叶酸对磁性Fe_3O_4纳米粒子的表面修饰.docx

叶酸对磁性 fe3o4 纳米粒子的表面修饰魏开伟 1刘琦,1,2程美令 1袁晓卫 1于丽丽 1徐正 2(1 江苏工业学院化学化工学院，江苏省精细石油化工重点实验室，常州213164)(2 南京大学配位化学国家重点实验室，南京210093)摘 要 ： 以 fecl36h2o 作 为 单 一 铁 源 ，1，6-己二胺作为胺化试剂 ，利用无模板的溶剂热方法制备了胺基功能化的磁性 fe3o4 纳 米粒 子 ，并利用其键合叶酸分子 ，制备出表面修 饰了叶酸的磁性 fe3o4 复 合 纳 米 粒 子 。 利用傅里叶变换红外光谱仪 、x-射 线 衍 射 仪 、透 射 电 镜 、差 热-热重分析仪和振动样品磁强计对所得纳米粒子的形貌 、粒 径 、化学组成和磁性能进行了表征 。 结 果 表 明 ，叶 酸分子通过化学键牢固键合在磁性纳米 fe3o4 粒 子 表 面 ，叶酸修饰的复合纳米粒子仍然具有良好的磁性能 。关 键 词 ： fe3o4 纳 米 粒 子 ； 磁 性 ； 叶 酸 ； 表 面 改 性中 图 分 类 号 ： o614.81； o613.3文 献 标 识 码 ： a文 章 编 号 ： 1001-4861(2010)01-0040-05surface modification of magnetic fe3o4 nanoparticles by folic acidwei kai-wei1liu qi,1,2cheng mei-ling1yuan xiao-wei1yu li-li1 xu zheng2(1school of chemistry and chemical engineering and jiangsu province key laboratory of fine petro-chemical technology,jiangsu polytechnic university, changzhou, jiangsu 213164)(2state key laboratory of coordination chemistry, nanjing university, nanjing 210093)abstract: amine-functionalized magnetite fe3o4 nanoparticles were synthesized by a facile one-pot template-freesolvothermal method via using fecl36h2o as a single iron source, 1,6-hexanediamine as a reagent providing amine, and magnetite fe3o4 composite nanoparticles with folic acid (fa) molecules were synthesized by bonding of the amine-functionalized magnetite nanoparticles with folic acid molecules. the morphology, size, chemical component and magnetic property of as-prepared composite nanoparticles were characterized by fourier transform infrared spectroscopy (ftir), x-ray diffraction, transmission electron microscopy (tem), thermogravimetry - differential scanning calorimeter (tg-dsc) and vibrating sample magnetometer (vsm). the results show that folic acid (fa) molecules are conjugated on the surface of magnetic fe3o4 nanoparticles, and