多粮兼香型白酒窖内发酵动态变化初探.docx

多粮兼香型白酒窖内发酵动态变化初探周瑞平1，游玲2，陈云宗1，刘超1，江东材1，唐代云1（1.四川省宜宾市叙府酒业股份有限公司技术中心 ，四川宜宾 644000；2.发酵资源与应用四川省高校重点实验室 ，四川宜宾 644000）摘 要：分 析 了 多 粮 兼 香 型 白 酒 窖 内 发 酵 过 程 中 糟 醅 酒 度 、残 糖 、残 淀 、总 酸 、总 酯 以 及 微 生 物 群 落 的 动 态 变 化 。 发 现多 粮 兼 香 型 发 酵 的 主 发 酵 期 在 发 酵 前 30d完 成 ，这 一 时 期 在 酵 母 发 酵 及 霉 菌 的 糖 化 作 用 下 ，酒 度 达 到 最 高 值 6.47度 ， 残 糖 迅 速 下 降 ，残 淀 快 速 分 解 ；30d后 ，下 层 糟 醅 已 没 有 酵 母 存 活 ，在 兼 性 厌 氧 细 菌 及 厌 氧 细 菌 的 作 用 下 ，有 机 酸 、总 酯 开 始 快 速 增 长 。整 个 发 酵 阶 段 ，丝 状 真 菌 和 细 菌 分 别 出 现 了 2次 和3次 峰 值 。该 研 究 结 果 对 解 析 兼 香 型 白 酒 窖 内 发 酵 过 程 具 有 重 要 的 参 考 价 值 。关键词：多 粮 兼 香 型 白 酒 ，物 质 变 化 ，微 生 物dynamic changes of the multi-grain andflavor liquor cavities fermentationzhou rui-ping1，you ling2，chen yun-zong1，liu chao1，jiang dong-cai1，tang dai-yun1（1.technical center of yibin xufu liquor industry co.，ltd.，yibin 644000，china；2.key laboratory of fermentation resources and application，universities of sichuan province，yibin 644000，china）abstract：the dynamic change of fermented grains alcohol，residual sugar，residual starch，total acids and totalesters and microbial communities in the fermentation process of multi -grain of the flavor liquor cavities were analyzed in this paper . the result showed that the main fermentation period of multi - grain and flavor fermentation completed within 30d in the fermentation. during this period，the maximum alcohol reached 6.47in the saccharification of yeast and mold. at the same time，the residual sugar declined rapidlly and the residue amylin resolved swiftly. after 30d，there was no yeast surviving in lower grains. the organic acids and esters increased rapidlly in the role of facultative anaerobic bacteria and anaerobic bacteria.in the fermentation stage ， filamentous fungi and bacteria appeared peak 2 and 3 times respectively. the result of the analytical and flavor liquor cavities fermentation process had important reference value.key words：multi-grain and flavorliquor；changes of substance；microorganism中图分类号：ts201.2文献标识码：a文 章 编 号：1002-0306（2012）18-0214-04“一步法多粮浓酱兼香型白酒生产方法”1是我公司自主研发的白酒新工艺，其主要特点是有机融合 了酱香型白酒工艺中高温堆积和浓香型白酒泥窖发 酵工艺，目前该新工艺已实现规模化生产2。在中国传 统白酒发酵中，尽管乙醇是主发酵产物，但酸、酯等物 质是重要的呈香呈味物质，其含量和协调性决定了产 品的品质和风格3。与传统浓香型白酒酿造一样，该新 工艺需要在泥窖中发酵。而长期的生产实践和研究均 表明，入窖糟醅的组成对发酵过程中糟醅乙醇、残糖、 残淀、总酸、总酯以及微生物等指标变化有至关重要 的影响4-6。