壳蛋白免疫法测定重组腺病毒滴度的方法学评价.doc

壳蛋白免疫法测定重组腺病毒滴度的方法学评价?830?文章编号10004718(2005)04083003中国病理生理杂志ChineseJournalofPathophysiolob,)一!21?实验技术?壳蛋白免疫法测定重组腺病毒滴度的方法学评价*张艳玲2,刘然义,柯妙拉,陈洁敏,李晓红,叶春玲,黄文林(?中山大学附属肿瘤医院619室,广东广州510059;暨南大学药学院药理学教研室,广东广州510632)摘要】目的:介绍壳蛋自免疫法hexoninmaunoassay),并同传统细胞病变(c陋)法比较,检测其可靠性和可重复性.方法:3种重组腺病毒(Adlacz,AdhEndo和d/1520)扩增,提纯后,用壳蛋白免疫法,CPE法测定病毒滴度及Az6o值法测定病毒总颗粒数.结果:壳蛋白免疫法和CPE法同时测定3种同批次病毒滴度,结果一致,P>0.05:对不同批次3种腺病毒滴度测定,结果仍相似,平均差值牙S=0.15270.3270,P>0.05,两法有很好的相关性,r=0.913;壳蛋白免疫法对同批d/1520测定19次,变异系数仅为1.42%.结论:壳蛋白免疫法是测定腺病毒滴度的有效方法,系统误差小,重复性好,结果客观可靠,可避免CPE法中由于细胞退化和工作人员主观判断造成的系统误差,比CPE法更精确,更省时.关键词腺病毒;壳蛋白免疫测定KEYWORDSAdenovirus;Hexoninanunoassay中图分类号R363文献标识码A重组腺病毒在基因治疗领域中具有广阔应用前景.已在囊性纤维化和癌症基因治疗中作为目的基因载体,如成胶质细胞瘤,成神经细胞瘤,黑色素瘤以及恶性乳腺癌,结肠癌,头颈癌,肝癌等LlJ.随着腺病毒载体广泛应用,急待建立快速准确的腺病毒滴度测定方法.目前有许多测定重组腺病毒滴度的方法,如荧光法,A26o法,细胞病变(cpE)法和空斑法L2J.传统的腺病毒滴度测定方法包括作用于单层细胞的CPE法和空斑法,均属于生物学方法,需要1014d甚至更多的时问.A260法是一种物理学方法,仅耗时约1h,但测定的是病毒DNA和蛋白质总浓度,无法区分有感染作用和无感染作用的病毒颗粒.通过检测293细胞中病毒六联体壳蛋白的特异性反应可定量测定具有感染活性的病毒颗粒,耗时约52h.其结果同标准CPE法有一定的可比性,但比CPE法省时问.材料和方法1细胞培养整合有腺病毒E1区基因的永生化人胚肾细胞系293细胞,用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养.2病毒重组腺病毒152o,AdhEndo,Adlacz在293细胞中扩增,然后用氯化铯密度梯度法纯化.纯化后的病毒保存于一80.3劫法梯度稀释病毒(50病毒+450溶剂),测260nln吸光值.最后计算病毒滴度:腺病毒颗粒/mL=A值稀释倍数1012.4壳蛋白免疫法首先按10倍梯度稀释病毒,准备10.一10I76个稀释度的病毒.然后用293细胞铺12孔培养板,不必细胞贴壁,直接加入同体积各稀释度病毒.37培养48h.第3d,用抗壳蛋白抗体,共轭辣根过氧化物酶二抗和DAB进行免疫组化染色.被感染的细胞呈褐色,很容易与非感染细胞区分.病毒滴度通过计数特定区域中阳性细胞数获得,以感染单位/mL(WU/mL)表示,每个被染色的细胞对应一个感染单位(IFU).r(IFU/mL)=一(i.nfectevidmscell(smL/fie)ld)(x(fie.1ds/wel1)vOltllnedilutionmctorjVlms,mLJ5CPE法用293细胞(每孔lO4个)种96孔板,培养约24h,细胞贴壁并形成均匀单层.准备10一109个稀释度的病毒,每:tLll50止病毒,每列一个稀释度,共9列.余下3列加入培养液,作为空白对照.然后在37,5%C02培养10d.每天显微镜下观察细胞病变情况.记录每一列病变情况,用ReedMuch公式【4J计算.6统计学处理所有数据以牙S表示,结果用双测StudentSt检验比较差异显着性.结果1A260法测得3个重组腺病毒Adlacz,AdhEndo,d/1520的总病毒颗粒数分别是(1.820士0.o9o)x10VP/mI,(3.3900.007)102vP/rrlL,(2.3400.002)102vP/rrlL.2CPE法和壳蛋白免疫法细胞形态学观察由于CPE法和壳蛋白免疫法都是靠眼睛计数,所以形态收稿El期20030904修回El期2003一l1一o6*基金项目广东省自然科学基金资助项目(No.021810);广东省医学科研基金资助项目(No.A2(X)227)通讯作者Tel:O2O一85225631;02087343146特征对滴度铡定是非常重要的.细胞病空是予代病毒在感细胞中过唰繁殖引起的.当病毒颗粒堆视时.感橐鲴胞脱壁黼曲申状在培养摹中漂浮但当病毒浓度降1珏时,病亚程度碱弱,形态特征不明显(iA一1E).而在壳蛋白免疫法中,阳性细胞量褐色.无论病毒敬多少都根容易计敦每一个色细胞代表一个感染单位(mI).(罔从2E)薹1.童?