the composite nanoparticles have still good magnetic property after surface modification by folic acid.key words: fe3o4 nanoparticles; magnetic properties; folic acid; surface modification磁 性 fe3o4 纳米粒子在核酸分析 、磁 共 振 成 像利 用 磁 性 fe3o4 纳米粒子作为磁共振 成 像 增 强对 比 剂 时 ，为 了 增 加磁性纳米粒子在肿瘤细胞附近 的 浓 度 ，一 种 有 效 的方法是在纳米粒子的表面键合 对靶向肿瘤细胞有高度亲和性的靶 向 分 子 10-11。 人们的研究已经证实单克隆抗体 12-15、 蛋 白 质 16 和 多增 强 对 比 剂(用于肿瘤的临床诊断 、治 疗 等)、靶 向 药物 、磁 靶 向 放 疗 、细胞分离和酶的固 定 化 等 领 域 的 广 泛 应 用 ，已 经 使 其成为生物纳米材料领域的研究 的热点之一1-9。收 稿 日 期 ：2009-08-31。 收 修 改 稿 日 期 ：2009-11-12。国家自然科学基金(no.20671045，20971060)；南京大学配位化学国家重点实验室自然科学基金资助项目 。通 讯 联 系 人 。 e-mail：，tel会 员 登 记 号 ：s060018987p。第 一 作 者 ：魏 开 伟 ，男 ，24 岁 ，硕 士 研 究 生 ；研 究 方 向 ：磁性纳米材料的表面修饰 。第 1 期魏 开 伟 等 ：叶 酸 对 磁 性 fe3o4 纳米粒子的表面修饰 41肽17这样的靶向分子可以增加磁共振对比 剂 在 肿 瘤细胞附近的浓度。 但使用上述靶向分子也有不足之 处 ，比 如 ，单 克 隆 抗 体键合的纳米粒子 ，由 于 其 体 积较大和本身固有的 免 疫 原 性 ，会影响其扩散通过生 物屏障18。使用低分子量的叶酸作为靶向分子，是克 服这些不足的一条有效途径。叶 酸 是蝶酰谷氨酸的简称 ， 别 名 维 生 素 m，维 生 素 bc，在人体内有重要的生理功能 ，它 能 特 异 性结合过度表达于 许 多 肿 瘤 (卵 巢 癌 、乳 腺 癌 、直 肠 癌等)细胞膜表面的叶酸受体。在肿瘤靶向药物输运体 系 中 ，包 括 输 运 放 射性核素标记的叶酸螯合物显像 (dmso)，江苏新华活性材料研究所。相 分 析 采 用 日 本 理 学 d/max 2500 pc (cu k， =0.154 056 nm)型 x-射 线 衍 射 仪 测 试 ；红 外 光 谱 测 定 采 用 美 国 nicolet 公 司 的 protg 460 型 傅 里 叶 变 换 红 外 (fiir) 光 谱 仪 ； 用透射电子显微镜 (tem) tecnai 12(加 速 电 压 为 120 kv) 研究产品的形貌 、大 小 和 衍 射 花 样 ；利用振动样品磁强计 (mpms xl- squid)测 定样品的饱和磁化强度 ；差 热 -热 重 分 析 采用热重示差扫描量热仪(sdtq600)测定。样品制备表面修饰己二胺的 fe3o4 纳米粒子 (fe3o4-nh2)的制备1.0 g fecl36h2o 加 入 到 30 ml 乙 二 醇 中 充 分搅拌至完全溶解 。 然 后 ，加 入 6.5 g 己 二 胺 ，2.0g 无 水 醋 酸 钠 ，搅拌至澄清溶液 。 将反应液转移至 剂 ，叶酸受体是一种潜在的分子靶 7,19-20。叶 酸 受 体(folate receptor，fr)是一种被磷脂酰肌醇结 合 在 细胞膜上的叶酸结合蛋白 ，可 以 介 导 细 胞 内 化 ，将 叶 酸摄取入真核细胞 胞浆的一种高亲和力受体 ，在 众多 人 源 性 肿 瘤(如 卵 巢 、鼻 咽 、子 宫 内 膜 和 宫 颈 癌 等)高 压 釜 中 ，200 下 反 应 6 h ，得 到 己 二 胺 修 饰细胞膜上有过度表达和高活性 8,21-22。许 多 关 于 叶fe3o4 纳 米 粒 子 (fe3o4-nh2) 。 10 000 rmin-1 下 离 心分 离 ， 用去离子水和无水乙醇洗涤几次 ，60 下干 燥 6 h29-30 。