对“一步法”多粮兼香型工艺条件下窖内糟 醅乙醇、残糖、残淀、总酸、总酯和微生物等指标的变化情况进行分析和研究，对比浓香型白酒窖内发酵情况，不仅有助于探明兼香型白酒酿造过程中酱香风味 的形成机理，还可在此基础上，找到提高兼香型白酒 质量的工艺控制点，改进和完善兼香型白酒酿造工艺。材料与方法11.1 材料与仪器出酒率及优质酒率稳定且相似的优质泥窖（30 年以上）10口、工艺特点为提高了23品温的偏高温 大曲、按浓香型白酒常规“跑窖法”工艺经堆积发酵后投入窖池的粮糟 宜宾叙府酒业股份有限公司。 电热恒温鼓风干燥箱dhg-9203as宁波江南 仪器厂；紫外可见分光光度计t6新世纪 北京普析仪器有限公司；oil-less vacuum pump ht-vp-30 广 州海太光电生物科技有限公司；电热恒温培养箱hh. b11.600-bs- 上海跃进医疗器械厂；净化工作台 sw-cj-2d 宁波江南仪器厂；电热立式压力蒸汽灭菌器yxq-l31-400 四川新德机械有限公司。收稿日期：20120428作者简介：周 瑞 平 （1975-），男 ，大 学 本 科 ，工 程 师 ，主 要 从 事 酿 酒 微 生 物 、酿 酒 工 艺 方 面 的 研 究 。基金项目：四 川 省 科 技 厅 支 撑 项 目 （2010sz0229）；四 川 省 经 委 重 大 产 业 创 新 专 项 （2010yb00165）；宜 宾 市 引 进 高 层 次 人 才 项 目（2011yg02）。实验方法1.2214 2012年第18期76）g 5001 4/g（度 3上层酒 2中层1下层00 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90时间（d）图4 发酵过程中窖内糟醅酒度的变化趋势fig.4 changes of fermented grainsalcohol degree in fermentation process生 物 工 程vol . 33 , no . 18 , 2012发酵时间为2011年69月。入窖糟醅根据不同层次水分控制在56%58%，酸度控制在2.02.2度，淀粉 控制在18%20%。取样时间根据温度变化定为0（入窖）、6、15、30、50、70、90d（出窖）对窖内上层（距地平面0.5m）、中层（距地平面1.2m）、下层（距地平面2.0m） 每层次糟醅四角及中心共5点取样混合检测。其中，总酯用皂化反滴定法检测7，酒度采用重铬酸钾分光光度计法于600nm波长处测定，总酸、残糖和残淀 检测方法见参考文献8，细菌、酵母菌和霉菌在发酵 过程中的数量变化趋势用梯度稀释平板计数法检 测9。来自10口窖池的检测数据取平均值进行分析。下层糟醅，也印证了这一点。值得注意的是，虽然霉菌衰亡后其孢子囊在酸的刺激下可破裂释放更多孢 子，导致后期霉菌计数结果出现第二次峰值，甚至超过发酵前期的霉菌数量，但实际上霉菌从发酵20d后就已经不再参与窖内发酵进程。因此，实际上霉菌的 营养体细胞对窖内无氧环境的耐受性不如酵母（酵母直到发酵50d时仍可检出）。对细菌而言，整个发酵过程中出现了三次峰值， 且30d时峰值最大。发酵前7d，糟醅中含有丰富的氧气，所以此时的细菌以好氧为主，且上层糟醅中的细菌数量大于中下层糟醅也印证了这一点；随着窖内 氧气的减少和乙醇的生成，不耐乙醇的好氧菌开始衰亡，同时兼性厌氧菌开始生长繁殖，在30d时达到了二次峰值，随着窖内有机酸开始大量生成，空气被 消耗殆尽，不耐酸的厌氧菌开始衰亡，同时兼性厌氧（或厌氧）并且嗜酸的细菌开始大量生长，在70d时达到第三次峰值，此时下层糟醅细菌数量大于中上层 糟醅也论证了上述观点；后期因碳源的消耗和代谢产物的反馈抑制，各层次细菌开始衰亡。看出影响整个发酵过程中细菌数量的主要因素是糟醅中的溶 氧、乙醇浓度和有机酸浓度。2.2糟醅酒度的变化趋势结果与分析22.1 糟醅微生物的变化趋势整个兼香型白酒发酵过程中，不同种类的微生 物体现出明显不同的数量变化趋势（图1图3）。对酵母和霉菌这类需氧微生物，其峰值出现在发酵前期，在主发酵期结束时迅速衰亡，说明窖内影 响酵母、霉菌生长的主要限制因素是糟醅中的氧气 含量，同时，上层糟醅中的酵母和霉菌数量均大于中兼香型白酒发酵过程中，各层糟醅中的乙醇浓度随着时间的推移都在不断增长（图4），其乙醇的主要 生成期在发酵前15d。在15d时上层和中层达到最高 值5.41度和5.62度，15d后发酵进入以产酸、产酯为主 的阶段，同时乙醇在酯化作用和呼吸作用下开始下 降，在30d时分别到达最低值4.38度和4.16度，这与酵 母菌数量变化规律一致；下层糟醅15d后还在增长，可 能是上中层乙醇受氢键和重力的沉积效应10比下层 酯化作用和呼吸作用更加明显，因此延迟到30d才达 到最高值6.47度；50d后各层次乙醇浓度趋于稳定。 在整个工艺中，所用曲药发酵力不如浓香型大曲，窖 内温度上升速度较为缓慢，延长了酵母在窖内生长 代谢的时间，实质上增大了酵母对窖内发酵的影响。2.3糟醅淀粉、还原糖的变化趋势发酵过程中，糟醅上、中、下各层残糖值和残淀 值是综合10口窖后的平均值，结果见图5图6。在发酵过程中，残淀整体呈下降后趋于平稳的态势。