画,:锂皇-_!l_,固FigIFildsofcopathieccctHEK293ccjnfcIwithdifIcntdilutionsofdJ1520wss0bcdby口ha8【lcI4daYSancrInctionAeytopamiceffectwasevident1nAandB(+一,一),adnotcvidemmCandD(Ethe1)图1细胞病变丹态掌特祉gledsoIIex0niilluJlusvposltlvIlDillorntdilutionsof1520weedIoinfectIqEK293celandthetderswcmeasuredbytlIeIteonulludsd2d1iJIjl川AcyttlpaLhicB恤vncAldR(1010),the10and10dilutioslCDouldprovidethefield.eIlsmullidealmrcounting罔2壳蛋白免疫法中阳性钢胞形态学特征J一?832?3CIE法和壳蛋白免疫法灵敏度比较用CPE法和壳蛋白免疫法对3种重组腺病毒(同一批次)的滴度进行多次重组测定(Adlaez,l=4;dl1520,l=5;Adl1Dx玉0,l=4),两种方法所得结果(图3)基本一致(尸>O.05),说明这两种方法灵敏度相似.1412Ad.1aczd/I520AdhEndoFig3”literdebe田h嘞nimmmassayc0玎a由ed讪诎t=I】Eas明.Adla,dl1520,Adl】ade耵吱0d【sweIeassayedbym段同】rillgheonexpression(rapidt盯m)越ldePEassay.P>0.05CPE.Adlaczdifferenis:一0.63000.2954,l=4;dl1520dif-ftenoeis=一0.096o0.1280,l=5;Aaldair-ferenceis=0.10670.0296,l=4.图3壳蛋白免疫法和a法测定滴度结果相符4a法和壳蛋白免疫法检测不同批病毒滴度的结果比较通过对2l批病毒应用2种方法同时检测的结果统计,2种方法检测结果相差的平均值is为0.15270.3270,尸>0.05.统计每次试验的2种方法结果计算相关系数,r=0.913,尸<0.01,说明2种方法有很好的相关性.因为我们用3种不同的重组腺病毒,所以说明我们的方法与载体携带的基因无关.5壳蛋白免疫法的重复性应用壳蛋白免疫法对同一批腺病毒dl1520滴定19次.结果,置s=9.745l60.1311396,CV%=1.42%.证实免疫壳蛋白法系统误差小,可重复性好.讨论研究资料描述了用壳蛋白免疫法检测感染E1区缺陷型腺病毒细胞中病毒蛋白表达的可行性.这种快捷而简便的酶联免疫法可用于检测任何E1区缺陷腺病毒,此病毒因缺乏E1基因,只能在导人到整合有E1区基因的宿主细胞中才能进行复制.E1基因表达产物激活一些病毒蛋白表达,其中的壳蛋白的表达表明腺病毒已感染宿主细胞并开始复制,此为壳蛋白免疫法这一快速效价测定法的基础.此法只需约52h,受感染细胞为棕色,很容易和未感染细胞区别开来(图2A一2E).感染细胞壳蛋白的表达很明显是病毒复制清晰的指示,也是一个用以快速检测的生物活性标识.因为在传统的CPE法出现细胞病变前的一个星期或更早,六联体壳蛋白就可以被稳定的检测出来.用壳蛋白免疫法测腺病毒效价确切可靠.在对比分析该法和CPE法,所获的结果相似(图3),关联性很大.CPE法要求客观无偏差地评判细胞病变效应,但往往易受主观因素的影响,因而不稳定,降低了精确度.从结果中可见这种快捷方法具有可靠性和可重复性.我们发现cPE法和壳蛋白免疫法所测得的这些载体的滴度与其携带的基因类型无关.美国FDA建议临床治疗用腺病毒的总颗粒数与有感染作用的颗粒数比值应当100.Mittereder等L5J证明,腺病毒总颗粒数与有感染作用的颗粒数的比例对维持最佳感染水平起重要作用.建立快速测定腺病毒生物学滴度的可靠方法为准确提供重组载体最大可能性活力指标所必须.我们用A抽测定3种病毒总颗粒数,用ePE法和壳蛋白免疫法测得生物学滴度.计算得出AdlaeZ,Adl1E|x玉0,dl1520总颗粒数和lE法测得的有感染作用的颗粒数比值分别为1113.4,553.7和24.5,与壳蛋白免疫法测得的有感染作用的颗粒数比值分别为143.4,2362.5和30.6.获得病毒生物学活性一致性的重要因素是病毒对细胞的作用时间保持一致L5,当比较CPE和壳蛋白免疫法两种方法时或者是多次参照标准测定时均须注意此点.通过壳蛋白免疫法仔细地检查宿主细胞中壳蛋白表达能够使研究者鉴定病毒结构,生产最有效治疗用的病毒.通过壳蛋白法监测壳蛋白提供一个早期测定病毒感染活性的方法,比其他生物学方法节省12周时间.这可能对腺病毒从实验室走进临床发挥治疗作用具有重大意义.参考文献】【1MarcelT,GrauJD.TMCwoddWicIegenetk拍py衄.rdlmerelrt,eM1996J.HumGeneTrier,1997,8(6):77580o.2ttittDe,B00tlIJL,DaniV,eta1.Aflowcyt伽Iecprotocolfortitteringec唧bi哪吐adena_ntlv朗t螂伽mI1g咖fluorescentproteinJ.1VldBioteell,2000,14(3):197203.3DavidT,CurielT,AlvalS,eta1.AdeIl0vi珈seIIIlare.merit0f的璐一y1y一mediatedg