗原性的物质或抗原性差的物质、非沉淀反应性抗体，均不能用免疫电泳进行分析。五、对流免疫电泳（一）原理 在pH8.6的琼脂凝胶中，抗体球蛋白只带有微弱的负电荷，在电泳时，由于电渗作用的影响，抗体球蛋白不但不能抵抗电渗作用向正极移动，反而向负极倒退。而一般抗原蛋白质带负电荷，将抗原置于负极，将血清抗体置于正极，电泳后则在两孔之间相遇，并在比例适当的部位形成肉眼可见的沉淀线。本法由于抗原抗体分子在电场作用下定向运动，限制了自由扩散，增加了相应作用的抗原抗体的浓度，从而提高了敏感性，它较琼脂扩散敏感性高1016倍。本法快速、操作简单。（二）试剂 同免疫电泳。（三）操作方法 1制琼脂板 以pH8.6离子强度0.05巴比妥缓冲液配成1%1.5琼脂凝胶板，厚度2mm3mm。 2打孔 琼脂冷却后，按图打孔，打成对的小孔数列，孔径0.3cm0.6cm，孔距0.4cm1.0cm。挑去孔内琼脂，封底。 3加样 一对孔中，一孔加已知（或待测）抗原，另一孔加待测（或已知）抗体。 4电泳 将抗原孔置于负极端。电压2.5Vcm6Vcm，或电流强度3mA/cm5mA/cm，电泳时间30min90min。（四）观察结果 断电后，将玻板置于灯光下，衬以黑色背景观察。阳性者则在抗原抗体孔之间形成一条清楚致密的白色沉淀线。如沉淀线不清晰，可把琼脂板放在湿盒中37数小时或置电泳槽过夜再观察。（五）注意事项 1抗原抗体浓度的比例 当抗原抗体比例不适合时，均不能出现明显可见的沉淀线。所以除了应用高效价的血清外，每份待测样品均可做几个不同的稀释度来进行检查。 2特异性对照鉴定 为了排除假阳性反应，则在待检抗原孔的邻近并列一阳性抗原孔，若待检样品中的抗原与抗体所形成的沉淀线和阳性抗原抗体沉淀线完全融合时，则待检样品中所含的抗原为特异性抗原。 3适当的电渗作用在对流免疫电泳中是必要的。当琼脂质量差时，电渗作用太大，而使血清中的其它蛋白成分也泳向负极，造成非特异性反应。在某些情况，琼脂糖由于缺乏电渗作用而不能用于对流免疫电泳。4当抗原抗体在同一介质中带同样电荷或迁徙相近时，则电泳时两者向着一个方向泳动。故不能用对流免疫电泳来检查。附：水貂阿留申病对流免疫电泳（一）材料与试剂 1抗原 人工感染急性阿留申病貂组织提纯抗原。 2标准阳性血清和阴性血清，供试验对照。 3待测血清 4琼脂糖 50.05Mol/L pH8.6巴比妥缓冲液 6玻璃板 10cm4.5cm。 7打孔器 孔径3mm。 8微量加样器 100l。（二）操作方法1 制琼脂糖板 1琼脂糖，10ml铺于104.5cm的玻板上，厚度约3mm。2 打孔 孔径3mm，孔距8mm。3 加样 待检血清加入阳极孔，抗原加入阴极孔，每孔10ul。同时设标准阳性和标准阴性血清对照。4 电泳 抗原孔置阴极端。双层滤纸搭桥，电压90V100V，电泳时间30min60min。（三）结果测定 在对照组成立的情况下，在抗原和待测血清之间形成一条清晰灰白色沉淀线，稍偏向血清孔，为阳性。（四）注意事项1 抗原必须低温（-25）保存。4保存一周。2 电泳必须用纯度较高的琼脂糖，缓冲液pH8.6，电压不超过100V，否则影响检查效果。六、火箭电泳（一）原理 抗原在含有抗体的凝胶中进行电泳，在电场作用下，抗原向一个方向移动，在移动的过程中，逐步与凝胶中的抗体结合而沉淀呈火箭状。沉淀峰面积越大，说明抗原量越多，二者呈正相关，因此可用于抗原的定量测定。此法具有敏感性高、快速等优点。