DNA双链断裂损伤修复系统研究进展.doc

dna双链断裂损伤修复系统研究进展生理科学进展2007年第38卷第4期?综述?dna双链断裂损伤修复系统研究进展米黄敏缪泽鸿丁健(中国科学院上海药物研究所国家新药研究重点实验室肿瘤药理组,上海201203)摘要多种内源或外源因素都能造成细胞基因组dna损伤,细胞内建立了复杂的修复系统来应对不同形式的损伤.其中dna双链断裂(dnadoublestrandbreaks,dsbs)作为最严重的损伤形式,主要激活同源重组修复(homologousrecombinationrepair)和非同源末端连接(nonhomologousendjoining)通路.这两条通路都是由多个修复元件参与,经过多步反应的复杂过程.两者各具特点,协同作用,共同维护细胞基因组的稳定性.对其分子机制的阐明为肿瘤放化疗的辅助治疗提供了潜在的作用靶点.关键词dna双链断裂;修复通路;同源重组修复;非同源末端连接中图分类号r96repairpathwaysinresponsetodnadouble-strandbreakshuangmin,miaozehong,dingjian(divisionofantitumorpharmacology,statekeylaboratoryofdrugresearch,shanghaiinstituteofmateriamedica,chineseacademyofsciences,shanghai201203,china)abstractdnadoublestrandbreaks(dsbs)aretheprincipalcytotoxiclesionscausedbymanyexogenousandendogenousfactors.inresponsetodsbs,cellshaveevolvedcomplexandhighlyconservedsysterns,whichmainlyconsistofhomologousrecombinationrepair(hr)andnonhomologousendjoining(nhej)pathways,toeffectivelyrepairthelethallesions.thetwopathwaysplaycrucialrolesinpreservingthegenomicintegrity.here,weprovideanoverviewofdetailedprocess,concernedmoleculesandregulatoryfactorsinthesepathways.accumulatedknowledgeofdsbsrepairmayofferopportunitiestodevelopmoreeffectivetreatmentsforcancer.keywordsdnadoublestrandbreaks:repairpathways;homologousrecombinationrepair;nonhomologousendioiningdna作为细胞生命活动最重要的遗传物质,保持其分子结构的完整性和稳定性对于细胞的存活和正常生理功能的发挥具有重要意义.包括电离辐射,化疗药物及细胞代谢产物在内的多种外源和内源性因素都能引起不同形式的dna损伤,其中dna双链断裂(dnadoublestrandbreaks,dsbs)作为最严重的损伤形式,使细胞正常生命活动的维持乃至生存都受到了严重威胁.同时,细胞也建立了一套复杂而精确的调控机制来应对这些损伤,包括激活细胞周期检查点(checkpoint),启动修复系统及诱导细胞凋亡等.其中,修复通路的激活对于保持细胞基因组的完整性具有非常重要的意义,修复通路中一些重要元件的功能缺失往往会增加基因突变和发生肿瘤的几率;另一方面,很多传统的抗肿瘤药物包括烷化剂,dna嵌入剂,拓扑异构酶抑制剂,抗代谢物等都是通过直接或问接造成不同形式的dna损伤来实现其抗肿瘤作用的,修复通路的激活与化疗药物的耐药性密切相关.