家族性隐睾外显子组测序分析---优秀毕业论文 参考文献 可复制黏贴.pdf

硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 题题 目目 家族性隐睾家族性隐睾外显子组测序分析外显子组测序分析 英文题目英文题目 genetic analysis of familial cryptorchidism by whole exome sequencing 姓名 杨锐林 学 号 200471082 所 在 学 院 医学院 导 师 姓 名 蔡志明 专 业 泌尿外科 李泽松 入 学 日 期 2009 年 10 月 答 辩 日 期 2011 年 5 月 学校编码：10560 分类号_密级_学 号：200471082 硕 士 学 位 论 文 家族性隐睾外显子组测序分析 genetic analysis of familial cryptorchidism by whole exome sequencing 研研 究究 生生 姓姓 名：名： 杨锐林杨锐林 导导 师师 姓姓 名：名： 蔡志明蔡志明 李泽松李泽松 专专 业业 名名 称：称： 泌尿外科泌尿外科 论文 提交日论文 提交日 期期： 2011 年年 5 月月 论文答辩日期论文答辩日期： 2011 年年 5 月月 学位论文原创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的工作研究及取得的研究成果。论文中除了特 别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。对 本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在论文中以明确方式标明。本人完全意识到本声 明的法律责任由本人承担。 作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文使用授权声明 本人授权汕头大学保存本学位论文的电子和纸质文档，允许论文被查阅和借阅；学 校可将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其 它复制手段保存和汇编论文；学校可以向国家有关部门或机构送交论文并授权其保存、借 阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容。对于保密的论文，按照保密的有关规定和程 序处理。 本论文属于：保密（ ） ，在 年解密后适用本授权声明。 不保密（ ） 。 （请在以上括号内打） 作者签名： 导师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 目 录 中文摘要中文摘要 1 英文摘要英文摘要 2 第一章第一章 前前 言言 3 1 隐睾的研究概况 3 2 单核苷酸多态性（snp）与外显子测序 4 3 外显子测序与疾病研究 4 4 外显子测序技术原理与特点 5 5 生物信息学分析和 snps 验证 7 第二章第二章 实验材料与方法实验材料与方法 10 1 材料与方法 10 1.1 主要实验设备和试剂 10 1.2 病史采集及数据管理 10 2 实验方法 11 2.1 标本的收集、处理及保存 11 2.2标本dna提取 12 2.3 外显子组测序方法 13 2.4 外显子组测序的信息分析流程 14 2.5 snp 验证策略 15 第三章第三章 结结 果果 16 1 家系图 16 2 外显子组测序数据 16 3 snps分析结果 17 4 snps 验证结果 19 第四章第四章 讨论与结论讨论与结论 22 1 讨论 22 2 结论 23 参考文献参考文献 24 附录附录 文献综述文献综述 27 泌尿生殖系统单基因病研究进展 27 致致 谢谢 36 个人简历个人简历 37 文章发表情况文章发表情况 38 摘 要 - 1 - 中 文 摘 要 家族性隐睾外显子组测序分析家族性隐睾外显子组测序分析 杨锐林 1 蔡志明2 1 汕头大学医学院 汕头 515031 2 北京大学/香港科技大医学中心泌尿外科研究所 深圳市第二人民医院 深圳 518036 目的目的 隐睾是男性生殖系统常见的先天性疾病，不育和癌变是其最严重的并发症， 其分子遗传学的研究对该病的防治有着重大意义。外显子组测序是目前寻找疾病致病病 因、易感基因的一种快捷、经济、高效的研究手段。本实验对家族性隐睾患者家系进行外 显子测序分析，探讨隐睾新的候选基因。 方法与结果方法与结果 利用外显子捕获技术和新一代外显子测序技术，对家族性隐睾症三代四 人发病中的两名患者与一名正常者进行外显子组信息分析，在 3 个标本中检测到单核苷酸 多态性的数目分别为 23,989 个，26,171 个和 24,427 个，其中 14,597 个单核苷酸多态性为 3 个标本所共有，其中包括了已报道的影响睾丸下降的 g 蛋白偶联受体 great 基因 3 个 单核苷酸多态性；通过基因聚族分析在该家系中发现 grid1 基因等 7 个与 great 基因作 用通路功能相似的基因族。