（二）材料与试剂10.05mol/L pH8.6巴比妥缓冲液配成2的琼脂。2抗原与抗体3其它材料同免疫电泳。（三）操作方法 1将2琼脂煮沸溶化后，放入60水浴箱中。 2将适量的抗体用0.05mol/L pH8.6巴比妥缓冲液稀释至琼脂同样的体积量，放入60水浴。 3将两者充分混合，立即倒成平板。4琼脂板冷却后在一侧打孔，孔径3mm，孔距6mm。5于孔内分别加入不同浓度的定量抗原。6电泳 孔端接负板。电流强度3mA/cm（或电压10V/cm），电泳时间2h10h。7停止电泳，将琼脂板于生理盐水中浸泡24h，中间换液数次。8染色、脱色、干燥同免疫电泳。9抗体最适量的测定 将已知抗原与抗体以不同浓度梯度进行方阵试验，找出所形成的火箭状沉淀线，轮廓清晰，前端尖窄而闭合的抗体最小量作为抗体的最适用量。10标准曲线的绘制 以抗体的最适用量制成琼脂板，分别用已知的不同浓度抗原（同一浓度的也必须做一批，以求平均值）进行电泳，泳毕后染色，测其沉淀峰的高度（或面积），然后以抗原量为纵轴，沉淀峰高度（或面积）为横轴，制成标准曲线。11对照组的设置 在测未知抗原的同时，必须设置已知标准抗原作为电泳对照。（四）结果判定 在已知标准抗原所形成的沉淀峰的高度，在许可的误差范围内，测其待测抗原所形成的沉淀峰的高度（或面积），然后从标准曲线中查出它们相应的抗原含量。（五）注意事项1抗原抗体的用量应当预试，抗原太浓，在一定时间内不能达到最高峰，抗体太浓，则沉淀峰太低而无法测量。预试峰的合适高度为2cm5cm。2用优质琼脂糖。3一定条件下，电泳时间要根据峰的形成情况而定。如形成尖角峰形，表示已无游离抗原。如呈钝圆形，前面有云雾状，表示还未到终点。4把琼脂板置于电泳槽上搭好桥，再加抗原，或启动电源后，电压极低时加样，以免造成基部过宽的峰型。七、圆盘电泳（一）原理 圆盘电泳即聚丙烯酰胺凝胶电泳。它是利用丙烯酰胺和双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合成大分子的凝胶物。它同时兼有分子筛和电泳效应。当样品通过凝胶进行电泳时，便可以根据其样品中各分子的电荷和分子量的不同而泳动出不同的区带。由于聚丙烯酰胺凝胶化学性质较琼脂稳定，很少带有侧基，在电泳过程中，吸附作用与电渗作用均小，所以该技术的分辨率均高于其它琼脂电泳技术。（二）材料与试剂120单体母液丙烯酰胺（Aorylamide） 19.60g双丙烯酰胺（N，Nmethylene Bisaerylamide） 0.40gH2O 加至 100.00ml2pH8.0 TrisEDTA缓冲液Tris（三羟基甲基氨基甲烷） 6.05gEDTA（乙二胺四乙酸） 1.17gH2O 加至 100.00ml3B三甲基胺基丙腈液（BDMPN） （Dimethylaminopropionitrile），原液于4冰箱保存。410过硫酸铵溶液 过硫酸铵 0.50g H2O 加至 5.00ml 现用现配或配后低温保存不超过一周。 50.025Mol/L pH9.0 硼酸缓冲液 硼酸 3.948g 硼砂 30.512g H2O 加至 1000.0ml 使用时取该液90ml加H2O至1 440ml，即为电泳液。（三）操作方法 1凝胶管的制备 取20单体母液3.60ml，TrisEDTA缓冲液1.20ml，加蒸馏水7ml，混匀，再加入BDMPN液0.05ml（约2滴），10过硫酸铵溶液0.15ml（约5滴6滴），混匀，倒入一端用橡皮薄膜封闭的小胶管内（注意不要产生气泡），上端留1ml空处，加蒸馏水至满，在灯光照耀下30min，使之聚合成凝胶。 