1.2.2叶酸键合 fe3o4-nh20.093 g 二环己基碳二亚胺(dcc)和 0.077 g n-羟基丁二酰亚胺 (nhs) 首 先 溶 解 在 27 ml dmf/dmso(31，v/v)混 合 溶 液 中,再 加 入 0.3 g 叶 酸 搅 拌 反 应 24 h， 然 后 过 滤 ， 除 去 生 成 的 n，n-二 环 己 基酸-脂质体作为抗肿瘤药物载 体 的 研 究 表 明 ，叶 酸靶向给药可以用于多种癌症的诊断和治疗 23-26， 因此 ，将叶酸作为靶 向分子键合到磁性纳米粒子的研 究近年来受到人们的关注 27-28，最近研究表明 经 叶 酸 和 聚 乙 二 醇 (fa-peg) 修 饰 后 所 得 的 fe3o4-peg- fa 纳 米 粒 子 作 为 磁 靶 可 通 过 fr 介导的细胞内吞 作用进入叶酸受 体过度表达的肿瘤细胞 ， 比 如 ，人 的 宫 颈 癌 细 胞(hela 细 胞)，导致磁共振成像 对 比 度 增强27，但是，该文献报道的胺基修饰磁 性 粒 子 的 过脲30。将 0.2 g fe3o4-nh2 加 入 到 滤 液 ，无 水 条 件 下搅 拌 反 应 12 h。 12 000 rmin-1 下 离 心 分 离 ，用 去 离子水和无水乙 醇 分 别 洗 涤 3 次 ，60 下 干 燥 6 h， 得到表面修饰叶酸分子的复合磁性纳米粒子 (fe3o4-nh-fa)。程采用的是分步法 ，先 用 共沉淀法合成磁性 fe3o4纳 米 粒 子 ，再 将 fe3o4 纳米粒子与硅烷化 试 剂 ( 硅烷 -聚 乙 二 醇 -三 氟 乙 酯 ，tfee) 键 合 ，最 后 在 n2 保护 下 ，将乙二胺修饰在磁性粒子表面 ，该 合 成 路 线 过长，对实验操作和要求较高。 鉴于此，本实验采用更 为 简 单 的 一 锅 煮 的 方 法 ，只用一步得到胺基修 饰的 fe3o4 磁 性 纳 米 粒 子 ，并进一步键合叶酸 ，得 到 了叶酸修饰的磁性 纳 米 粒 子 ，为将叶酸分子键合到 磁性纳米粒子上开发了一条新的合成途径 。结果与讨论合成叶 酸 分 子 修 饰 fe3o4 纳米粒子的合成路线如 22.1图 1。首先利用溶剂热法合成 1，6-己 二 胺 胺 化 的 fe3o4-nh2 纳 米 粒 子 ，然 后 将 叶 酸 在 n-羟 基 丁 二 酰 亚 胺 (nhs) 和 二 环己基碳二亚胺 (dcc) 作 用 下 进 行实验部分实验试剂及仪器fecl36h2o，乙 二 醇 ，无 水 乙 醇 ，n，n-二 甲 基 甲11.1活 化 ，得 到 nhs-fa， 将 fe3o4-nh2 纳 米 粒 子 与nhs-fa 在 n，n-二 甲 基 甲 酰 胺 (dmf)和 二 甲 基酰 胺 (dmf)，叶 酸 (fa)，n-羟基丁二酰亚胺 (nhs)， 国药集团化学试剂有限公司 ；乙 酸 钠 ，南 京 化 学 试 剂厂 ；二环己基碳二亚胺 (dcc)，上 海 佘 山 化 工 厂 ； 己 二 胺 ， 上海凌峰化学试 剂 有 限 公 司 ； 二 甲 基 亚 砜亚 砜(dmso) 混 合 溶 剂 中 ，两者之间通过酰胺键 (-conh-) 键 合 形 成 fe3o4-nh-fa 复合磁性纳米粒 子 。 最后将叶酸键合在 fe3o4 纳 米 粒 子 表 面 形 成fe3o4-nh-fa。图 3 fe3o4-nh2 (a)及 fe3o4-nh-fa 纳 米 粒 子(b)的xrd 图fig.3 xrd patterns of fe3o4-nh2 (a) and fe3o4-nh-fa (b) nanoparticles图 2 fe3o4-nh2 (a)及 fe3o4-nh-fa (b)的 红 外 光 谱 图fig.2 ftir spectrum of the fe3o4-nh2 (a) and fe3o4-nh-fa (b) nanoparticles图 1 合 成 fe3o4-nh-fa 的化学反应示意图 fig.1 chemical reaction scheme for synthesis of fe3o4-nh-fa nanoparticles第 26 卷无机化学学报422.2红外光谱分析图 2a 