利用生物信息学和千人基因组数据库比对分析方法，排除家族 成员遗传差异和常见单核苷酸多态性，得到 39 个与隐睾密切相关的非同义单核苷酸多态 性；利用 sanger 测序方法对 10 例隐睾患者进行测序验证，最终把家族性隐睾相关的候选 基因确定为 fcgr3a 基因。 结论结论 外显子测序技术让对少数家族性隐睾患者进行测序分析发现候选基因突变成 为可能。候选基因 fcgr3a 的发现，对今后阐明该病发病机制、遗传诊断和为临床实践提 供基础具有重要的研究和应用价值。 关键词关键词 外显子组测序；隐睾；fcgr3a 基因；单基因病 摘 要 - 2 - abstract genetic analysis of familial cryptorchidism by whole exome sequencing ruilin yang 1 zhiming cai 2 1 shantou university medical college, shantou, china 2 the key laboratory of stem cell biology, guangdong and shenzhen key laboratory of male reproductive medicine and genetics, institute of urology, peking university shenzhen hospital, shenzhen pku-hkust medical center, shenzhen, china; shenzhen second peoples hospital, shenzhen, china background: cryptorchidism represents the most common congenital malformation in newborn boys. it is of public health importance because it may cause infertility in the human male, and it is a high risk factor for testicular cancer. exome sequencing is a powerful strategy that can be applied to relatively few cases. to refine our knowledge of the genetic mechanisms involved in testicular descent, we carry out a strategy of exome sequencing to analyze the genetic inheritance in a cryptorchidism family. methodology/principal findings: we sequenced the whole exome of two affected members of cryptorchidism family and one normal member of this family. exon-enriched dna was sequenced by the illumina genome analyser ii platform. as a result, 23,989 snps were detected in the patient sample, while 26,171 snps in patients younger brother and 24,427 in patients father. 14,597 snps were position shared between these three samples which including 3 snps of great gene. considering that great gene involves in the pathway of neuroactive ligand-receptor interaction, we also found another 7 genes in the same pathway as great gene were prone to mutate in cryptorchidism patients by clustering analysis. by excluding those snps present in the patients younger brother from