发酵初期，糟醅中有丰富的营养物质和空气， 使霉菌快速生长繁殖，在曲药淀粉酶以及快速生长的霉菌共同作用下，淀粉质原料快速分解，而此时酵母215 2012年第18期生 物 工 程scienceandtechnologyoffoodindustry平缓下降，而且出窖糟醅的总酸值比传统浓香型要高，这与兼香型基酒的总酸大于浓香型基酒总酸的 规律是一致的13。糟醅中各种物质形态不断的产生和消失，通过窖池内物质链的传递形式体现能量代谢的变化，最终使 各种香型类白酒形成与众不同的成分构成和风格特征14。其中，由微生物酯化合成15的酯类物质对白酒风格的形成和风格的典型性起着至关重要的作用。从图8可看出，在整个发酵期内糟醅总酯的含量都在不断上升，下层尤为明显。在030d从0.36g/100g 缓慢增长到0.58g/100g，可能因前期窖内醇、酸、酯处 于平衡状态以及微生物主要作用是发酵，而且糟醅原材料中也含有一定量的总酯，从而对微生物酯化 合成的代谢有一定的屏蔽作用，30d后微生物对底物 的分解作用减弱，窖内总酸开始大量的生成，各种醇类大量的积累打破了窖内醇、酸和酯的平衡，促进酯 化反应向合成酯的方向进行，同时在代谢旺盛的兼性厌氧细菌所产的酯化酶作用下，糟醅总酯开始快 速增长，在70d达到1.63g/100g后，随着窖内合成酯的 前驱物质逐渐减少和具有产酯功能的微生物逐渐衰亡，窖内环境开始趋向于新的平衡，所以糟醅总酯的 增加幅度也变缓慢，最终出窖时达到1.81g/100g。菌处于生长繁殖阶段，消耗还原糖比较少，所以还原糖由于淀粉分解而不断积累；发酵中期，随着酵母菌 数量增多，发酵作用加快，还原糖被代谢旺盛的酵母菌快速消耗，含量迅速下降，直至主发酵期结束；发酵后期，上层、下层糟醅的还原糖含量再次上升，并 于发酵50d时达到峰值，一方面由于兼性厌氧细菌所 产的糖化酶对淀粉的再次分解，另一方面因黄水下渗 导致中层糟醅中的还原糖转移到下层糟醅。因此，中 层糟醅还原糖含量，在发酵后期没有出现明显增长。糟醅总酸、总酯的变化趋势从图7可看出，窖内糟醅总酸在60d前不断增长， 其中下层在030d内从20.28度上升到24.96度，然后 开始快速的增长，在60d达到最高值44.00度，最后缓 慢下降到出窖时的41.11度。因所用曲药延长了窖内 主发酵期，抑制了乳酸菌的生长代谢，所以窖内糟醅 总酸快速增长的峰值时间比传统浓香型推迟，这与 李光辉研究的酵母菌与兼性厌氧细菌彼此消长的结 果相吻合11。发酵后期可能因微生物产酸作用减弱 而酯化作用加强12或者是由于窖内总酸含量太高抑 制了产酸细菌的生长代谢，所以糟醅总酸含量开始2.4结论兼香型白酒发酵过程中，糟醅理化指标和微生 物变化趋势与传统浓香型白酒的变化规律16一致， 其特征为：a.主发酵期延长至15d。乙醇发酵的主产期在前15d几乎完成，下层因沉积效应30d达到最高值6.47度。b.发酵前期酵母菌、霉菌、好氧细菌大量生长繁 殖，表明窖内影响霉菌、酵母生长的主要因素为糟醅氧气含量，发酵中期兼性厌氧细菌为窖内优势微生物，后期为兼性（或厌氧）嗜酸菌。c.在发酵的不同阶段，窖内不同层次糟醅内的微 生物群落构成或功能，由于氧气含量的差异而明显 不同，导致不同层次糟醅内因微生物酶主导的物质 转化情况有所不同。同时，由于黄水对糟醅内可溶物 质的下淋作用，导致不同层次淀粉、还原糖等物质含 量有明显差异，表现在下层糟醅内可溶性物质含量 略高于中上层糟醅。d.与浓香型白酒一样，发酵后期主要是产酸产 酯，但本工艺所用曲药使窖内发酵过程更加缓慢，导（下 转 第396页 ）3216 2012年第18期专 题 综 述science and technology of food industry10 黄璐瑶，廖林川，陈礼莉，等. 硼氢化钠氯化镍还原一gc/tsd法检测血液和尿液中百草枯j. 法医学杂志，2008，24（6）：429-432. 11 norberto c. posecion，enrique m. ostrea，dawn m. bielawski.quantitative determination of paraquat in meconium by sodium borohydride - nickel chloride chemical reduction and gaschromatography / mass spectrometry （ gc / ms ） j . journal ofchromatography b，2008，862：93-99.12 王 朝 虹 ， 王 忠 ， 刘 学 俊 ， 等 . lc/ms/ms 法测定生物组织中 百 草 枯j. 中国法医学杂志 ，2008，23（2）：114-115.13 刘育清，顾辉，方国斌，等. 百草枯液相色谱分析方法的探讨c. 第九届全国农药质量管理与分析技术交流会-论文集：170-173. 14 秦 叶 民 ，沈 菁 ，於 幼 鸿 . 高效液相色谱法测定百草枯阳离 子c. 第9届全国离子色谱学术报告会论文集 ，2002.15 王 瑞 花 ，苏 少 明 ，秦 光 明 ，等. 离 子 对spe-hplc 法 检 测 生 物检材中的百草枯j. 