2样品处理 取待测样品与对照样品各0.10ml，分别加0.5溴麝香酚兰指示剂一小滴，再加25蔗糖液0.10ml（约3小滴）。混合即可。 3加样 用毛细吸管吸弃胶管上的蒸馏水，缓缓加入已处理的样品于凝胶柱上，每种样品加一管，管的上端留出约0.50cm的空处。 4电泳 除去凝胶管下端的橡皮薄膜，将胶管装入电泳槽内，加入pH9.0的0.025mol/L硼酸缓冲液，液体必须没过胶管的两端。下端接正极，上端接负极，进行电泳。开始以1mA/管的电流，以后可以逐渐加至4mA/管，待指示剂电泳到离胶管下口约0.5cm时（一般约需40min），停止电泳。 5剥胶 取出胶管，用带有注射器的长针头插入胶管壁与凝胶柱之间注入蒸馏水以使凝胶脱出。 6染色 将剥出的凝胶柱浸泡于0.05氨基黑10B溶液中10min20min，用水冲洗，然后用7的冰醋酸液脱色24h，中间换液数次，至背景无色为止，最后浸泡于7的冰醋酸溶液中保存。（四）结果判定与标准品比较，根据区带的位置进行定性检查。（五）注意事项 1样品的离子强度、pH值尽可能与浓缩胶溶液相同，如含大量盐类时，应透析除盐。最适合的样品蛋白量是10g100g，加入样品量要少，血清样品3l5l，免疫球蛋白样品可加15l20l。 2凝胶柱面应平整，操作过程切勿产生气泡，否则电泳区带不整齐。 3电泳中电流应保持稳定，避免电流强度过高，而产生大量的热使分离失败。 4电泳开始，样品应于5min10min内进入凝胶柱内为佳。 5药品大部分有毒，应注意防护。 八、交叉电泳（一）原理交叉免疫电泳是把琼脂平板电泳和火箭电泳结合起来的一种方法。先将抗原样品在琼脂凝胶中进行电泳分离，然后使已分开的各抗原成分与原泳动方向呈90度角的方向泳向含抗体的琼脂凝胶中，于是该抗原样品中的各个抗原成分和它相对应的抗体依次形成若干锥形沉淀线，根据沉淀线的位置及面积（或高度）可确定该抗原的质和量。 此试验可以用来鉴定抗原，即与标准抗原抗体系统相比较，就可知待测样品中抗原的质和量。此法也可以鉴定抗体，把未知的含抗体的样品与标准抗原反应，所得的结果与标准的抗原、抗体反应结果比较，从而可以确定其中所含抗体成分及其滴度。（二）试剂及材料 1巴比妥缓冲液 0.05mol/L pH8.2。 21琼脂糖或优质琼脂 以巴比妥缓冲液配制。 3pH7.2 PBS液 4抗原 5抗体 6电泳仪、玻板、吸管、滴管等。（三）操作方法1取10cm10cm的洁净玻板，加1溶化琼脂糖10ml，铺匀、冷凝。2打孔，在距阴极端2cm，玻板边2.2cm处，打孔。3将一定浓度的抗原加入孔内，将抗原孔置于负极，电泳。电压10V/cm，泳动1h。4电泳结束后，切除非抗原电泳部分的琼脂（约6cm10cm）。5取上述1溶化的琼脂糖10ml放入60水浴中，加入预热的适当浓度的血清抗体迅速混匀，铺入切去的琼脂部分。冷却后，用不含抗体琼脂密封切口。 6将玻板与原电泳方向成90度角放置，使泳动后的抗原凝胶置于负极，电泳。电压为3V/cm，泳动10h20h。 7漂洗、染色、脱色、烘干。（四）结果判定 与标准抗原抗体锥形沉淀线比较，判定和分析结果。（五）注意事项1抗原抗体的最适稀释度必须事先摸索好。2第二次电泳时间的长短以观察锥形沉淀线的出现为准。电泳时间长短不一，短的可2h即出现。