博士论文：溶磷微生物分离、应用及其相关基因的克隆与功能鉴定.pdf

密级：论文编号： 中国农业科学院 学位论文 溶磷微生物分离、应用及其相关基因的克隆与 功能鉴定 s c r e e n i n ga n da p p l i c a t i o no fp h o s p h a t e - d i s s o l v i n gs t r a i n sa n d i t s g e n ec l o n i n ga n di d e n t i f i c a t i o n 博士研究生：龚明波 指导教师：朱昌雄研究员 申请学位类别：农学博士 专业：农业微生物 研究方向：环境微生物 培养单位：农业环境与可持续发展研究所 研究生院 提交日期2 0 11 年6 月 s e c r e c y ： - n o c h i n e s e a c a d e m y o f a g r i c u l t u r a ls c i e n c e s p h dd i s s e r t a t i o n s c r e e n i n ga n da p p l i c a t i o no fp h o s p h a t e - d i s s o l v i n g s t r a i n sa n di t sg e n ec l o n i n ga n di d e n t i f i c a t i o n p h d c a n d i d a t e ：g o n gm i n g b o s u p e r v i s o r - p r o f z h uc h a n g x i o n g m a j o r ： s p e c i a l t y ： i n s t i t u t e ： a p p l i e dm i c r o b i o l o g y g r a d u a t es c h o o lo fc h i n e s ea c a d e m y o f a g r i c u l t u r a ls c i e n c e s j u n e2 0 1 1 独创性：声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：窭i 阀参 时间：i ，年6 月二j 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农 业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用+ 不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名：警峭壮 时间：劫，年6 月q 日 翩躲矧易 帆制月叫日 中国农业科学院 博士学位论文评阅人、答辩委员会签名表 论文题目溶磷微生物分离、应用及其相关基因的克隆与功能鉴定 论文作者龚明波专业农业微生物研究方向环境微生物 指导教师朱昌雄培养单位( 研究所、中心)环发所 硕( 博) 姓名职称单位专业签名 导师 硕导口 评 博导口 硕导口 阅 博导口 人 硕导口 博导口 经 口 辩 硕导口 ，辛动刘 主 宋渊教授中国农业大学生物学院农业微生物学 席 博导 硕导口 锄零 蒋细良研究员中国农业科学院植保所环境科学 博导 硕导口 历昂；& 姜瑞波研究员中国农业科学院区划所农业微生物学 博导 答 硕导口 中科院微生物所微生物学 李应 李少杰研究员 博导 辩 菩梭 李俊研究员 硕导口 中国农业科学院区划所农业微生物 委 博导 袁红莉教授 硕导口 中国农业大学生物学院微生物学 瓤编 博导 员 硕导口 v r7 j 张杰研究员中国农业科学院植保所农业微生物 鸫 博导 硕导口 博导口 会议记录( 秘书)刘雪 论文答辩时间地点2 0 1 1 年6 月1 5 日下午1 ：3 0环发所行政楼4 0 4 摘要 从适应土壤定殖的溶磷微生物中筛选到一株适应生产的溶磷真菌，并进行了其土壤溶磷特 性和溶磷机理初步研究，选取溶磷效果较好的菌株进行了溶磷相关基因的克隆、表达和功能鉴 定，取得以下主要结果： 在磷酸三钙为唯一磷源的无机盐培养基上。以透明圈为指示，通过初筛和复筛，获得效果 稳定的细菌2 3 株，分属6 个属1 1 个种；真菌1 6 株，其中有9 株草酸青霉( p e n i c 册u mo x a l i c u m ) ， 2 株变幻青霉( p e n i c i l l i u mv a r i a b i l e ) ，l 株刺孢青霉( p e n i c i l l i u ma c u l e a t u m ) 、1 株绿色木霉 ( t r i c h o d e r m av i r i d e ) 、2 株黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 、l 株构巢曲霉( a s p e r g i l l u sn i d u l a n s ) 。 菌株对不同难溶磷( 磷酸三钙、磷酸锌、磷酸铝和磷酸铁) 的溶解能力实验表明：细菌对 不同种类难溶磷溶解能力差异显著，真菌的溶磷效果显著高于细菌，1 6 株真菌显著降低p d b 培养液的p h 值，最低达到1 4 3 ，固体培养基上培养5d 能将各种难溶磷全部溶解。 通过1 6 株真菌在不同土壤中的定殖能力和释放难溶磷的效果比较，筛选土壤中定殖和溶 磷效果好的菌株。土培实验结果表明：真菌在土壤中具有较强的定殖能力；不同土壤中真菌的 定殖能力差异显著，同一种的真菌在土壤中的定殖能力也差异显著。真菌释放土壤难溶磷的能 力与其土壤定殖的能力显著相关，菌株定殖能力越强，释放土壤难溶磷效果越好。其中，真菌 z 3 3 、z h 、z c 、z h 3 、z 1 1 、z 1 5 、z q 3 和z 3 0 在土壤中定殖效果较好，2 8d 时，菌株数量能 达到起始值的1 0 4 8 倍，有效磷含量增加4 4 0 旷1 6 0 。 