法 医 学 杂 志 ，2005，21（2）：121-123.16 yuangao zoua，yunying shib，yangjuan baia. an improvedapproachforextractionandhigh - performance liquid chromatography analysis of paraquat in human plasmaj. journalof chromatography b，2001，879：1809-1812.17 孙 秀 兰 ，杨 婷 婷 ，张 银 志 . 粮食中百草枯残留的金标免疫 层析检测方法研究j. 分 析 测 试 学 报 ，2010，29（5）：507-510. 18 贺筱蓉，肖海军. pva-sbq固定叶绿体及其生物传感器在检 测除草剂中的应用j. 应用与环境生物学报，2002，8（5）：497-501. 19 卞 倩 茜 ，刘 应 凡 ，于 俊 生 . cdte/cds半导体量子点作为农 药百草枯的高灵敏传感器 j. 高 等 学 校 化 学 学 报 ，2010 ，31（6）：1118-1125.20 d d souza，s a s machadoelectrochemical detection of the herbicide paraquat in natural water and citric fruit juices usingmicroelectrodesj. analytica chimica acta，2005，546（1）：85.21 m e ghiea， c m a brett.a glucose biosensor using methyl viologen redox mediator on carbon film electrodes j. analytica chimica acta，2005，532（2）：145.22 t h h， i w sun.electrocatalytic determination of paraquatusing a nafion film coated glassy carbon electrode j. talanta ，2000，53（2）：4431.23 j m zen，s h jeng，h j chendetermination of paraquat by square -wave voltammetry at a perfluorosulfonated ionomer/ clay-modified electrode j. analytical chemistry，1996，68 （3）：498-501.24 王 丽 娟 . 胶 束 毛 细管电泳在线推扫富集技术在兽药残留 中 的 应 用d. 保 定 ：河 北 大 学 ，2008.25 成 美 容 ，王 园 朝 ，肖 亮 . 毛细管电泳一间接电化学发光法 对茶叶中百草枯农药残留的检测 j. 分 析 测 试 学 报 ，2009，28（12）：1444-1447.26 屈 永 霞 ，黄 杉 生 ，李 瑞 娜 ，等. 碳纳米管传感器方波伏安法 检测环境水样中的百草枯j. 分 析 实 验 室 ，2008，27（7）：35-38. 27 范 向 明 ，何 晓 英 ，张 艳 ，等. 百草枯在碳纳米管与离子液体 复合修饰电极上的电化学行为及测定j. 分 析 测 试 学 报 ，2010，29（4）：341-346.28 d. de souza，s a s. machado. electrochemical detection of the herbicide paraquat in natural water and citric fruit juices using microelectrodesj. analytica chimica acta，2005，546：85-91.29 m a el mhammedia，m bakasse b，a chtaini. electrochemicalstudies and square wave voltammetry of paraquat at natural phosphate modified carbon paste electrodej. journal of hazardousmaterials，2007，145：1-7.!（上 接 第216页 ）致窖内有机酸的快速增长时间推迟到30d。总酯从30d开始快速增长，出窖时达到1.81g。在生成酯总量 不变的前提下，兼香型基础酒中各种酯类的比例和口感出现明显的不同，说明一方面曲药中的一些风味物质前体对风味有更加明显的影响，另一方面这 种差异也会改变窖内各种酸、醇的比例及不同酯化反应的速度，最终导致兼香型白酒发酵生成酯的种类与浓香型白酒相比产生明显差异。通过对发酵过程中糟醅多种物质成分和微生物 变化规律的检测分析，验证了“一步法”生产兼香型 白酒的工艺是一项具有独特性的新工艺，为“一步法” 生产兼香型白酒建立窖池微生态资源数据库，为进 一步完善“一步法”兼香型工艺提供了重要的理论依 据和实践基础，对兼香型白酒生产具有重要的意义。参考文献5 吴 建 军 ，张 江 雄. 浓香型白酒的配料与窖内升温j. 食 品 与机 械 ，2004（4）：12-15