和 2b 分 别 为 fe3o4-nh2 及 fe3o4-nh-fa衍射峰都与文献已报道的 fe3o4 的 标 准 谱 图 一 致(pdf no.7-1609),图 中 在 2=30.00，35.36，36.941，42.96 ，53.28 ，56.78 ，62.36 ，73.84 的 8 个 衍 射 峰 分别对应于 fe3o4 的 (220)，(311)，(222)，(400)，(422)， (511)， (440) 和 (622) 晶 面 ， 相应的晶面间距分别为 0.297,0.254,0.243,0.210,0.172,0.162,0.149,0.128 nm ，纳米粒子的傅里叶红外光谱图。 由图 2a 可见，经过胺 基 改 性 fe3o4 在 584 cm-1 处 出 现 fe-o 特 征 吸 收 峰 ，1 631，1 406 和 1 117 cm-1 处的吸收峰与游离的 己二胺的吸收峰相一致 ， 说 明 胺 化 的 fe3o4 纳 米 粒子表面存在-nh2 基团。 2 924 cm-1 的特征峰是-ch2-的 伸 缩 振 动 峰 ， 进 一 步 证 明己二胺已经成功连接 fe3o4。 通 过 图 2b 可 以 看 出 1 701 cm-1 处 的 峰 对 应 的 是 羧 基 -c-o-的伸缩振动吸收峰 ，1 606 cm-1 处 的 峰 为 叶 酸 中 -conh-中-nh-弯曲振动吸收峰 ，1 189 cm-1 处的峰是脂肪胺的 c-n 伸 缩 振 动 峰 ， 而 1 517 cm -1 对应己二胺与 叶酸之间形成的 -conh-键 的-说明所合成的产品 是具有尖晶石结构的 fe3o4。图中没有杂质峰，表明产品中含有纯的 fe3o4。 谱图的基 线 低 且 平 稳 、峰 形 尖 而 窄 、说 明 试 样 的 结 晶 度 比较 好 。 图 3b 是 fe3o4-nh-fa 的 粉 末 xrd 图, 所 有 衍射峰都与文献已报道的 fe3o4 的 标 准 谱 图 一 致(pdf no.7-1609)，说明所合成的产品是具有尖 晶 石结 构 的 fe3o4。峰 的 强 度 和形状表明产品也具有良 nh-弯曲振动吸收峰，更进一步表明叶酸分子已经 好的结晶度。 此外，图 3b 与图 3a 相比，两者在基线和 峰 形 方 面 都 有 差 别 ， 且 在 2 为 2030范 围 内 ，成功键合 fe3o4 粒子31。2.3xrd 分析图 3a 是 合 成 所 得 fe3o4-nh2 的 xrd 图 。所 有图 6 fe3o4-nh2 (a)及 fe3o4-nh-fa (b)的 tg 曲 线fig.6 tg curves of the fe3o4-nh2 (a) and fe3o4-nh-fa (b) nanoparticles图 5 fe3o4-nh2 (a)及 fe3o4-nh-fa (b)纳米粒子的磁滞 回 线fig.5 hysteresis loops of fe3o4-nh2 (a) and fe3o4-nh-fa (b) nanoparticles图 4 (a) fe3o4-nh2 的 tem 照 片 ；(b) 倍 数 放 大 的 fe3o4-nh2 的 tem 照 片 ；(c) fe3o4-nh-fa 的 tem 照 片 ；(d) fe3o4-nh-fa 粒子的选区电子衍射图 fig.4 (a) tem image of fe3o4-nh2; (b) enlarged tem image of fe3o4-nh2; (c) tem image of fe3o4-nh-fa; (d) saed pattern of fe3o4-nh-fa nanoparticles第 1 期魏 开 伟 等 ：叶 酸 对 磁 性 fe3o4 纳米粒子的表面修饰 43存在较强的非晶相峰。 这些差别和峰的形成是由于磁性 fe3o4 纳米粒子表面包覆了非晶相的叶酸32。与粉 末 x-射线衍射计算的结果基本一致 。 图 4c 是fe3o4-nh-fa 的透射电镜照片 ，由 图 可 以 看 出 ，改 性 后 所 得 fe3o4-nh-fa 复合粒子的形貌与改性前的 fe3o4-nh2 粒子的形貌基本相同。 