因此,对细胞修复机制的研究对于了解肿瘤的发生发展以及治疗都有重要意义.在外界刺激的作用下,细胞能启动六条修复通路来分别应对不同形式的损伤:(1)直接修复(directrepair,dr)通路,修复o6一烷基鸟嘌呤引起的损伤;中国科学院知识创新工程项目资助课题(ksx1一sw一116)通讯作者(2)碱基切除修复(baseexcisionrepair,ber)通路,针对氧化还原或烷基化引起的碱基损伤;(3)核苷酸切除修复(nucleotideexcisionrepair,ner)通路,修复辐射,化学药物或蛋白一dna交联引起的核苷酸水平的损伤;(4)碱基错配修复(mismatchrepair,mmr)通路,纠正错配碱基;(5)同源重组修复(homologousrecombinationrepair,hr)和(6)非同源的末端连接(nonhomologousendjoining,nhej).其中,后两条通路专门修复dsbs损伤.这两条通路协同作用对保持细胞基因组的稳定性发挥着致关重要的作用,本文主要就hr和nhej通路的最新研究进展做一综述.一,诱发dna双链断裂(dsbs)损伤的因素及其特点(一)外源性因素1.电离辐射(ionizingradiation):x射线,射线等电离辐射通过不连续的电离作用或电离产生的自由基破坏dna结构.与化学药物相比,电离辐射产生的损伤穿透力强,不受亚细胞结构的影响,并且发生速度极快,只需要几个微秒.电离辐射导致的dna损伤的另外一个特点是损伤形式的多样性,包括碱基和核苷酸水平的损伤以及dna链断裂等,其中dsbs是电离辐射所致的最主要损伤形式(ei仟er等.2000).2.拟放射药物(radiomimeticagent):拟放射药物,如博来霉素也能直接导致dsbs,其作用和电离辐射及氧化损伤非常相似.拟放射药物产生的损伤有一定染色体特异性,在个别染色体上产生的几率明显增加.3.拓扑异构酶毒剂:拓扑异构酶i和i1分别具有切割单链和双链dna的活性,引起自发的dna单,双链断裂,但正常情况下这些断裂都是可逆的,能被拓扑酶自身连接闭合.靶向拓扑异构酶i和ii的毒剂能通过稳定拓扑酶在催化过程中与dna形成的可切割复合物(cleavablecomplex),造成不可逆的dsbs.其中拓扑异构酶i毒剂形成的dsbs依赖于dna复制过程,特异地作用于s期细胞;而拓扑异构酶ii毒剂直接阻碍dna双链的连接过程,造成dsbs(nitiss等.1996).与电离辐射和拟放射药物不同的是,拓扑异构酶毒剂捕获可切割复合物时并不是随机地作用于dna的任何位置,往往有一定的切割位点.(二)内源性因素除了上述外源性因素,和许多大分子一样,dna分子在细胞代谢过程中容易被生理科学进展2007年第38卷第4期水解,氧化及非酶促性甲基化等(lindahl等.1993),这种因细胞内环境导致的dna分子的不稳定性也是造成其损伤的一个重要原因.另外,细胞在正常生命活动如基因重组,复制中也能自发产生dsbs.1.氧化损伤:细胞摄人的氧经细胞代谢后有约1%被转换为以超氧阴离子,羟自由基和过氧化氢为主要形式的活性氧,活性氧能在碱基,核苷酸,单链和双链等多个水平导致dna损伤(slupphaug等.2003).2.v(d)j重排:v(d)j重排是淋巴细胞成熟过程发生的一种特定的dna重排.淋巴细胞特异的ragi和rag2蛋白能识别特异的重组信号序列并在该位置产生dsbs,随后断裂末端由一些修复蛋白进行处理和连接.v(d)j重排产生的dsbs不同于电离辐射,前者一般发生在特异的位点而后者是对整个基因组的随机损伤,但是两者由共同的修复蛋白进行dsbs修复(gellert等.2002).3.dna复制(replication):细胞dna复制过程是自发产生dsbs的最重要来源,据估计人的细胞中平均每个周期约产生1o个dsbs.