第二章 细胞分离与破碎.ppt.ppt

1,第二章细胞分离与破碎,2,总体学习目的和要求,通过本章学习，要求掌握细胞分离和目标产物释放的原理和影响因素，熟知各种方法的优缺点和应用范围。,3,了解细胞分离的基本方法，掌握离心沉降的基本理论；理解细胞壁的特点和细胞破碎率的定义；掌握珠磨破碎机、高压匀浆机、超声波机等机械破碎法的工作原理、主要工作参数、主要优缺点和应用范围；理解非机械法（酶溶法、化学法）的原理、优点和不足；了解物理法（渗透压冲击法、冻融法、干躁法）的各自特点；理解目标产物的性质、在细胞中的位置与破碎方法之间关系。,4,收集含生化物质的液相，分离除去固体悬浮物（细胞、菌体、细胞碎片、蛋白质的沉淀物和它们的絮凝体等）。收集胞内产物的细胞或菌体，分离除去液相。,一、固液分离的目的,5,二、*影响发酵液固液分离的因素,1）发酵液中悬浮离子的大小,6,2）发酵液的黏度（viscosity）固液分离速度通常与粘度成反比，粘度越大，固液分离越困难。影响粘度的因素：菌体的种类和浓度（重要因素）培养液中蛋白质、核酸大量存在培养基成分此外，某些染菌发酵液，如染细菌，则粘度会增大,7,三、常见的固液分离方法,重力沉降gravitationsettling离心沉降centrifugationsettling过滤filtration,8,重力沉降在重力的作用下使颗粒与流体之间产生相对运动，从而实现两者的分离。在生物分离过程中，定义的颗粒为细胞、细胞碎片等有形物。,（一）重力沉降gravitationsettling,9,*重力沉降速度：,10,提高重力沉降的途径加入中性盐：双电层排斥电位降低加入高分子絮凝剂：架桥作用形成大絮凝团引入外力,11,理论假设细胞或细胞碎片按照球形颗粒处理；颗粒在无限稀释的溶液中进行沉降，颗粒之间无相互干扰受力分析球形颗粒重力fg液体的浮力fb颗粒运动方向相反的阻力fs,12,重力：,浮力：,阻力：,13,当球形颗粒自身的重力与其所受到浮力和阻力达到平衡时，,则,14,当球形颗粒处于滞流区（）时,当球形颗粒处于过渡区（）时,当球形颗粒处于湍流区（）时,15,千姿百态的微生物世界,bacterialmorphologydiagram,high-densitycellculture,球形颗粒？,无限稀释溶液？,16,模型校正形态校正：颗粒的形状系数速度校正：空隙率函数提高重力沉降的途径加入中性盐：双电层排斥电位降低加入高分子絮凝剂：架桥作用形成大絮凝团引入外力,17,离心沉降在离心力的作用下，由于颗粒和流体间存在密度差产生相对运动，从而使颗粒和流体分离。,（二）*离心沉降centrifugationsettling,18,应用,1878年瑞典牛奶奶油1896年用于回收酵母离心分离技术在生工方面主要用于：分离dna、大分子、菌体、动植物细胞、胞内产物。,19,优点：时间短，对于不稳定的产物可以首选可连续操作操作费用较低可用夹套控温缺点：产品要及时移出设备昂贵、维护费用高连续生产应注意堵塞问题,1*离心分离的优缺点,20,2离心力与转速,r,rpm,rcf(g),21,3*提高离心沉降速度的主要措施,d颗粒直径；s固体颗粒密度；l液体介质密度；l液体介质粘度；旋转角速度；r转轴中心到颗粒中心距离,增大dp增大s提高离心机转数n提高离心半径r降低液体粘度,22,按速度和离心力：1、常速离心机最大转速8000rpm(r/min)，相对离心力(rcf)104g以下,用于细胞、菌体和培养基残渣等分离；2、高速（冷冻）离心机1104-2.5104rpm，相对离心力104-105g，用于细胞碎片、较大细胞器、大分子沉淀物等分离；3、超速离心机转速2.5-8104rpm，相对离心力5105g；用于dna、rna、蛋白质、细胞器、病毒分离纯化；检测纯度；沉降系数和相对分子量测定等。