九、酶标对流免疫电泳（一）原理 利用酶标记抗原（抗体）和待测抗体（抗原）在电场中向一定方向移动，在比例适当的地方形成沉淀线，通过酶作用底物而显色，指示沉淀线的存在。该法的敏感性大大高于对流免疫电泳。 本试验以检测血吸虫抗体为例。（二）材料与试剂10.02Mol/pH 8.6巴比妥缓冲液 巴比妥 0.553g 巴比妥钠 3.503g 乳酸钙 0.512g H2O 加至 1 000ml20.1Mol/L pH7.0PBS（0.14Mol/L Nacl）30.2Mol/L pH7.6硼酸缓冲液 硼酸 10.510g 硼砂 2.860g H2O 加至 1000ml（三）操作方法 1酶标抗原的制备 用1ml血吸虫卵抗原（蛋白含量为1.5mg/ml2.0mg/ml）加入3mg4mg辣根过氧化物酶（蛋白质：酶=12），液体呈棕红色，然后在轻轻搅拌下，缓慢加入50l 1戊二醛，要求在5min10min内滴加完毕。置2025搅拌2h。装入透析袋，于1000ml、0.1Mol/L pH7.0PBS液4透析2天，并换液3次4次。取出酶标记物加等量纯甘油，使含50甘油试剂，即为酶标抗原。分装小瓶，存于-20中备用。 2琼脂凝胶板的制备 取优质琼脂，以0.02Mol/L pH8.6巴比妥缓冲液制成1琼脂，溶化后，置于玻片上，制成2mm厚的凝胶板。 3打孔加样 打6对孔，抗原孔径为0.30cm，抗体孔为长方形0.2cm1.1cm。抗原、抗体各加5l及50l。抗原用上述酶标抗原做120至130稀释。 4电泳 抗原孔置于负极，电压4 V/cm 5V/cm，电泳时间45min60min，电泳后，于蒸馏水中荡洗1min2min即可，用滤纸吸去水分，并用毛细吸管吸尽长孔及圆孔中的水液后，即可用底物的溶液显色。 5配制底物溶液，现用现配。将饱和联苯胺溶液，加等量pH7.6硼酸缓冲液，然后将上液9份和0.1过氧化氢1份相混，即为所需的底物溶液。 6免疫酶染色 将琼脂凝胶板置于培养皿中，缓缓倾入底物溶液，直至浸没凝胶板为止，置于室温或37，经1h2h用目测可观察反应结果。（四）结果判定 1阳性反应：在抗原抗体孔之间呈现明显的棕红色的线条。2阴性反应：不出现棕红色线条者。十、荧光免疫技术（一）原理 应用荧光素标记的抗体或抗原进行免疫沉淀反应，然后置于荧光显微镜下观察。此法有利于微量可溶性抗原的检查和鉴定。（二）材料与试剂配制1荧光素标记抗体（或抗原）2待测可溶性抗原（或抗体）3醋酸纤维膜（10cm2.5cm）40.05Mol/L pH8.2巴比妥缓冲液5洗涤液 pH10.0的巴比妥缓冲液。6液体石蜡（三）操作方法1取5l待测抗原进行膜电泳（见醋酸纤维膜电泳一节）电压6V/cm10V/cm，电流0.4mA/cm，电泳2h。2取下膜放入湿盒内，沿抗体槽的位置放一条含标记抗体滤纸条（约10l），在室温中孵育过夜。3去掉抗体纸条，将膜浸在洗涤液中1h。4流水中冲洗10min，置室温干燥。5干后浸入液体石蜡中使其透明10min。6用荧光显微镜观察荧光弧。十一、放射免疫对流电泳（一）原理将放射性元素标记的抗体（或抗原）与相应的抗原（或抗体）沉淀时，沉淀线通过自显影而证实。所谓自显影，就是通过复合物中的标记同位素在蜕变过程中放出的射线，作用于感光材料的卤化银晶体而产生潜影，再经过显影把“像”显示出来。这样，能检出肉眼看不见的沉淀线，从而提高反应的敏感性，这种方法可应用于凝胶中的所有反应。（二）材料1放射性同位素标记的抗原或抗体2X射线胶片或全色胶片3显影液与定影液4其它同对流免疫电泳（三）操作方法1按对流免疫电泳制备凝胶板并打孔。