如此高的发生几率,主要是因为dna复制叉的前进可被多种原因产生的单链断裂阻碍,造成继发的dsbs.这种因复制受阻产生的dsbs特异的发生于s期细胞并且只激活hr通路.上述多种因素引发的dsbs能激活共同的下游信号分子,其中特别值得一提的是组蛋白h2ax的139位丝氨酸磷酸化(h2ax)j.h2ax磷酸化是dsbs发生后最早期的事件之一,在损伤发生后的几分钟内,细胞核内就能检测到散在的i-i2ax灶(h2axfoci).h2ax灶的形成依赖于磷脂酰肌醇-3一激酶h3kk家族的atm,atr以及mrn复合物和brca1等,能稳定修复复合物并促进其与dna损伤位点的结合(celeste等.2003).目前,h2ax的水平已经成为公认的dsbs发生早期的标志,为dna损伤和修复的研究提供了比较理想的指标.二,dsbs修复通路同源重组修复和非同源末端连接是修复dsbs的两条主要通路.(一)同源重组修复(hr)通路1.hr的过程:hr的分子机制最早在细菌(e.coil)和酵母(s.cerevisiae)中被阐明,在哺乳动物中保守.hr需要有一个与损伤区域的dna序列具有高度同源性的完整双链dna分子作为模板,其中生理科学进展2007年第38卷第4期首选的模板是损伤分子的姐妹染色单体(johnson等.2000).hr的主要过程可分为:(1)dna损伤位点的加工处理;(2)链侵入和修复性合成;(3)holliday联结的形成与解离j.其过程简述如下(图1):首先由细胞中的核酸外切酶,如mre11/rad50/nbs1(mrn)三元复合物中的mre11对dna断裂末端进行5一3方向的切割加工,暴露出3单链dna末端,后者与若干个复制蛋白a(repli.cationproteina,rpa)分子结合,起到稳定并保护dna单链,防止形成二级结构的作用(jackson等.2002).hr修复的关键步骤是rad51依赖性链侵入过程.rad51是大肠杆菌reca在真核细胞中的同源物,具有dna依赖的atpase活性,是hr修复通路的核心分子,催化同源序列的寻找,链配对和链交换过程.rad51竞争性置换3单链dna末端上结合rpa分子,并覆盖在暴露的dna单链上,形成“核蛋白丝”(nucleoproteinfilament)(stauffer等.2004).rad51引导核蛋白丝识别同源dna模板并催化dna链的配对,延伸,形成holliday联结(hollidayjunction),完成链交换过程.holliday联结经核酸酶和连接酶切割和再连接后解体,得到两个完整的双链dna分子.dsb锿lrad50/mrei15.一3切割inbs1复合物l二厂聚合_,4的lid形ay成结lh.i的lid解ay体l结图1同源重组修复(hr)通路的基本过程2.参与hr调控的重要分子:除上文中提到的直接参与hr的分子,还有多个分子对hr通路起着重要的调控作用,如atm,atr,brca1,brca2,p53,cabl和chk1等.(1)atm和atr:atm基因最早发现于共济失调性毛细血管扩张综合征(ataxiatelangiectasia,at)患者,atm的突变是直接的发病原因.atm缺失细胞株具有染色体不稳定,对电离辐射敏感,细胞周期阻滞缺陷等特征(kitagawa等.2005).atr是at和rad3(ataxiatelangiectasiaandrad3.related)相关型蛋白.两者同属pi3kk家族,是调控细胞dna损伤激活的各条信号通路的核心分子,能够识别损伤并通过磷酸化下游分子如h2ax,smc1,chk1,chk2,p53,fancd2等激活多条信号通路.hr通路被激活时,细胞内能检测到明显的rad51灶(rad51foci),被认为是rad51激活的表现.atm功能缺失的细胞在发生dna损伤时不能及时形成rad51灶(morrison等.2000).