,4离心机的种类与用途,23,（1）差速离心分离法,24,核糖体，微粒体，高尔基体,线粒体，溶酶体等,细胞核，未破碎细胞,组织匀浆,600g10min,15,000g5min,100,000g60min,差速离心分离应用实例,25,（2）区带离心分离,26,差速区带离心特点,基于颗粒的大小、形状的分离梯度液的最大密度不能超过所分离颗粒的最大密度离心过程中，颗粒不断沉降至其浮力密度与梯度液密度相等动态离心分离方法,27,平衡区带离心,28,平衡区带离心特点,梯度液密度范围含盖全部待分离颗粒密度离心过程中，颗粒不断沉降至其浮力密度与梯度液密度相等平衡离心分离方法,29,*差速和平衡区带离心异同,30,细胞分离离心设备分类,31,按离心机的作用方式：斜角式平抛式管式蝶式螺旋式,32,（1）斜角式离心机是一类结构最简单的实验室常用离心机。,33,平抛式离心机转子,（2）平抛式离心机一类结构简单的实验室常用的低中速离心机，转速一般在3000-6000rpm。,34,（3）管式离心机（tubular-bowlcentrifuge）,35,36,*管式离心机特点：结构简单。管状离心机可以安装冷却夹套，有利蛋白质分离。固体挂壁多时，可采用多台交替操作。适用于于分离乳浊液及含细颗粒的稀悬浮液，适用于固体含量低于1%，颗粒度小于5微米，黏度大的悬浮液澄清或固液两相密度差较小的分离。,37,工作原理,（4）碟片式离心机（disk-bowlcentrifuge）,38,（5）螺旋式离心机（scroll-typecentrifuge）,连续操作的沉降设备。转鼓内有可旋转的螺旋输送器，其转数比转鼓的转数稍低。有立式和卧式两种，卧螺机是一种全速旋转，连续进料、分离和卸料的离心机，最大离心力可达6000，操作温度可达300。用于分离含固量较多的悬浮液，生产能力较大。,39,卧式螺旋式离心机07s0041-44,40,卧螺机内部结构,41,螺旋式离心机工作原理,42,（6）多室式multichambercentrifuge,多室式离心机的转鼓内有若干同心圆筒组成的环状分离室，加长了被分离液体的流程，使液层减薄，增加了沉降面积，减少了沉降距离。同时还有粒度筛分的作用，悬浮液中的粗颗粒沉降到靠近内部的分离室壁上，细颗粒则沉降到靠近外部的室壁上，澄清的分离液经溢流排出。常用于抗菌素液液萃取分离，果汁和酒类饮料的澄清等。,43,细胞分离常用离心设备,带有灭菌装置的排渣碟片式离心机,加压喷嘴型碟片离心机，用于酵母和细菌的分离,44,5*离心机的选用原则,颗粒的大小、形状及硬度原料液的组成、密度及粘度产物热敏性,45,（三）过滤filtration,过滤操作是借助于过滤介质，在一定的操作压力p作用下，使悬浮液中的液体通过介质的孔道，而固体颗粒被截留在介质上，从而实现固液分离的单元操作。过滤介质filtermedium:过滤采用的多孔物质。,46,*（1）过滤推动力：悬浮液自身压强差、重力悬浮液的外加压力过滤介质的抽真空离心力*（2）过滤阻力：介质阻力滤饼阻力大多情况下，过滤阻力主要取决于滤饼阻力。,47,（3）过滤速率,rm表示介质的阻力；rc表示滤饼的阻力；l为滤液的粘度,48,（4）过滤速度的强化,a降低滤饼阻力b降低滤液黏度c降低悬浮液中悬浮固体的浓度对发酵液进行预处理，改善滤液性质。,49,典型过滤设备：,按操作方式分类：间歇过滤机、连续过滤机,按操作压强差分类：压滤、吸滤和离心过滤,实验室用抽滤装置板框压滤机（间歇操作）转筒真空过滤机（连续操作）过滤式离心机,（5）固液分离过滤设备,50,实验室用抽滤装置,51,板框压滤机plateandframefilter,板框压滤机的过滤推动力来自泵产生的液压或进料贮槽中的气压。,广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离。适合于固体含量1-10%的悬浮液的分离。,52,板框压滤机plateandframefilter,53,板框式压滤机在过滤时，悬浮液由离心泵或齿轮泵经滤浆通道打人框内，滤液穿过滤框两侧滤布，沿相邻滤板沟槽流至滤液出口，固体则被截留于框内形成滤饼。滤饼充满滤框后停止过滤。,54,*板框压滤机,优点,过滤面积大，结构简单，价格低，动力消耗少，对不同过滤特性的发酵液适应性强。,缺点,不能连续操作，设备笨重，劳动强度大，卫生条件差，非过滤的辅助时间较长。,55,自动板框式压滤机,自动板框压滤机在板框压紧；卸饼、清洗等操作中可自动完成，劳动强度小，辅助操作时间短。自动压滤机结构复杂，价格昂贵，在一定程度上限制了它的应用和发展。