2加样 阴极端孔内加抗原，阳极端孔内加抗体。在加被检抗体样品时，迅速加入标记抗原（2 0003 000cpm），并使之混合，勿使抗原吸收后再加标记抗原，以免由于标记原的滞面而形成假阳性。3电泳 电流2.6cm7.5cm的小板用4mA。4电泳后，平板浸在3HCl中漂洗8h，换液2次。5用流水漂洗过夜。6干燥 室温或鼓风机吹干。7曝光 在暗室将胶片切成与平板一样大小，然后将药面密接凝胶面，再在胶片上压一张玻板，用黑布包严，皮筋扎紧，曝光时间与所用同位素及保存期有关。181I，一周内5h10h；12周内24h；23周内48h。125I，在2个月内10h。8冲洗 全色胶片冲片方法，水洗、20显影10min、水洗、定影、水洗、凉干，观察结果。（四）结果判定 在抗原抗体孔之间形成一条清晰的黑色影像者，判为阳性。十二、高压电泳（一）原理同普通电泳。普通电泳的电压一般为2V/cm20V/cm，电泳时间需1小时至数小时。电泳时间越长，扩散越严重。对于一些小分子的物质如核苷酸、氨基酸、多肽等，在常压电泳中，往往达不到分离的目的。高压电泳则能使分子量相近的物质充分地进行分离。在高压电泳中，电压可达到50V/cm200V/cm，高压电源达1 500V1 0000V，电流可达50mA400mA.电压越高，分离时间越短，所以在高压电泳中，一般只需较短的时间,数十分钟，有的甚至数分钟即可达到分离的目的。高压电泳广泛地用于核苷、核苷酸、氨基酸、多肽、糖、生物碱、有机酸等的分离。高压电泳中最大的问题是冷却，常用的冷却方式有三种，即固体冷却、液体冷却和气体冷却。其中以液体冷却设备简单、效果也好。液体冷却剂的选择必须遵循以下几点：与缓冲液互溶性小；不溶解样品；易从纸上除去；不以爆炸；蒸汽不是剧毒性物质。一般常用的冷却剂有甲苯、四氯化碳、液体石蜡、氯苯、正己烷、乙庚烷等。以甲苯冷却效率最高。（二）材料与试剂 10.05mol/L pH4.85柠檬酸缓冲液 25AMP、ADP、ATP，每种核苷酸溶液的浓度为5mg/ml。3AMPADPATP混合液。取上述三种核苷酸溶液等体积混合而成。4点样管、毛细管5新华1号滤纸6玻璃喷雾器7高压电泳仪8聚乙烯膜等（三）操作方法1剪纸 剪适当大小滤纸，一般为60cm10cm。2点样 点样的位置取决于样品的性质和缓冲液的pH，如不明确泳动方向，则点中线处。核苷酸在pH25均带负电荷，点靠负极一些。量为50g100g，要求分离后每个斑点在5g以上，否则在紫外灯下很难检查出来。点样时，样品越少越好，样品剂量较大时，可边点边用吹风机吹干，分数次点。注意勿伤纸面，不要把纸刮毛或弄皱。3电泳 以0.05Mol/L pH4.85柠檬酸缓冲液，用玻璃喷雾器将滤纸喷湿，然后将喷湿的滤纸夹在二滤纸之间，以吸去多余的液体。将湿滤纸夹在两张聚乙烯膜之间，该膜使滤纸与冷却板绝缘，将此“夹层”夹在两块冷却板之间，旋紧冷却板的螺丝。在滤纸两头与电极槽缓冲液之间用数层滤纸搭桥，将电泳仪上的安全盖盖好，把冷却板上入水孔用橡皮管连上。将电表头电压调至4 000V，此时电流为28mA30mA，相当于电势差66.6V/cm，电流2.8mA/cm30mA/cm，通电20min，断电。迅速取出滤纸，吹干。（四）结果判定 用紫外灯（波长260nm）观察滤纸上的核苷酸分离情况。参照核苷酸的移动位置，可以确定结合物（样品）中有何种核苷酸。也可以根据实验条件，先确定各种标准核苷酸的迁移率作为分析的依据。