复制依赖的dsbs主要激活atr,后者通过磷酸化chk1调控rad51的激活进而影响hr修复系统的效率j.atm和atr同等重要,但两者的功能各有侧重:atr具有比atm更广的损伤应答范围.atm几乎专一地作用于dsbs的应答,而atr对于uv和dna复制阻碍诱导的损伤都可产生应答;在dsbs激活的两条通路中,atm都有重要作用,而atr只与hr通路密切相关.(2)brca1和brca2:brca1和brca2是和乳腺癌发生密切相关的抑癌基因(nathanson等.2001),在hr通路中发挥重要作用(venkitaraman等.2002).dsbs发生时,brca1,brca2和rad51共同定位于dna末端,激活rad51介导的hr通路.brca1和brca2的缺失会显着抑制hr的效率,增加细胞对dna损伤药物的敏感性(jasin等.2002).brca2通过调控rad51核蛋白丝的组合和解体来影响hr通路.brca2的突变会增加在dna重复序列区域hr修复的错误几率(tutt等.2001);而brca1则是通过与hr修复中必须的mrn三元复合物作用来调控该通路(wu等.2000).brca1能直接与dna结合,抑制mre11的核酸外切酶活性,影响hr修复过程中形成的3单链dna末端的长度和稳定性j.(3)p53:p53是人类肿瘤中突变频率最高的抑癌基因,其表达产物p53蛋白是细胞中最重要的转录因子之一.在细胞受到外界刺激时,p53蛋白能影响一系列基因的转录水平,从而调控包括细胞周期阻滞,细胞凋亡等的多条通路(levine等.1997).然而,研究发现p53能以非转录依赖的方式抑制hr通路,主要通过与rad51直接结合,抑制rad51介导的链侵入过程j.且p53与rad51修复复合物的作用依赖于其15位丝氨酸磷酸化(restle等.2005).除了与rad51及其同源物作用外,p53还能和rpa直接作用,抑制rpa和单链dna的结合(romanova等.2004).另外,最新的研究表明,这种非转录依赖的方式并不是p53调节hr通路的唯一方式,ariaslopez等发现p53能够结合于rad51基因的启动子区域,下调rad51的mrna和蛋白水平,同时还能抑制rad51灶的形成j.因此,p53能以转录和非转录方式抑制dsbs激活的hr修复通路,在hr通路的调节中起重要作用.(二)非同源末端连接(nhej)修复通路nhej是指dsbs处两端的dna在一些修复元件的参与下直接连接的修复过程,该通路在从细菌到哺乳动物的进化过程中高度保守.1.nhej的过程:该过程大致可分为三步:(1)首先,一些特异的末端结合因子结合于dsbs处,保护dna不被核酸酶降解,以确保遗传信息不被丢失;(2)dsbs两末端结合的蛋白通过相互作用使断裂端相互靠近,是nhej修复关键步骤;(3)相互靠近的dsbs两末端通过dna连接酶直接连接或经加工处理,如除去dsbs末端的磷酸蛋白后被连接(图2).2.参与nhej的主要分子:dna依赖性蛋白激酶dnapk是由催化亚基dnapkcs和两个辅助因子ku70和ku86组成的全酶,是参与nhej修复的最主要分子.dnapk和mrn复合物,dna连接酶iv,xrcc4等多个分子共同参与了nhej修复过程.(1)dnapkcs:dnapkcs蛋白激酶与atm,atr同属pi3kk家族,能够直接与dsbs损伤处的单链dna区域结合,激活自身的丝/苏氨酸激酶活性(martensson等.2002).已有大量证据表明,dna.pkcs的激酶活性是nhej修复所必须的,但是目前在体内还未找到dna.pk的直接底物.近年来的研究发现,dsbs能引起dnapkcs2609到2647位氨基酸区域中6个邻近的氨基酸位点进行自磷酸化,从而影响了整个复合物分子的构象变化,有利于dna两断裂端的靠近和连接.对这些磷酸化位点生理科学进展2007年第38卷第4期进行突变后会明显影响nhej的修复效率,增强细胞对电离辐射的敏感性.新近的实验证实,dna.pkcs的自磷酸化能够促进dna.pk分子对dsbs断裂末端的处理,但与连接过程无关.bdsbs舶识别dstas束蛾的处理.