,56,真空转鼓过滤机（rotary-drumvacuumfilter）,57,1-转鼓；2-过滤室；3-分配阀；4-料液槽；5-摇摆式搅拌器；6-洗涤液喷嘴；7-刮刀,58,优点：转鼓真空过滤机可吸滤、洗涤、卸饼、再生连续化操作，生产能力大，劳动强度小。缺点：辅助设备多，投资大，且由于真空过滤，推动力小（不超过8104pa），滤饼湿度大（2030）。主要适用霉菌发酵液，对菌体细小、黏度大铺助滤剂。对于滤饼阻力较大的物料适应能力较差。,*转鼓真空过滤机,59,带式真空过滤机,带式真空过滤机（是自动连续运转、并能按工艺要求进行无级调速以及操作方便和动力消耗低的一种新型高效的脱水设备。,60,带式真空过滤机流程,61,结构：,转鼓(上有小孔，亦称悬框)；滤网；滤布；机架。,原理：,由于离心力作用，液体产生径向压差，通过滤饼、滤布及滤网而流出。,离心过滤机（centrifugalfilter）,62,*几种过滤设备的比较,63,第四章细胞破碎,掌握：各种细胞破碎方法、原理、优缺点及其适用范围。应用：采用不同的细胞破碎方法对细胞进行不同程度的破碎。,64,一、概述,大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。有些目标产物存在于生物体中。尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质是在细胞内沉积。脂类物质和一些有用酶包含在生物体中。,65,细胞破碎（cellrupture）技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。,66,二、常见细胞壁的结构,细菌,酵母,霉菌,葡聚糖,糖蛋白,蛋白质,几丁质,67,三、细胞破碎技术,压缩/撞击作用,剪切作用,撞击法,68,机械破碎,捣碎法研磨法匀浆法超声法,物理破碎,温度差破碎法压力差破碎法,化学破碎,有机溶剂表面活性剂酸碱,酶促破碎,自溶法外加酶制剂法,通过机械运动产生的撞击力、剪切力使组织、细胞破碎。,通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。,通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎,通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞壁结构受到破坏，而达到细胞破碎,三、*细胞破碎方法及其原理,69,（一）机械法,机械破碎法又可分为高压匀浆破碎法（homogenization）高速珠磨破碎法（beadgrinding）超声波破碎法（ultrasonication）,70,采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成）。,1高压匀浆法（high-pressurehomogenization）,（1）工作原理,71,高压匀浆机,72,（2）*高压匀浆法适用的范围,大规模细胞破碎的常用方法高压匀浆法适用的范围酵母和大多数细菌细胞的破碎；料液细胞浓度可以很高，20%左右。不宜使用高压匀浆法易造成堵塞的团状或丝状真菌；较小的革兰氏阳性菌；含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）。,73,(3)*影响高压匀浆器细胞破碎因素,被破碎的细胞分率符合如下公式：ln1/(1-s)=kpnb式中s破碎率；n循环次数；p操作压力，mpa；,74,升高压力有利于破碎减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就可达到几乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小。但p大到一定值时对匀浆器的磨损增加。在工业生产中，通常采用的压力为5070mpa。破碎性能还随菌体种类和生长环境的不同而不同大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎。生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基上容易破碎。破碎率随比生长速率降低而降低。