十三、等电聚焦电泳（一）原理 等电聚焦技术是一种根据样品的等电点不同而使它们在pH梯度中相互分离的一种电泳技术。 本法的分辩率极高，所以在进行等电聚焦电泳时，要求样品不能过于复杂，一般应经其他方法（如层析法）提纯后再进行等点聚焦，才能得到比较满意的结果。如利用人的纯IgG再经过等电聚焦电泳，可以满意地分离IgG的四个亚类。如IgG2浓缩于pH7.0的部位，IgG3浓缩于pH8.09.0的范围内，IgG4则浓缩于pH6.0以下的部位，而IgG则分布于全部pH范围，且只有IgG1能存在于pH9.0以上的部位。 等电聚焦电泳与其他分离方法结合起来，将是一项很有前途的分析鉴定和制备样品的好技术。（二）器材与试剂配制1聚焦柱 有成品出售，分110ml和440ml两种。2电源 0V1 200V可调20W的直流稳压电源。3载体两极电解质 市售25ml瓶装，浓度为40或20（W/V），pH范围为2.511，也有其它pH范围的，可根据实验条件选择购买。 4蔗糖（分析纯）1 电极液的配制见表2-2、2-3：表2-2 正电极缓冲液的配制正极在中心管内 正极在柱顶磷酸或硫酸0.05（0.2）ml或1（4）ml1Mol/L 酸溶液0.025（0.1）ml或0.5（2）ml1Mol/L 酸溶液H2O15（56）ml5（25）ml蔗糖11（44）g表2-3 负极缓冲液的配制负极在中心管负极在柱顶氢氧化钠0.1（0.4）g或1（4）ml0.05（0.2）g或0.5（2）ml2Mol/L 溶液2Mol/L 溶液蒸馏水14（56）ml5（25）ml蔗糖11（44）g此配制用量为最大用量，一般用1/5的量即可。括号内为440ml聚焦柱型号所用量配方。 6重、轻液的配制与混合重、轻液的配制：配制方法见表2-4：表2-4重、轻液的配制方法110ml柱440ml柱载体40（ml）水及蛋白质溶液（ml）蔗糖（g）重液 1.93726轻液0.651.5重液7.6148104轻液2.4206 此表为梯度混合器所用量，如用手工混合法则应相应适当增加20。 重、轻液的混合：有条件的可采用梯度混合器装柱。手工混合法操作如下：取24支试管（440ml聚焦柱则应取46支试管）按2-5表各加入重、轻液，充分混匀。试管号重液（ml）轻液（ml）试管号重液（ml）轻液（ml）1234567891011124.64.44.24.03.83.63.43.23.02.82.62.40.00.20.40.60.81.01.21.41.61.82.02.21314151617181920212223242.22.01.81.61.41.21.00.80.60.40.20.02.42.62.83.03.23.43.63.84.04.24.44.6 表2-5 重、轻液的混合方法（二）操作方法1决定电极的极性 如pH梯度范围在6以下时，则聚焦柱底的电极为正极。如pH梯度的范围在6以上时，则柱底为负极。原因是蔗糖浓度越大，电导越小，所以在等电点pH67的载体处，应该避免蔗糖浓度最大的部位。 2装柱 按电极的极性与电极液的要求装柱。将聚焦柱垂直放置，先注入底部电极液，打开中心管下端的活塞，从中心管上端，用带长胶管的注射器注入电极液，使液面在中心管下部开口处之上达1cm处即可。 3注入载体溶液 加完后应使电极液仍浸没中心管的下部开口，不使电极与载体溶液直接接触。 4加重、轻混合液 从1号试管加起，用注射器沿管壁缓缓加入，