舶合威,l菇连接i,iidsbs修蟹i完成t图2非同源末端连接(nhej)的修复过程(2)ku70和ku86:ku蛋白是由ku70和ku86组成的异二聚体,从酵母到哺乳动物高度保守.分子水平的实验发现ku蛋白能非特异地结合于dna断裂处,通过对其晶体结构的研究发现单体ku蛋白或其异二聚体并不直接与dna的碱基或核糖磷酸骨架结合而是与dna的大沟和小沟的空间结构发生作用.dsbs发生时,ku蛋白首先以异二聚体的形式与dna结合,在断裂处行成一个环状结构,招募dnapks分子与dna结合.另外,环的内侧排列着带正电荷的氨基酸,能够与带负电的dna链作用,将dna双螺旋固定在一个特定的位置,有利于dna断裂端的处理和再连接(walker等.2001).值得注意的是,越来越多的证据表明ku蛋白的功能并不限于nhej修复通路.例如,dna.pkcs缺失的小鼠外观与正常小鼠非常相似,但是ku蛋白缺失(ku./.)的小鼠体型偏小而且表现出过早衰老的症状(ferguson等.2001).这一现象提示ku蛋白在修复机体的自发损伤中具有重要作用,功能可能比dnapkcs更广泛.另外,ku蛋白对于染色体末端端粒的维持也有重要作用(hsu等.1999).最近的研究为ku蛋白在dna修复以及端粒维持中双生理科学进展2007年第38卷第4期重作用提供了结构基础,证实ku70和ku86分子表面的两个一螺旋结构与其双重功能密切相关.ku蛋白与dna结合时,ku70表面的o【一螺旋趋向于dna断裂端,同时ku80表面的o【一螺旋结构会转向内侧,靠近端粒染色体(ribeszamoar等.2007).(3)其它分子:除了上述提到的dnapkcs和ku蛋白以及研究较多的dna连接酶v,xrcc4外,最近的研究表明h2ax,atm,53bp1,mrn复合物以及artemis蛋白都参与了nhej修复通路(moshous等.2001).其中artemis蛋白发现较晚,其功能缺失后细胞对电离辐射的敏感性增加.研究发现artemis能和dnapkcs直接作用,被后者磷酸化激活,其活性也依赖于atm,主要功能是作为核酸酶处理加工dsbs的dna末端.3.非经典nhej修复通路聚腺苷二磷酸核糖聚合酶一1(parp一1)介导的nhej通路:除了上述经典的nhej修复通路,最近几年来的研究发现,在哺乳动物细胞中可能存在着另一条由parp一1和xrcc1/dna连接酶介导的nhej通路,称为nhej的后备通路(bnhej).parp一1是在高等真核细胞中广泛表达的核酶,参与dna单链损伤修复以及核苷酸和碱基切除修复,对基因组稳定性起重要作用.近年来相继发现了parp一1与dsbs修复通路之间的联系,如brca1和brca2突变的细胞株对parp一1抑制剂的敏感性显着增强,抑制parp一1能增加dnapk野生型和缺失细胞株对dsbs损伤药物的敏感性.最新的研究证实,parp一1能与ku蛋白竞争结合dsbs的末端.正常细胞受到电离辐射损伤后,ku蛋白对dna的高亲和力以及其它类型损伤的竞争作用都限制了parp一1在dsbs修复通路中的作用.但是当经典dnapk通路缺失时,parp一1的功能对dsbs的修复则有着重要的意义.(三)hr和nhej的比较hr和nhej作为两条重要的dsbs修复通路,各具特点,相互配合共同维护基因组的稳定性.(1)从两者的修复过程可以看出,hr修复是一种精确修复,该过程中以完整的dna分子的同源序列区域为模板合成新的dna片段,在最大程度上保持了基因组信息的准确性.而nhej是dsbs末端的直接连接,通常伴随着核苷酸的插入或缺失突变.nhej的这种含错修复并不意味着它在细胞修复系统中的不利地位,相反,以往的研究认为该通路在dsbs发生时被快速激活,能够帮助细胞及时渡过损伤危机,在细胞渡过生存威胁之后再由hr通路来进行精确修复;(2)两条修复通路的激活依赖于细胞周期的时相.