,75,2珠磨法beadmill,wsk卧式高效全能珠磨机,76,（1）高速珠磨机工作原理,77,netzschlm-20型珠磨机,圆盘以两种位置交错地安装在轴上，一种处于径向，一种与轴倾斜，径向盘使磨料沿径向运动，倾斜盘则产生轴向运动。由于交错的运动，提高了破碎效率。,78,（2）*影响珠磨机破碎的因素,破碎作用符合下列公式：ln1/(1-s)=kts破碎率；k破碎速率常数；t停留时间。k与搅拌转速、细胞悬浮液浓度、玻璃小珠装量和珠体直径，以及温度等相关。,79,圆盘外缘的速度，5-15m/s；细胞悬浮液浓度，细菌60-120g/l，酵母140-180g/l；磨珠直径，0.2mm左右，工业不小于0.4mm；磨珠装量，一般80-90%；在破碎室的停留时间；,珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：可降低能耗、减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的困难。,80,喷雾撞击破碎,撞击破碎原理：细胞悬浮液以喷雾状高速冻结（冻结速度为数千/min），形成粒径小于50微米的微粒子，高速载气（如氮气，流速为300m/s）将冻结的微粒子送入破碎室，高速撞击撞击板，使冻结的细胞发生破碎。,81,3超声波破碎ultrasonication,超声波破碎法（ultrasonication)利用超声波振荡器发射的15-25khz的超声波探头处理细胞悬浮液。超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。,82,机理,jy92-iid超声波细胞破碎机,一般认为在超声波作用下液体发生空化作用（cavitation)。,3超声波破碎ultrasonication,83,（2）*超声波破碎的适用范围,超声波破碎适用于多数微生物的破碎。一般杆菌比球菌易破碎，g-细菌比g+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。超声波破碎的有效能量利用率极低。由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，但在实验室小规模细胞破碎中常用。,84,不同机械破碎方法的比较,85,非机械方法很多1酶解2化学法溶胞3物理法渗透压冲击冻融法其中酶法和化学法溶胞应用最广。,二,（二）非机械破碎方法,86,1酶解（酶溶法enymaticlysis),酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜。,87,溶菌酶,88,酶解法的优缺点,优点：发生酶解的条件温和。能选择性地释放产物。胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整。与机械法结合大大提高破碎率。,缺点：溶解酶价格高。溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶)。,89,某些化学试剂可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。,该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。,2化学渗透法（chemicalpermeation）,90,通用性差；时间长，效率低；有些化学试剂有毒。影响最终产物纯度,化学渗透法的优缺点,缺点,对产物释放有一定的选择性细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。,优点,91,渗透压冲击法冻融法,3物理法,92,（1）渗透压冲击法,渗透压冲击是较温和的一种破碎方法通过渗透压的改变，引起细胞快速膨胀而破裂。仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。,93,（2）冻融法,将细胞放在低温下冷冻（约-15），然后在室温中融化，反复多次而达到破壁作用。一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能。