通过微生物与作物、土壤的匹配性实验，筛选适应玉米生产的溶磷真菌，并开展了溶磷菌 对土壤微生物多样性影响分析。溶磷微生物与作物的匹配性实验表明：1 6 株真菌在平板上对 玉米根系分泌物的适应性差异显著，z 1 5 + 、z h 、z q 3 、z i i 、z j i 和z 3 0 能够利用玉米的根系 分泌物快速生长，并且能溶解平板中的磷酸三钙。选取这6 株真菌进行土培实验，结果也证明 z 1 5 + 、z q 3 、z 1 1 、z h 和z 3 0 都能以玉米根系分泌物为营养进行繁殖，第2 l 天时，菌株数量 达到起始的9 7 0 , - , 4 8 0 3 倍，土壤有效磷增加了6 2 0 8 - 1 4 7 5 5 。在盆栽玉米的土壤中，z i i 和z h 定殖的速度最快，菌剂z 1 1 和z h 处理后，玉米干重和湿重显著增加，在大田试验中， 菌株z h 连续2 年都具有较高的增产作用，而菌株z 1 1 只在2 0 1 0 年的试验中具有较好的增产 作用。因此本文获得适应大田玉米生产的溶磷真菌为构巢曲霉z h 。溶磷菌剂对土壤微生物的 结构产生显著的影响，总体趋势为细菌、真菌、放线菌的数量比对照有所增加，土壤中微生物 多样性变化与土壤中细菌数量变化成正相关，土壤中细菌数量越多，土壤微生物多样性越高。 选取具有较好增产效果的构巢曲霉z h 和草酸青霉z i i ，对其产酸的种类，不同温度条件 下土壤溶液p h 值的变化、菌株定殖能力以及土壤中不同级别难溶磷的转化规律进行研究，探 讨了溶磷真菌在土壤中溶磷机理和溶磷特性。利用离子色谱对菌株产酸种类进行分析，结果表 明：构巢曲霉z h 和草酸青霉z 1 1 在p d b 溶液中能够大量产生乳酸和草酸，培养2 6h 时，溶 液中乳酸和草酸的含量分别达到了3 7 2 5 “g m l 和5 9 3 90 9 m e 。菌株z h 和z i i 在1 5 、2 0 和 3 0 土培条件下，都有很强的定殖能力，并能使土壤溶液的p h 值显著降低，土壤溶液p h 值 变化与菌株在土壤中定殖的规律一致。不同的温度下，菌株z h 和z 1 1 对土壤中不同级别的难 溶磷的转化规律总体趋势一致，土壤中c a 2 p 、c a r p 、a i p 、f e - p 和c a l 0 - p 形态的无机磷含 量都发生了变化，菌株z h 转化土壤中c a s - p 量较高，而菌株z i i 对a 1 p 、f e p 转化效率较高。 菌株z h 和z 1 1 溶磷机理为菌株在土壤繁殖过程中分泌有机酸与铁、铝、钙等离子螯合，从而 使难溶磷转化为有效磷。 构建黑曲霉z h 3 和草酸青霉z 1 1 的e d n a 文库，在磷酸三钙为唯一磷源的无机盐培养基上 以透明圈为指示，筛选溶磷克隆子，结果从菌株z h 3 和z 1 1 的e d n a 文库中分别筛选到携带 溶磷相关基因的克隆子6 0 个和7 2 个，这些克隆子在第二代转接后功能稳定，确认这些克隆子 所携带的基因具有溶磷的功能。黑曲霉z h 3 文库中筛选的克隆子所携带基因序列全长为 1 4 0 7 b p ，与a s p e r g i l l u sn i g e rc b s51 3 8 8 和a s p e r g i l l u sn i g e re o n t i ga n 0 7 e 0 2 2 0 的同源性达到 9 8 ，与其他菌的同源性低于8 0 ，但目前还没报到该基因在溶磷功能方面的研究，将该基因 命名为p a g t 。草酸青霉z i i 文库中筛选的克隆子所携带基因序列全长为1 1 6 0 b p ，与p e n i c i l l i u m c h r y s o g e n u mw i s c o n s i n5 4 1 2 5 5 和a s p e r g i l l u sn i g e rc b s51 3 8 8 的同源性只有6 8 ，与其他菌 的同源性更低，表明该基因为一个新的基因，将该基因命名为p p g t 。 分析溶磷相关基因p p qt 和p a qt 的开放阅读框，构建重组表达载体，获得转化子，并分 析转化子产生有机酸种类和溶液p h 值的变化。草酸青霉z 1 1 中溶磷相关基因p p g t 开放阅读 框长7 0 2b p ，蛋白长2 3 3 个氨基酸，该蛋白与p e n i c i l l i u mc h r y s o g e n u mw i s c o n s i n5 4 1 2 5 5 的 p c 2 1 9 2 3 5 8 0 同源性最高，为5 9 ，目前还没有该类蛋白的功能研究报道，确定本文获得的蛋 白p p g - t 为新的蛋白。黑曲霉z h 3 中溶磷相关基因p a gt 开放阅读框长8 1 9b p ，蛋白长3 3 3 个氨基酸，该蛋白与a s p e r g i l l u sn i g e rc b s5 1 3 8 8 的b a xi n h i b i t o rf a m i l yp r o t e i n 同源性达到 1 0 0 ，但该蛋白还没有溶磷功能的报道，属于该蛋白的新功能。将p p qt 和p a qt 的开放阅 读框连接到p e t 2 8 和p g e x 表达载体中，构建了4 株转化子，产生的乙酸和甲酸将难溶磷无 机盐培养液的p h 值降低到3 6 左右，在l b 培养中，4 株转化子不能将溶液的p h 值降低，表 明基因的表达需要难溶磷的诱导。p p qt 基因在ec o l i d h 5 a 中的溶磷机理是将葡萄糖氧化生 成乙酸，溶解无机磷；而p a qt 基因在ec o l i d h 5 a 中的溶磷机理是将葡萄糖氧化生成乙酸和 甲酸，溶解无机磷。 