第二章 细胞生物学研究方法.doc

第二章 细胞生物学研究方法【教学大纲】1.掌握普通光学显微镜基本原理和使用方法2.掌握细胞组分的分离分析方法3.掌握常用的细胞化学分析法的原理和操作技术4.了解细胞生物学现代技术【复习纲要】细胞生物学是实验科学，它的很多成果都是通过实验才得以发现和发展的。许多细胞生物学的重要进展以及新概念的形成,往往来自新技术的应用。因此,细胞生物学研究方法是使细胞生物学不断发展的前提与推动力量。现代细胞生物学研究方法主要分四大类：显微技术、细胞组分分析与原位检测技术、细胞培养与细胞工程技术和分子生物学技术。1显微技术是细胞生物学最基本的研究技术, 包括光学显微技术和电子显微技术。光学显微技术中常用的普通光学显微镜是利用光线照明，将微小物体放大影像的光学仪器，是普遍使用的重要工具。荧光显微镜是利用一定波长紫外线作为激发光源照射标本，使标本中的荧光物质受激发后产生荧光经放大成像。相差显微镜是利用相差装置将透过细胞标本不同区域的光波的光程差变成振幅差，从而使细胞内的各种结构之间呈现出清晰可见的明暗可比的特殊光学显微镜。暗视野显微镜适于观察活细胞或微粒的存在及运动状态。共焦激光扫描显微镜可用于观察活体组织如胚胎、大脑皮层内微循环及细胞内复杂网络如内质网膜系统、细胞骨架系统的三维结构等。电子显微镜是研究亚显微结构的主要工具。电镜和光学显微镜的成像原理不同，它是以电子束代替了光源，电磁透镜代替光学显微镜的聚光镜、物镜和目镜。电子束在不同的电压下有不同的短波长，其波长比可见光短得多，所以电镜的分辨率要比光镜的分辨率大1000倍。现在电镜的类型很多，有透射电镜、扫描电镜、超高压电镜、分析电镜、扫描隧道电镜等。2. 细胞组分分析与原位检测技术是研究细胞组分的性质、结构和功能的重要手段。它包括细胞组分分级分离技术、放射自显影技术、细胞化学技术与原位杂交技术等。细胞组分分级分离（cell fractionation）技术是研究细胞内细胞器和其它各种细胞组分的化学性质和功能的一种主要方法。细胞内各种结构的比重和大小等都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同。根据这一原理，常用不同介质和不同转速的离心，将细胞内各种组分分级分离出来，即细胞分级分离法。包括：差速离心和密度梯度离心。细胞分级分离技术已得到广泛的应用，如研究亚细胞结构，各种物质代谢，追踪一些物质分子代谢途径和分布以及物质分子性质和定量等。此方法主要分为匀浆、分级分离和分析三个步骤。放射自显影技术（autoradiography）是细胞生物学中最重要的技术之一，它可确定放射性化合物在细胞和组织中的部位。此技术是利用放射性同位素所放射出来的射线作用于感光乳胶的卤化银晶体，从而产生潜影。再通过显影把感光的卤化银还原为黑色的金属银颗粒。根据感光乳胶上银粒所在的部位和黑度，来判断样品中的放射性物质分布的位置和强度。放射自显影术具有定位精确、灵敏度高、操作简便、可供定量等优点。它能较准确地反映出细胞、组织和器官机能代谢状态，因而能很好地把细胞、组织和器官的生理机能、生化代谢、增殖和细胞结构的形态学改变极为紧密地结合在一起，从而揭示细胞分子水平的动态变化，使之成为显微镜下可见的形态，并可精确地给以定位和定量分析。细胞化学技术是利用某些化学试剂与细胞内某些物质发生化学反应，在局部产生有色沉淀物，从而判断某种物质在细胞中的分布和含量。原位杂交技术可以提供更精确的信息，现已成为非常重要的研究手段。3. 细胞培养与细胞工程技术是细胞生物学研究方面十分重要的技术。细胞培养（cell culture）是从活体中取出的细胞或其他建系细胞，在体外一定条件下培养，使之能继续生存、生长，甚至增殖的一种方法。此技术不仅可提供大量性状相同的细胞作为研究材料，并且也为研究细胞的遗传性状的改变提供了可行的实验条件。体外培养的动物细胞可分为原代细胞（primary culture cell）和传代细胞（subculture cell）。原代细胞是指从机体取出后立即培养的细胞，此首次培养为原代培养（primary culture）。一般把培养的第一代细胞与传10代以内的细胞统称为原代细胞培养。传代细胞是指适应体外条件下继续传代培养的细胞。将原代培养的细胞从培养液中取出，以1：2以上的比例扩大培养，此培养为传代培养（secondary culture）。用这种方法培养，可以重复传代4050次。细胞培养的方法很多，根据是否贴附于支持物上生长，可分为贴附型与悬浮型两类。细胞工程技术是细胞生物学与遗传学的交叉领域，主要利用细胞生物学的原理和方法，结合工程学的技术手段，按照人们预先的设计，有计划地改变或创造细胞遗传性的技术。包括体外大量培养和繁殖细胞，或获得细胞产品、或利用细胞体本身。主要内容包括：