另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。,94,95,五、选择破碎方法的依据,细胞处理量；细胞壁强度和结构(高聚物交联程度、种类和壁厚度)；目标产物对破碎条件的敏感性；破碎程度；目标产物的选择性释放,96,四、*选择性释放目标产物的一般原则,(1)仅对目标产物的位置周围破碎(2)机械破碎法和化学法并用可使操作条件更加温和，在相同的目标产物释放率条件下，降低细胞的破碎程度。,97,讨论题：青霉素酰化酶细胞破碎的研究一.化学法20%(w/v)大肠杆菌悬浮液+b.a37搅拌高速离心测上清液酶活,1.处理时间r%3h,2.丁酯用量条件：37，搅拌3小时适宜的b.a加量为12%，释放率r=55%,98,二.化学法冻融法结合加b.a(12%,37搅拌3h）菌悬液冻融(冻结14h融化)释放率70%；比活2.69u/mg,三.化学超声波振荡法结合先丁酯处理，再超声波（90秒），释放率72%小型设备，不能工业大规模生产。四.高压匀浆法20%(w/v)菌悬液，p=50mpa，n=3。释放率r=38.4%，原因:细胞破碎后,仍有较多酶吸附在细胞碎片上。五.高压匀浆化学法结合先高压匀浆，再加10%丁酯，37搅拌3h，高速离心(3万rpm)，释放率：r=60%六.珠磨直径0.4mm玻璃珠。释放率：r=95%,99,七、破碎率的测定,细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。,直接测定法目的产物测定法导电率测定法,采用染色法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。如破碎的革兰氏阳性菌可染成革兰氏阴性菌的颜色；采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫色，而受损害的细胞呈亮红色。,将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中目的产物含量或活性，并与100%破碎率的标准值比较，计算其破碎率。,100,七、破碎技术的研究方向,多种破碎方法相结合,化学法、酶法、机械法相结合。酶法与高压匀浆、超声波震荡、鳌合剂、渗透压法结合如用溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，95mpa压力下匀浆4次，总破碎率接近100%。而单独采用高压匀浆法，同样条件下破碎率只有32%。有机溶剂与冻融法结合,101,破碎技术的研究方向-与上游过程相结合,在生长后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑制剂，继续培养后，新分裂的细胞其细胞壁有缺陷，利于破碎；选择较易破碎的菌种作为宿主细胞；用基因工程的方法对菌种进行改造。,102,破碎技术研究方向-与下游工程相结合举例：萃取破碎法提取酵母醇脱氢酶,103,生物分离过程的一般流程,104,*包含体：基因工程菌中外源蛋白高水平表达，导致错误折叠和聚集，形成不溶性的无生物活性的聚合物。目标蛋白一级结构是正确的，但立体结构是错误的。高表达产生的积聚物在细胞内部形成不溶物原因？,一、包含体的构成,105,外源蛋白在大肠杆菌中的积累,106,外源基因表达产物在原核细胞中易于形成包含体，用于蛋白质药物开发。蛋白质在体内的错误折叠和聚集可能与许多疾病有关，如帕金森症、疯牛病、老年性痴呆症、亨廷顿舞蹈症等。,107,蛋白质“折叠病”,疯牛病，它是由一种称为prion蛋白质的感染引起的，致病prion蛋白与正常prion蛋白的一级结构完全相同，只是空间结构不同。,正常的prion蛋白,病变的prion蛋白,108,收集菌体细胞,细胞破碎,包含体的洗涤,包含体的变性溶解,目标蛋白的复性,包含体的提取,*获得目的蛋白的方法,109,包含体纯化工艺路线(一),机械破碎(高压匀浆）,离心提取包含体,粗包含体洗涤,离心沉降回收包含体,二包含体的纯化和溶解,110,包含体纯化工艺路线（二）,离心回收细胞,酶法和机械法破碎细胞,核酸水解,包含体洗涤,离心回收包含体,111,洗涤剂：螯合剂（edta）、温和的表面活性剂（tritonx-100）、低浓度的变性剂（尿素或盐酸胍）等。