the shared snps and using the chb/jpt data released as a part of 1000 genome project, we detected 39 non- synonymous snps. we then screened these snps in 10 other samples diagnosed with the same condition. as a result, one specific-mutation at gene fcgr3a is shown to mutate in all these 10 samples. conclusions: exome sequencing can be established as a good tool for uncovering the genetic causes of familial cryptorchidism. the specific-mutant in fcgr3a gene found can play an important role as disorder-specific mutant/gene in the genetic inheritance of familial cryptorchidism. keywords: whole-exome sequencing; cryptorchidism; fcgr3a; single-gene disorder 前 言 - 3 - 第一章第一章 前前 言言 1 隐睾的隐睾的研究概况研究概况 隐睾是男性生殖系统常见的先天畸形，发病率较高。早产儿的发病率约为 30%，新生 儿为 3.4%-5.8%。出生后睾丸仍有继续下降可能，6 个月后，睾丸继续下降机会明显减少， 至 1 岁时患儿的发病率下降至 0.66%，至成年以后仍有 0.3%1的患病率。由于睾丸下降不 全，睾丸长期处于高温环境中，将造成睾丸生精功能损害，发展成肿瘤的概率也增加2 ， 这使得对隐睾的防治显得尤为重要，也是隐睾治疗的重点和难点。 隐睾可以是一种独立的疾病，也可能是染色体异常的遗传性疾病和内分泌疾病伴随的 症状， 其基因水平的发病机制仍然不清。 在睾丸下降过程中， 胰岛素样激素 3(insl-3,insulin like factor3)与影响睾丸下降的 g 蛋白偶联受体(great/lgr8,g-protein-coupled receptor affecting testis descent/leucine-rich repeat-containing g protein-coupled receptor8) 的两个基因 控制索状引带和腹股沟韧带的分化发育， 是普遍认为的导致人类隐睾症的两个主要因素3， 其它与隐睾相关的研究包括 er， hoxa10 和 fgfr1 基因突变等4, 5。 动物实验基因分析表明， insl-3 与 great 基因中的部分基因编码功能性有害产物 可直接导致隐睾6，目前在人群中已发现不少 insl3 和 great 基因的多态性 7。在隐睾 患者的病史中， 22.7%的隐睾病人有家族史8， feng 等人9发现了 insl-3/great 等位基因 的多态性且与家族性隐睾有关，但它们各自单独不能说明人类散发性与家族性隐睾的主要 原因。据美国单基因病数据库（omim）统计，目前大概有 250 多项与隐睾相关的记录， 推测在家族性隐睾的患者中存在着单基因病的遗传模式，为常染色体显性遗传或常染色体 隐性遗传，其基因定位于 13q13.1 或者 19p13.2（表 1-1）10。 表 1-1：已明确病因的疾病 phenotype description, molecular basis known 疾病疾病 疾病疾病 遗传遗传 位点位点 omim cryptorchidism 隐睾 ad/ar 13q13.1, 19p13.2 #219050 alport syndrome 遗传性肾炎 x-linked xq22.3 #301050 hematuria, benign familial; thin membrane nephropathy 良性家族性血尿 ad 2q36-q37 #141200 medullary cystic kidney disease 多囊性肾脏病 ar 16p12.3 #603860 前 言 - 4 - 运用传统的分子生物学方法和技术确定insl3/great8等位基因的多态性且与家族性 隐睾有关。对于部分家族性隐睾存在单基因病遗传模式的情况下，传统的单基因病研究有 赖基于家系研究的连锁分析，但对中效甚至弱效的突变和突变基因的精细定位有局限性， 新一代技术的出现，利用大规模平行测序集合外显子捕获技术，对少数典型家族性隐睾患 者进行分析将有助于定位致病基因并阐明疾病的发病机11。 