其中nhej在细胞周期的各个阶段都能被激活,特别是在go/g1期作用尤为重要,而hr通路主要在s/g2后期被激活(rothkamm等.2003);(3)nhej主要修复电离辐射引起的dsbs,而hr修复在uv以及复制依赖性的损伤中占有更重要的地位.三,dsbs修复的意义修复系统能帮助细胞渡过损伤危险期,对保证细胞正常生命活动的进行具有重要意义.一般情况下,dsbs如能被顺利修复,细胞将通过细胞周期检查点重新开始正常的生命活动;相反,修复系统功能缺失则会导致严重后果:(1)引起细胞死亡.dsbs对细胞来说是一种非常危险的损伤,它会导致基因编码序列的丢失,破坏基因编码区和其调控区的联系,影响染色体的结构,阻碍dna的复制等等.dsbs如不能被及时修复,往往会通过细胞坏死,凋亡或长期的周期阻滞所致的细胞衰老等不同途径引起细胞死亡;(2)导致细胞癌变.基因组的不稳定性和肿瘤发生的关系已经得到了人们的普遍共识,前者主要表现为从核苷酸到染色体各个水平不同程度的改变.dsbs修复功能的缺失使细胞在损伤没有被完全修复的情况下进入分裂期,导致细胞基因组的一系列变化,如核苷酸的插入或缺失引起的基因序列的变化,基因扩增,整个染色体的丢失或获得,以及染色体异常等.这些变化能直接导致某些抑癌基因的失活和原癌基因的过度表达,最终引起细胞癌变.四,靶向hr和nhej通路的药物对细胞修复通路机制的阐明,除了帮助我们深入了解细胞的生命现象,更重要的是dna损伤修复通路中的一些关键分子成为肿瘤治疗的潜在靶点.放疗以及目前临床上主要应用的一些化疗药物都是通过引起肿瘤细胞dna损伤达到抗肿瘤目的的,而肿瘤细胞修复系统的激活是放化疗耐受的一个重要原因.因此,对修复系统的抑制可以增加放化疗的敏感性,提高治疗效果.目前已经发现了一些能靶向hr和nhej通路的化合物,包括:(1)pi3k家族的广谱抑制剂wortmannin,ly294002和咖啡因能通过抑制atm,atr和dnapk,同时抑制两条修复通路(bakkenist等.2004);(2)dnapk的选择性抑制剂ic87361,nu7026,vanillin和su117582等都具有放化疗增敏的作用(shinohara.2005);(3)来自天然产物的拓扑异构酶ii毒剂salvicine在引起细胞?300?dsbs的同时抑制dna.pkcs的活性;(4)atm的竞争性抑制剂ku-55933能比一般广谱的pi3k抑制剂更有效增加atm高表达细胞株对放化疗敏感性(hickson等.2004);(5)新近发现hsp90的抑制剂17一dmag通过抑制atm和dnapkcs的激活抑制nhej通路的功能,增加肿瘤细胞对电离辐射的敏感性.上述化合物中已有一些进入了临床研究,很有希望在今后的肿瘤临床治疗中通过联合用药达到克服耐药,产生放化疗增敏的效果.五,结语近年来,对细胞dna损伤修复系统的研究引起了国内外同行的广泛关注,包括hr和nhej通路在内的多条修复通路的研究已经取得了一些突破性的进展,dna损伤修复通路机制逐渐明晰.对这些通路的研究能帮助我们了解因基因突变导致的肿瘤发生,发展过程.更重要的是,这些作用机制的阐明将有利于人们发现肿瘤治疗的新靶点,为肿瘤的治疗开辟更广阔的空间.参考文献1pommiery.topoisomeraseiinhibitors:camptothecinsandbeyond.natrevcancer,2006,6:789802.2rogakouep,pilchdr,orrah,eta1.dnadoublestrandedbreaksinducehistoneh2axphosphorylationonserine139.jbiolchem.1998,273:58585868.3jacksonsp.sensingandrepairingdnadoublestrandbreaks.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