关键词：溶磷真菌，土壤定殖，适应性，溶磷相关基因，功能鉴定 n a b s t r a c t p h o s p h a t es o l u b i l i z i n gm i c r o o r g a n i s m sw h i c hc a l lb es u i t a b l e f o rc o l o n i z a t i o nw e r ei s o l a t e d f r o ms o i l s a n do n ei s o l a t e dw a es c r e e n e d ，w h i c hc a nb es u i t a b l ef o rc o r np r o d u c t i o n i t s c o l o n i z a t i o na n dp h o s p h a t e - d i s s o l v i n gc h a r a c t e r i s t i c si ns o i lw e r ec o n d u c t e d c l o n i n ga n d i d e n t i f i c a t i o no fp - d i s s o l v i n gg e n ew e r es t u d i e di nt h i sa r t i c l e t h em a i nc o n c l u s i o n sw e r ea s f o l l o w s ： t w e n t y - t h r e eb a c t e r i as t r a i n sw i t hh i g hp e r f o r m a n c eo fp h o s p h a t ed i s s o l v i n gw e r es c r e e n e d s i x t e e nf u n g iw e r ei s o l a t e d ，i n c l u d i n g9s t r a i n so f p e n i c i l l i u mo x a l i c u m ，2s t r a i no f a s p e r g i l l u sn i g e r , 2s t r a i n so fp e n i c i l l i u mv a r i a b i l e , ls t r a i no fp e n i c i l l i u ma c u l e a t u m ，ls t r a i no fa s p e r g i l l u s n i d u l a n s ，ls t r a i no ft r i c h o d e r m av i r i d e t h ep - d i s s o l v i n gc a p b i l i t yo fs t r a i n so nd i f f e r e n ti n s o l u b l ep h o s p h o r u s ( c a 3 ( p 0 4 ) ：z ，z n 3 ( p 0 4 ) 2 ， f e p 0 4 ，a i p 0 4 ) w e r ec o n d u c t e d t h ep - d i s s o l v i n ga b i l i t yo ff u n g iw e r eb e t t e rt h a nb a c t e r i a 16 s t r a i n sr e d u c e dt h ep hv a l u ef r o m7 0t ol o w e r2 0i n18h t h e yc o u l dd i s s o l v ea l lp h o s p h a t ei ns o l i d c u l t u r e c o l o n i z a t i o na n dp - d i s s o l v i n gc h a r a c t e r i s t i c si n s o i lr e s u l t ss h o w e df u n g ip r e s e n t e dh i i g h c o l o n i z a t i o na b i l i t yi ns o i l h o w e v e r ，c o l o n i z a t i o na b i l i t yo ff u n g ii nd i f f e r e n ts o i l sw a ss i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s t h ep d i s s o l v i n ga b i l i t yo fi s o l a t e dw e r es i g n i f i c a n t l yc o r r e l a t e dw i t ht h e i rc o l o n i z a t i o n 6s t r a i n so fz 3 3 、z h ，z c ，z h 3 ，z i1a n dz 3 0p r e s e n t e dh i g hc o l o n i z a t i o na b i l i t yi ns o i l t h en u m b e r o f6s t r a i n si n c r e a s e d9 8 3 - 4 8t i m e st h a ni n i t i a ln u m b e ri n2 8d a y sa n dt h ec o n t e n to fa v a i l a b l e p h o s p h o r o u sw a si n c r e a s e d 4 4 16 0 t h a ni n i t i a lc o n t e n t t h ep l a t ee x p e r i m e n ta n ds o i le x p e r i m e n to ft h em a t c h i n gb e t w e e ns t r a i n sa n dc r o pi n l a b o r a t o r yi n d i c a t e dt h a tt h e6s t r a i n so f z l 5 + 、z h 、z q 3 、z 1 1 、z j ia n dz 3 0c o u l dp r o p a g a t ei n p l a t e sa n ds o i lu s e i n gt h er o o ts e c r e t i o no fc o r na ss o l ec a r b o ns o u r c ea n dd i s s o l v ei n s o l u b l e p h o s p h o r u s 。