2 单核苷酸多态性（单核苷酸多态性（snp）与外显子与外显子测序测序 人类基因组计划之后的后基因组时代，寻找和研究单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism， snp)已成为疾病研究的主要内容和目标。snp 在医学遗传学方面，不仅 可用于寻找致病基因，还可用于诊断疾病，尤其是单基因遗传病12。snp 是指在基因组水 平上由于单个核苷酸位置上存在转换(c 与 t 互换，在其互补链上则为 g 与 a 互换)或颠换 (c 与 a，g 与 t，c 与 g，a 与 t 互换)等变异所引起的 dna 序列多态性，是继微卫星之 后的第三代遗传标记， 人类可遗传的变异中最常见的一种， 占所有已知多态性的 90%以上。 外显子是人类基因的一部分，全部外显子，称为外显子组（exome） ，是实际编码蛋白的 基因部分，只占人类基因组的 1%左右，但致病相关的 snps 85%以上都涵盖在这一区域。 这些 snps 称为 coding snp (csnp)，其非同义 csnp(non-synonymous csnp)，指碱基序列 的改变可使其本翻译的蛋白质序列发生改变，这种改变常是导致生物性状改变的直接原 因。因而位于外显子区内 csnp 的改变在遗传性疾病研究中具有重要意义，对外显子组进 行测序分析，将有助于发现与疾病密切相关 snps。 snp 经典检测方法，是以凝胶电泳为基础的传统经典的检测方法，此大类方法设备要 求不高， 花费相对较低， 在普通实验室即可进行，但其分析速度慢， 自动化程度较差， 难以实现 snps 的大规模、自动化检测13。由于人类 snp 众多，要提高 snp 的检测效率， 需要一种准确、快速、大信息量的检测手段，新一代高通量自动测序技术的发展顺应上述 要求。外显子组测序，是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域 dna 捕捉并富集后 进行高通量测序的基因组分析方法，对所有基因的编码蛋白质的区域的每一个碱基进行突 变检测，使直接对外显子区进行测序法发现新 snp 成为可能，因而常用于遗传疾病研究， 探究单基因病发病原因，甚至包括多基因疾病和肿瘤的病因研究14。 3 外显子测序外显子测序与与疾病疾病研究研究 前 言 - 5 - 外显子组测序被 science 杂志预测为 2010 年最热门的研究方向之一，世界顶级杂志相 继发表了新一代外显子测序的成果（表 1-2） 。外显子测序是目前寻找单基因病致病病因、 易感基因的一种快捷、经济、高效的研究手段16-21。 表 1-2 新一代外显子测序的成果 diseases revealed by next generation exome sequencing 时间时间 意义意义 杂志杂志 2009 年 3 月 第一篇外显子测序文章 science15 2009 年 8 月 第一篇介绍外显子测序发现单基因病致病基因的方法 nature16 2009 年 11 月 第一篇利用外显子测序发现单基因病致病基因的文献 nature genetics17 2010 年 8 月 外显子测序技术发现引起马布里综合症的基因突变 nature genetics18 2010 年 8 月 外显子测序技术发现大脑发育异常病症一个单基因突变。 nature19 2010 年 11 月 中国第一篇利用外显子组测序发现单基因病的致病基因 brain20 2011 年 3 月 张学军教授科研团队利用外显子测序发现逆向性痤疮致病基因 jid21 2011 年 3 月 上海交通大学医学院利用全外显子组测序发现白血病基因突变 nature genetics22 4 外显子外显子测序技术原理测序技术原理与特点与特点 外显子测序包括外显子捕获技术与高通量测序两部分。目前主要采用 aglient sureselect 外显子靶向序列富集系统（生物素化 rna 探针）和 nimblegen seqcap ez （生 物素化寡 dna 核酸探针）系统进行人全外显子捕获。其优化的高通量操作流程，严格的 内部质量控制，已成功适用于上千样本的外显子组测序研究。常用的高通量测序平台包括 solexa/illumina、454 和 abi 测序平台。solexa/illumina 测序的优势是能够获得海量的数 据，并且具有高准确性，高通量，高灵敏度等优势，按相同的数据量来算，solexa 测序要 比其他测序技术便宜很多23。以 solexa/ illumina 高通量测序技术为代表的高通量测序平 台，使得研究者能够直接获得高质量的外显子序列信息， 如 snps， 以及基因序列的插 入和删除，从而可应用于寻找一些人类单基因病和复杂疾病比如癌症、糖尿病、肥胖等的 致病基因和位点等研究。本文以 solexa/ illumina 双末端测序技术为例，介绍高通量测序技 术的基本原理。 