图 4d 是 fe3o4-nh- fa 的选区电子衍射图，图中出现的分布无规律的衍 射点表明 fe3o4 纳米粒子具有多晶结构。透射电镜和选区电子衍射图分析图 4a，4b 是 fe3o4-nh2 的 透 射 电 镜 (tem) 照 片 ， 从图中可以看出 ，fe3o4-nh2 复合粒子分布 较 均 匀 ， 其粒径大多在 2035 nm，平均粒径约 为 31.5 nm，这2.4磁性能分析图 5a 是 fe3o4-nh2 纳米粒子的磁滞回线 ，从 图 中 可 以 看 出 ，fe3o4-nh2 的饱和磁化强度在 53 emu g-1 左 右 。 图 5b 是 fe3o4-nh-fa 纳米粒子的磁滞回 线 ，从图中可以看出 ，粒子经叶酸改 性 后 的 饱 和 磁 化强度 在 44 emug-1 左 右 ，磁化强度下降了 9 emu热重分析图 6 分 别 为叶酸改性前后 fe3o4 的 tg 曲 线 。 由图中曲线 a 可 知 ，200 之 前 的 fe3o4-nh2 的 失 重 率 为 2%， 是 fe3o4-nh2 表面吸附的水挥发导致的 ，200600 之间的失重率约为 6%，应 是 fe3o4 表 面 的己二胺的分解造成的 ，剩 余 物 为 fe3o4，这 事 实 也2.52.6g-1，主 要 是 因 为 叶酸分子属于无磁性的大分子物 说明 1，6-己二胺键 合 在 fe3o4 表 面 上 ，其 重 量 约 占质 ， 修 饰 在 fe3o4 纳米粒子表面对其磁性造成了一 定 影 响 ，与 壳 聚 糖 修 饰 fe3o4 纳米粒子后造成 fe3o4纳 米粒子的磁化强度明显下降不同 32，叶 酸 分 子 修 饰 形 成 的 fe3o4-nh-fa 纳米粒子仍然具有良好的 磁性能。fe3o4-nh2 重量的 6%。 从图 6 的曲线 b 可知，200 之 前 的 失 重 主 要 是 fe3o4-nh-fa 表面的吸附水挥 发 所 致 ， 大 约 占 2%， 而 200600 的 失 重 主 要 是fe3o4-nh-fa 表 面 的 nh-fa 的 分 解 ， 大 约 占 16%，这 数 据 与 键 合 在 fe3o4 粒子上的己二胺所占 fe3o4-nh2 的 重 量 相 比 ， 也 说 明 叶 酸 分 子 与 fe3o4-nh2 粒第 26 卷无机化 学 学 报44子发生了键合。med., 1992,25(1):148-15714weissleder r, lee a s, fischman a j, et al. antibody mr imaging radiology, 1991,181(1):245-24915tiefenauer l x, kuhne g, andres r y. bioconjug. chem.,1993,4:347-35216kresse m, wagner s, pfefferer d, et al. magn. reson. med.,1998,40:236-24217wunderbaldinger p, josephson l, weissleder r. bioconjug.chem., 2002,13:264-26818jain r k. cancer. res., 1987,47:3039-305119zhang pei-gen ( 张 培 根 ), yu de-cai ( 余 德 才 ), cheng chuan-wei ( 程 传 伟 ), et al. chinese j. inorg. chem. 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(wuji huaxuexuebao), 2007,23(8):1491-1495结论3总 之 ，我们利用酰胺键(-conh-)成 功 地 将 叶 酸分 子 与 fe3o4-nh2 复 合 粒 子 键 合 ，形成了表面修饰 叶酸的磁性复合纳米粒子 fe3o4-nh-fa，该 复 合 粒子具有较强的饱和 磁 化 强 度 ，在生物医学方面有重 要的潜在应用价值。参考文献：1 shi d l, hoon s c, chen y, et al. adv. mater., 2009,21(21):2170-21732 hyon