s i xs t r a i n so fz 3 3 ，z h ，z c ，z h 3 ，z i ia n dz 3 0p r e s e n t e dh i g hc o l o n i z a t i o na b i l i t yi n s o i l ，t h en u m b e ro f6s t r a i n si n c r e a s e d9 6 0 - 4 8 0 3t i m e sa n dt h ec o n t e n to fa v a i l a b l ep h o s p h o r o u s w a si n c r e a s e d6 2 0 8 0 o - 1 4 7 5 5 i n2 1d a y st h a ni n i t i a lc o n t e n t t h ep o te x p e r i m e n ti n o c u l a t i n gw i t h 5s t r a i n sw a sc o n d u c t e di ng r e e n h o u s eb yp l a n t i n gc o r n t h er e s u l td e m o n s t r a t e dt h a tt h ec o n t e n t o fa v a i l a b l ep h o s p h o r o u sw a si n c r e a s e dr e m a r k a b l yw i t hs t r a i n sz i1a n dz ht r e a t m e n t t h ed r y m a t t e ry i e l do fc o r ns i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dt h a nc kt h e ns t r a i n sz iia n dz hw e r eu s e di nf i e l d e x p e r i m e n ta sm i c r o b i a li n o c u l u m s t h ey i e l do fc o mt r e a t e dw i t hs t r a i nz hi n c r e a s e dr e m a r k a b l yi n t w oy e a r s h o w e v e r , t h ey i e l do fc o r nt r e a t e dw i t hs t r a i nz ii p r e s e n t e dy i e l di n c r e a s e di no n e y e a r t h ea p p l i c a t i o no fp - s o l u b i l i z i n gm i c r o o r g a n i s m sh a das i g n i f i c a n ti m p a c to nm i c r o b i a l c o m m u n i t ys t r u c t u r e t h en u m b e r so fb a c t e r i a , f u n g i ，a c t i n o m y c e t e sw e r ei n c r e a s e dt h a nc k t h e r e w e r ep o s i t i v ec o r r e l a t i o nb e t w e e nt h eb i o d i v e r s i t ya n dt h en u m b e ro fb a c t e r i a a s p e r g i l l u sn i d u l a n sz ha n dp e n i c i l l i u mo x a l i c n r az i 1s e c r e t el a c t i ca c i da n da c e t i ca c i d ，t h e c o n t e n to fa c i da t4 9 t hd a yw a s3 7 2 5 t a g m l a n d5 9 3 9 1 a g m l ，r e s p e c t i v e l y t h es t r a i n sz iia n dz h i i l c o u l dc o l o n i z a t ei n s o i la t15 、2 0 、3 0 a n dr e m a r k a b l yd e c r e a s e dt h ep ho fs o i l t h e r ew e r e n e g a t i v ec o r r e l a t i o nb e t w e e np hv a l u ed e c r e a s e do fs o i la n dt h en u m b e ro ff u n g i t h es t r a i nz i1a n