illumina genome analyzer 技术的基本原理24： （1）文库制备：将基因组dna 打成几百个碱基（或更短）的小片段，在片段的两个 末端加上接头(adapter)。（图 1-1） （2）产生dna 簇：利用专利的芯片，其表面连接有一层单链引物，dna 片段变成 单链后通过与芯片表面的引物碱基互补被一端固定在芯片上。另外一端（5或3）随机 和附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成桥(bridge)。反复30轮扩增，每个单分 前 言 - 6 - 子得到了1000倍扩增，成为单克隆dna 簇。dna 簇产生之后，扩增子被线性化，测序引 物随后杂交在目标区域一侧的通用序列上。（图 1-1） （3）测序：genome analyzer 系统应用了边合成边测序（sequencing by synthesis）的 原理。加入带有4种荧光标记的dntp，每个循环掺入单个碱基。此时，用激光扫描反应板 表面，根据不同的荧光读取每条模板序列所聚合上去的核苷酸种类，如此继续下去，直到 每条模板序列都完全被聚合为双链。这样，统计每轮收集到的荧光信号结果，就可以得知 每个模板dna 片段的序列。（图 1-2） 图 1-1 测序原理 文库制备和产生dna 簇 principle of sequencing: dna library preparation and generation of clusters 前 言 - 7 - 图 1-2 测序原理 测序 principle of sequencing: sequencing 外显子组测序技术优势与特点 （1）与传统测序方式相比，耗时短，成本低通量大。 （2）相对于芯片等杂交方法的模拟信号数字化，保证数据结果更加准确。 （3）相对于基因组测序，在检测基因变异方面具有更高的灵敏度。 （4）通过富集人类基因组中所有已知的编码蛋白质的基因序列，能大大降低待测序 新一代外显子测序与传统研究方法的比较（表 1-3） 表 1-3 新一代外显子测序与传统研究方法的比较25 comparison of exome sequencing and traditional research methods 传统传统研究方法研究方法 新一代外显子测序方法新一代外显子测序方法 研究思路 以假想为导向 以数据为导向 技术路线 初级定位 精细定位 定位克隆 致病位点 全外显子组/全基因组测序 致病位点 耗时 以年为单位计量 以月为单位计量 成效 候选基因数目多 候选基因数目少 验证 后期筛选验证困难，工作量大 后期筛选验证容易，定位准确 新一代外显子测序与全基因组关联分析（gwas）的比较（表 1-4） 表 1-4 外显子测序与传统基因分型芯片的比较26 comparison of exome sequencing and genome-wide association study 传统传统 gwas 外显子测序外显子测序 原理 高通量全基因组范围内进行 snp 检测 新一代测序方法对外显子组进行高通量测序 优点 在全基因组范围内检测 snp 位点的差异， 包括标签 snp 频率5%d snp 位点 获得 90%基因组编码区 snp 图谱；包括常见 变异、罕见变异和新的变异；准确率高 不足 只针对 hapmap 计划已知常见变异； 不能检测罕见和新的变异； 基于生物芯片杂交技术进行，假阳性高 对非编码区的 snp 不能全部检测 5 生物信息学生物信息学分析分析和和 snps 验证验证 外显子测序研究策略如下图 1-3。测序得到的原始数据是长度只有几十个碱基的序列， 是不适合直接用来分析的，要通过生物信息学工具将这些短的序列组装成长的重叠 dna 片段（contigs）甚至是整个基因组的框架，或者把这些序列比对到已有的基因组或者相近 前 言 - 8 - 物种基因组序列上，并进一步分析得到有实际的生物学意义，这就要求有强大的生物信息 学分析能力作为支撑27。 外显子组测序的信息分析的具体流程见图 1-4。外显子测序后获得原始数据（raw reads），经过去污染等过滤、比对参考基因组，最后获得比对到基因组上的 unique mapped reads。 图 1-3 外显子组测序技术路线 strategy of exome sequencing 图 1-4 外显子组测序的生物信息分析流程 bioinformatics analysis process of exome sequencing 目前 solexa 测序的读长能达到 75bp（reads），这个大小比传统的 sanger 测序要短得 多，不能直接用于数据分析。和传统的测序技术相比，solexa 测序的错误率也相对较高， 并且测序错误倾向于分布在 read 后面的碱基中，需正确区分测序错误和真正的 dna 多态 性。