能溶解除去部分膜蛋白和脂质类杂质。洗涤剂浓度：以溶解杂质，不溶解包含体中表达产物为原则。,包含体的洗涤,112,常用变性剂：6-8mol/l盐酸胍和8mol/l尿素；表面活性剂，如1-2sds、ctab；-巯基乙醇1-200mmol/l螯合剂，如2mmol/ledta影响变性因素：时间、ph、离子强度、变性剂种类和浓度。,包含体的溶解,113,折叠状态,尿素、-巯基乙醇,去除尿素、-巯基乙醇,非折叠状态，无活性,114,二、蛋白质复性,115,分子内折叠和分子间聚集的动力学竞争过程。,蛋白质复性过程,116,蛋白质复性：动力学竞争过程,分子内折叠：1级反应分子间聚集：2级反应（或2级以上）,蛋白质体外复性的主要挑战：创造适宜的复性操作条件，促进正确折叠、抑制聚集体生成，提高复性收率。,117,主要影响因素,变性剂浓度（脲、盐酸胍）氧化还原剂浓度、比例ph蛋白质稳定剂（甘油、海藻糖）蛋白质浓度杂质种类和含量变性剂浓度（脲、盐酸胍）蛋白质聚集抑制剂（聚乙二醇、表面活性剂）盐的种类、浓度混合效率温度,118,1、模仿体内蛋白质折叠过程：构建适于蛋白质正确折叠的环境，设计能够促进蛋白质正确折叠、抑制折叠中间体聚集的折叠助剂（foldingaids，foldingmodulators）。2、发挥体外折叠的独特优势：构建体内不可能存在的独特环境，实现高效复性和分离纯化：色谱、反胶团、膜、双水相系统、沉淀,体外复性研究的核心问题：,119,降低变性蛋白质溶液中变性剂的浓度，创造适宜的氧化还原环境，可引发蛋白质折叠复性；操作模式：直接稀释、透析、流加,1*稀释复性,120,直接稀释（directdilution）将少量变性蛋白质溶液直接加入到较大体积的复性缓冲液中，变性剂浓度降低，蛋白质开始复性。,121,蛋白质浓度对收率和浊度的影响,0.5mol/l盐酸胍，5mmol/lgssg，2mmol/ldtt，1mmol/ledta，50mmol/ltris，ph8，22oc；复性时间：3h,122,流加稀释复性（fed-batchdilution）复性液中蛋白质初始浓度0。边流加、边复性。故变性蛋白质浓度始终保持在较低水平，有利于提高复性收率，且终浓度较高。,123,透析复性（dilutionbydialysis）变性蛋白质溶液中，变性剂浓度降低（小分子折叠助剂浓度增大），蛋白质开始复性。,124,*蛋白质复性特点稀释复性小结,低浓度下进行复性操作有利于提高复性收率；浓度提高则聚集体生产速度加快，复性收率下降;流加复性有利于实现高浓度下的高收率复性;抑制聚集体的生成，是提高复性收率的关键！,125,折叠中间体之间的疏水性相互作用是聚集的主要原因。可利用小分子添加剂抑制此疏水性相互作用。也可利用折叠助剂抑制聚集体生成和/或促进折叠，提高复性收率。,2辅助复性,126,具有辅助蛋白质复性作用的稀释添加剂（1）,127,具有辅助蛋白质复性作用的稀释添加剂（2）,128,1、稳定天然蛋白质结构，促进正确折叠产物的生成。甘油、海藻糖、蔗糖2、抑制分子间作用，降低聚集体生成速度。变性剂、表面活性剂、精氨酸、丙酮,添加剂的两种作用,129,蛋白质体内折叠是在各种折叠调解因子（modulators）和蛋白酶的共同作用下完成的；调解因子：分子伴侣（chaperones)和折叠酶（foldases）,折叠助剂（foldingaids）,130,invivoproteinfolding,体内折叠：是在一系列折叠酶、分子伴侣和水解酶的辅助下完成的。,f.baneyx,m.mujacic:naturebiotechnology,2004,22:1399,131,（1）分子伴侣/折叠酶辅助蛋白质体外复性利用纯化的分子伴侣和/或折叠酶（单独/共同）作用，辅助蛋白质体外复性。直接模拟invivofolding的复性方法。,体外蛋白质复性的策略,132,1.顶端区2.中间区3.赤道区4.groes5.底物蛋白质,应用于体外复性的分子伴侣,groel/es的结构和作用,作用：groel结合伸展的肽链或折叠中间态，在atp和groes的存在下，水解atp释放蛋白和能量，促进蛋白质折叠复性。,133,模仿groel/es的作用