d z hp r o m o t e dt h et r a n s f o r m a t i o no fi n s o l u b l ep h o s p h a t ew h i c hw a st h es a m el a wi nd i f f e r e n t t e m p e r a t u r e t h ec o n t e n to fc a 2 - p 、c a r p 、a l - p 、f e - pa n dc a n o pw e r ec h a n g e dw i t hz iia n dz h t r e a t m e n t t h et r a n s f o r m a t i o ne f f i c i e n c yo fc a s - po ft h es t r a i nz i1w a sh i g h e r , b u tt r a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c yo f a l pa n df e po f t h es t r a i nz hw a sh i g h e ri ns o i l t h em e c h a n i s mo fp d i s s o l v i n go f t h e s t r a i nz i1a n dz hw a st h a tt h e ys e c r e t eo r g a n i ca c i d si nt h ep r o g r e s so fp r o p a g a t i o nc h e l a t i n gc 一+ f e ”，a i ”f o rd i s s o l v i n gp h o s p h a t e s i x t yc l o n ew e r es c r e e n e df r o me d n al i b r a r yo fa s p e r g i l l u sn i g e rz h 3a c c o r d i n gt ot h e t r a n s p a r e n tz o n eo fp - d i s s o l v i n gi np l a t e a n d7 2c l o n ew e r es c r e e n e df r o me d n al i b r a r yo f p e n i c i l l i u mo x a l i c u mz ii t h ef u n c t i o no ft h e s ec l o n ew e r es t a b l ea tt h es e c o n dg e n e r a t i o n t h e g e n ef r o ma n i g e rz h 3w a sn a m e dp a gt ，s e q u e n c ea n a l y s i ss h o w e dt h a ti tw a s14 0 7 b pi nl e n g t h , a n ds h a r e d9 8 i d e n t i t ya tt h en u c l e o t i d el e v e lt oa s p e r g i l l u sn i g e rc o n t i ga n 0 7 c 0 2 2 0 ，a n ds h a r e d l e s st h a n8 0 i d e n t i t yt oo t h e ri s o l a t e d t h eg e n ef r o mp e n i c i l l i u mo x a l i c u mz i1w a sn a m e d p p gt s e q u e n c ea n a l y s i ss h o w e dt h a t i tw a s1 16 0 b pi nl e n g t h , a n ds h a r e do n l y6 8 i d e n t i t ya tt h e n u c l e o t i d el e v e lt op e n i c i l l i u mc h r y s o g e n u mw i s c o n s i n5 4 - 1 2 5 5 ，i ts h o w e d p p g tw a san o v e lg e n e s e q u e n c ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h er e a d i n gb o xo fg e n ep p gth a s7 0 2 b p ，a n di t sd e d u c e d2 3 3 a m i n oa c i d ，t h i sp r o t e i ns h a r e s5 9 h o m o l o g yw i t ht h ep c 219 2 3 5 8 0i np e n i c i l l i u mc h r y s o g e n u m w i s c o n s i n5 4 - 12 5 5 _ t h eh i g h e s th o m o l o g y a n dt h e r ew a sn or e p o r ta b o u tt h ep d i s s o l v i n gf u n c t i o n o ft h i sp r o t e i n s ot h ef u n c t i o no ft h i sp r o t e i np p g ti san o v e lo n e s e q u e n c ea n a l y s i ss h o w e dt h a t t h er e a d i n gb o