在所有 snp 的检测方法中，通过 sanger 法对欲检测片段进行直接扩增、测序是最为 准确的方法，能够准确、直接反映序列差异，且成本日益降低，是 snp 分析的金标准28， 前 言 - 9 - 因而常与高通量测序信息学分析验证。 通常情况下， 纯合型 snp 位点的测序峰为单一峰型， 而杂合型 snp 位点的测序峰为套峰，因而很容易将其区分开来（如下图 1- 5 直线标记）。 通过直接测序方法进行snp检测的检出率接近100%。 因而外显子组测序的结果经过sanger 验证可以保证数据的可靠性。 图 1-5 sanger测序分析 analysis of sanger sequencing 实验材料与方法 - 10 - 第二章 实验材料与方法 1 材料与方法材料与方法 1. 1 主要实验设备主要实验设备和试剂和试剂 -80超低温冰箱( 中国海尔 702 型)、普通冰箱(西门子 kg21e76 型)、35 升和 10 升 的液氮罐( yds - 35 - 125 和 yds- 10， 四川亚西低温设备公司) 、 医用离心机( tl- 80- 1 型， 江苏姜堰市无力医疗器械有限公司)、l500 低速自动平衡离心机(长沙湘仪离心机仪器有限 公司)、联想电脑。高速冷冻离心机（sigma） ，低速冷冻离心机（eppendorf） ，低温冰箱 三洋(sanyo)，4冰箱（海尔） ，台式恒温振荡器 (江苏省太仓市实验设备厂， thzd 型） ，illumina ga ii （华大基因公司） ；氯化钠（广州化学试剂厂） ，1.5m tris-hcl (ph=8.8)（biodev） ，1.0m tris-hcl (ph=6.8)（biodev） ，甲醇（分析纯） （广东光华） ，丙 酮（分析纯） （广东光华） ，无水乙醇（分析纯） （广东光华） ，rnafast 2000(上海飞捷)， ripa 裂解液 (碧云天)，qiagen 试剂盒(qiangen 美国)、淋巴细胞分离液( 上海恒信化学 试剂有限公司产品)、 rpm i 1640( gibcotm 产品) 、 甘油(江门市恒健药业有限公司产品) 均购自南宁市恒因生物公司 1.2 病史采集及数据管理病史采集及数据管理 将患者信息录入本研究所自行设计并开发出一套信息管理系统应用于生物组织标本 库的管理，系统运行平台为 window s xp，数据库为 access 2000。 录入患者信息内容包括： （1）病人信息录入包括：流行病学及临床资料，如病人的姓名、性别、出生年月日、 职业、随访联系方式、住院号、家族史、既往史和个人史、家系图；临床诊断、病理诊断、 有无病毒感染、嗜酒程度、致癌物的暴露、病程和病期等。 （2）生物标本信息录入包括：入库编号、病变部位、病理类型、有无远处转移、收 集人、收集方式、入库时间、送样单位等。 实验材料与方法 - 11 - （3）标本存放位置信息包括：入库编号、标本盒规格、标本数量、存放位置坐标等。 （4）标本使用管理与使用登记：出库编号、出库日期、入库编号、标本原始位置、使 用单位、使用人、审批单位、审批人、经手人等。 （5）系统管理：标本的收集、保存、使用实行专人管理。管理人员严格按照标本库制 定的标本入、出库及保存质量进行标准化管理。 2 实验方法实验方法 2.1 标本的收集、处理及保存标本的收集、处理及保存 本研究中选取 2010 年 3 月2010 年 5 月期间在各合作医院住院的隐睾患者，对其进 行详细的病史采集，对有家族史的患者进行描绘家系图。本实验例病选取自三代四人发病 家系中的 3 人，系患者（右侧隐睾） 、患者弟（正常）及患者父（右侧隐睾） ，另外 10 例 为无家族史患者。 选择隐睾患者的病例，对于有家族史患者，术前征得患者及其家人的知情同意，留取 患者及其家属的外周血标本各 10ml。无家族史隐睾患者取术前外周血标本各 10ml。术前 征得患者及其家人的知情同意，留取患者睾丸松解固定术中区引带 2cm 3cm；睾丸活检术 睾丸组织标本 0.5cm 0.5cm。在行睾丸松解固定术+睾丸组织活检术时，组织离体后 30 分 钟内，并在保证医院病理科留取有足够用于诊断的组织标本后，分别切取上述大小组织， 直接放入冻存管中，置于液氮处理 30 分钟，再转入- 80超低温冰箱保存。 相应收集患者的血液标本各 10ml，抗凝血和不抗凝血各半， 并作如下处理： 非抗凝血： （1）采集后 2- 4 小时，以 3000rpm 离心 10 分钟； （2） 吸出上层的血清，分装到冻存管内，每管 100l； （3）将分装好的标本保存在 -80 超低温冰箱。 抗凝血：用于淋巴细胞及血浆的收集 （1）将抗凝血用 0. 01mol/lpbs 稀释 2- 3 倍； （2）将稀释血样缓慢加铺在等量的淋巴细胞分离液上，离心，1800rpm 20 分钟； （3）将红细胞以上的细胞悬液全部吸取至另一试管中； （4）加 0. 01mol/l pbs 轻轻冲洗混匀； （5）离心 3000rpm 5 分钟，去上清液，留取沉淀； （6）再用吸管吸取 0. 01mol/l pbs 轻轻吹打冲洗所留取沉淀物数次，混匀； 实验材料与方法 - 12 - （7）离心 2000 rpm 5 分钟，去上清液，留取沉淀； （8）重复一次，所收集的沉淀物，即为淋巴细胞； （9）将分离好的淋巴细胞加入冻存液分装保存到 - 80超低温冰箱； （10）在分离淋巴细胞过程中，得到的血浆成分同样分装到冻存管中保存到 - 80超 低温冰箱。 2.2 标本标本 dna 提取提取 使用 qiagen 试剂盒外周血标本 dna 提取方法说明提取 3 名家系成员外周血标本和一 般隐睾患者外周血标本 10 份中提取 dna，具体步骤为： （1） 取 11 份 eppendorf（ep 管） ，分别加入 20l 的 qiagen protease。 （2）各加入外周血标本 200l 与 200l 的 al buffer，混合均匀，并摇璇 15 秒，此两 步骤按比例加入。 （3） 把 ep 管孵育于 56温箱，10 分钟。 （4） 在各 ep 管中加入 200l 的 100%酒精。 （5） 分别把配好的溶液放入 qiaamp spin column，并以 8000rpm 离心 1 分钟(废液不 保留)。 （6） 分别加入 500l aw1，并以 8000rpm 离心 1 分钟，废液不保留。 （7） 分别加入 500l aw2，并以 12000rpm 离心 3 分钟(wash 1)，废液不保留。 （8） 直接再以 12000rpm 离心 1 分钟(wash 2)， 不必再加入 aw2， 离心后废液不保留。 （9） 将 column 置于新的 ep 管上，再加入 50l ae buffer，静置室温待用。 外周血 dna：10 例为无家族史患者及三代四人发病家系中的 3 人（系患者 sample 1 （s1，右侧隐睾） 、患者弟（s2，正常）及患者父（s3，右侧隐睾） ）各 200l。 使用qiagen试剂盒组织标本提取dna说明从引带组织、 睾丸活检组织中中提取dna， 具体步骤为： （1）取引带组织、睾丸活检组织各约米粒大小标本，于液氮环境下研磨成粉状。 （2）取 2 份 ep 管，分别加入 20l 的 qiagen protease。再加入研磨标本与 200l 的 al buffer，混合均匀，并摇璇 15 秒，此两步骤按比例加入。 （3）把 ep 管孵育于 56温箱，10 分钟。 （4）在各 ep 管中加入 200l 的 100%酒精。 实验材料与方法 - 13 - （5）分别把配好的溶液放入 qiaamp spin column，并以 8000rpm 离心 1 分钟(废液不 保留)。 （6）分别加入 500l aw1，并以 8000rpm 离心 1 分钟，废液不保留。 （7）分别加入 500l aw2，并以 12000rpm 离心 3 分钟(wash 1)，废液不保留。 （8） 直接再以 12000rpm 离心 1 分钟(wash 2)， 不必再加入 aw2， 离心后废液不保留。 （9）将 column 置于新的 ep 管上，再加入 50l ae buffer，静置室温待用。 2.3 外显子组测序外显子组测序方法方法 将所提取的 3 分 dna 样品进行外显子组测序（illumina ga ii） ，评价测序深度为 36x。 外显子捕获的基本原理： （1）随机打断基因组 dna，在其两端添加接头； （2）用 nimblegen 2.1m human exome array 进行外显子区域捕获后，利用新一代高 通量测序技术对样本进行测序。 外显子组测序的实验流程： （1） 基因组 dna 被随机打断成为小的 dna 片断； 并在 dna 片断的两端连上接头 (adapter)； （2）solexa 测序专用的测序芯片（flow cell）表面连接有一层单链引物（primer） ， 单链状态的 dna 片断与芯片表面的引物通过碱基互补被一端锚定在芯片上； （3）通过扩增反应使得单链 dna 成为双链 dna； （4）双链再次变性后成为单链，其一端锚定在测序芯片上，另外一端（5或 3） 随机和附近的另外一个引物互补，被锚定住，形成桥(bridge)； （5）在测序芯片上同时有上千万 dna 单分子发生以上的反应； （6）4 中形成的单链桥，以周围的引物为扩增引物，在测序芯片表面再次进行扩增， 形成双链； （7）双链经变性成单链，再次形成桥，成为下一轮扩增的模板继续扩增反应； （8）在反复进行 30 轮扩增，每个单分子得到了 1000 倍扩增，成为单克隆dna 簇 群； （9）dna 簇群在 solexa 测序仪上进行序列分析； （10）测序反应：专利的可逆性末端终结反应，提高碱基合成来进行测序。