xo fg e n ep a gti nz h 3h a s819 b p ，a n di t sd e d u c e d3 3 3a m i n oa c i d s ，t h i sp r o t e i n s h a r e d1 0 0 h o m o l o g yw i t ht h eb a xi n h i b i t o rf a m i l yp r o t e i ni na s p e r g i l l u sn i g e rc b s5 1 3 8 8 ，b u t t h e r ei sn or e p o r ta b o u tt h ep d i s s o l v i n gf u n c t i o no ft h i sp r o t e i n s oi t san o v e lf u n c t i o no ft h e p r o t e i n c o n n e c t i n gp p q ta n dp a q tt oe x p r e s s i o nv e c t o r sp e t 2 8a n dp g e x ，w ec o n s t r u c t e df o u r e n g i n e e r i n gs t r a i n s ，w h i c hm a i n l yp r o d u c ea c e t i ca c i da n df o r m i ca c i d t h e yc o u l dr e d u c et h ep ho f t h ei n o r g a n i cu n d i s s o l v e dp h o s p h o r u sm e d i u mt o3 6o rs o t h e4e n g i n e e r i n gs t r a i n sw a si n d u c t e d b yu n d i s s o l v e dp h o s p h o r u s ，b e c a u s et 1 1 e yc o u l d n tr e d u c et h ep hv a l u eo fm e d i u mw i t h o u t u n d i s s o l v e dp h o s p h o r u s t h ep d i s s o l v i n gm e c h a n i s mo f p p qti nec o i l d h 5 ai st h eo x i d a t i o no f g l u c o s ei n t oa c e t i ca c i dt od i s s o l v ep h o s p h o r u s ；t h ep h o s p h o r u s - d i s s o l v i n gm e c h a n i s mo f p p qti n ec o l i d h 5 ai st h eo x i d a t i o no fg l u c o s ei r i t ea c e t i ca c i da n df o r m i ca c i dt od i s s o l v ep h o s p h o r u s k e yw o r d ：p h o s p h a t e - d i s s o l v i n gf u n g i ，c o l o n i z a t i o ni ns o i l ，a d a p t a b i l i t y , p - d i s s o l v i n gg e n e ， i d e n t i f i c a t i o n 目录 第一章前言l 1 1 土壤中磷素形态及其转化。1 1 1 - 1 土壤中磷素的形态l 1 1 2 土壤中无机磷素的分级5 1 1 3 磷的循环2 1 1 4 土壤中无机磷的转化4 1 2 溶磷微生物研究进展6 1 2 1 溶磷微生物的种类6 1 2 2 溶磷微生物的应用7 1 2 3溶磷微生物应用的影响因素- 8 1 2 4 溶磷微生物肥料的开发与应用8 1 3 溶磷微生物作用机制研究9 1 3 1有机酸9 1 3 2 磷酸酶一1 0 1 3 3 矿的释放1 1 1 3 4 氧化还原物质1 1 1 3 5 其他溶磷物质( 蛋白质、多糖、氨基酸、铁载体) 1 l 1 4 溶磷微生物的分子生物学研究1 2 1 5 研究目的和意义1 4 1 6 研究内容和方法1 4 1 7 技术路线16 第二章溶磷微生物的筛选、鉴定1 7 2 1 试验材料和方法l7 2 1 1 样品与土壤来源1 7 2 1 2 培养基l7 2 1 3 主要试剂和仪器1 8 v 2 1 4 溶磷菌的分离1 8 2 1 5 溶磷菌株对不同难溶磷的溶解18 2 1 6 溶磷菌培养过程中溶液p h 的变化19 2 1 7 溶磷菌在土壤中的定殖。1 9 2 1 8 溶磷菌的鉴定一1 9 2 2 试验结果与讨论2 1 2 2 1 溶磷菌株的筛选2 1 2 2 2 溶磷菌株对不同难溶磷的溶解2 2 2 2 3 溶磷菌培养过程中溶液p h 的变化2 4 2 2 4 适应土壤定殖的溶磷菌筛选2 4 2 2 。5 溶磷菌的鉴定2 8 2 3 小结3 2 第三章适应生产的溶磷微生物筛选与应用。3 4 3 1 试验材料和方法3 4 3 1 1 菌株与土壤来源3 4 3 1 2 培养基与培养液3 4 3 1 3 主要试剂和仪器3 5 3 1 4 溶磷菌株对玉米根系适应性3 5 3 1 5 盆栽条件下适应玉米的溶磷微生物筛选3 6 3 1 6 溶磷菌株田间应用3 6 3 1 7 溶磷菌剂对土壤生物多样性的影响3 6 3 2 试验结果与讨论3 7 3 2 1 溶磷菌株对玉米根系分泌物适应性研究一3 7 3 2 2 盆栽条件下适应玉米的溶磷微生物的筛选3 8 3 2 3 溶磷菌株田间应