四种碱 基分别标记四种不同荧光，每个碱基末端被保护基团封闭，单次反应只能加入一个碱基， 实验材料与方法 - 14 - 经过扫描，读取该次反应颜色后，该保护基团被除去，下一个反应可继续进行，如此反复， 得出碱基的精确序列； 2.4 外显子组测序的信息分析外显子组测序的信息分析流程流程 筛选流程（图 2-1） ： （1）外显子测序后获得原始数据（raw reads） ，经过过滤去污染、比对参考基因组， 获得比对到基因组上的 unique mapped reads。过滤掉同义突变等不影响基因功能的突变， 只保留非同义突变、剪切位点突变、插入缺失等影响基因功能的突变； （2）过滤掉公共遗传突变数据库(dbsnp 等)正常人携带的常见突变、已发表的正常对 照个体的突变； （3）根据软件对突变进行功能预测，获得对功能有影响的候选基因和突变位点； （4）最后在所有患病个体的候选基因和突变位点集合中取交集。同时对数据进行质 控检测，包括测序深度、覆盖度均一性等分析的检测报告。 图 2-1 外显子组测序的生物信息分析流程 bioinformatics analysis process of exome sequencing 实验材料与方法 - 15 - 2.5 snp 验证策略验证策略 通过生物信息学分析，将候选致病基因突变锁定到外显子保守区域的一个非同义突 变，进一步验证在另 10 个患者是否存在相同的非同义突变，从而证实该基因与家族性隐 睾相关的新的致病基因。验证策略如下： （1）sanger 测序检测该家系里其他患者和正常人，观察到基因突变和表型共分离。 （2）sanger 测序检测 10 个其他患者潜在的引起隐睾相关的基因变异，是否其中 10 名患者中都存在相关基因非同义突变。 （3） sanger 测序检测到底非同义突变基因，在千人基因组数据库验证其该潜在的功 能突变。 结 果 - 16 - 第三章 结 果 1 家系图家系图 图 3-1 三代四人发病家系图 pedigree chart of the familial cryptorchidism family 箭头：先症者；i-iv：一至四代； i-1 因胃癌已去世 ii-1 63y，右侧隐睾 ii-2 右侧隐睾；49y 时因重症胰腺炎去世 ii-3 46y，正常育一女 iii-1 先症者 34y，本人，右侧 iii-2 30y，患者弟，正常 iii-3 26y，患者堂弟，正常，未婚 iii-4 16y 女性 iv-1 10y 女性 iv-2 2 个月大 正常 2 外显子组测序数据外显子组测序数据 利用 agilent sureselect chips 技术对外显子组共 37mb 的序列进行外显子捕获，目标区 约 18，000 个基因并进行 illumina ga ii 测序，平均测序深度为 36 。每个样本各获得了约 2.5gbp 的原始数据（表 3-1） 。在目标区，测序深度达 30 时，超过 95%的目标区序列能够 被检测。对捕获的数据进行 soapaligner18 v2.20 分析，约 80%的数据能够与参考数据库 （hg 18， ncbi build 36.3）进行比对。 ii iii iv i-1 iii-3 iii-2 iii-1 ii-3 ii-2 ii-1 iv-2 iv-1 iii-4 结 果 - 17 - 利用 soapsnp 检测方法，通过过滤低质量 snps，在 3 个标本（s1，s2 和 s3）中分 别检测到 23,989 snps，26,171 snps 和 24,427 snps。 表 3-1 例病例共检测到的snps snps detected and shared in the samples patient brother father bases 2,453,035,028 2,338,649,232 2,686,600,044 bases aligned to hg18 2,202,208,229 2,098,308,502 2,358,911,545 bases in target region aligned to hg18 1,438,916,881 1,382,807,804 1,529,428,463 average depth 38.06 36.58 40.45 target region coverage (%) 97.23 97.35 95.18 depth=4 regions coverage (%) 91.02 91.22 87.08 snps 23,989 26,171 24,427 3 snps 分析分析结果结果 利用 soapsnp 检测方法分析样本间两两共有 snps 情况， 即家系成员父辈与同辈之间， 我们进一步得知，在 3 个样本中分别检测到的 snps，其中的 14,597 snps 为 3 个标本所共 有（表 3-2） ，这其中也包括了 great 基因的 3 个 snps(957a-g，993a-g，1810a-g)， 与原来的报道相符29。这可能说明了这 3 个 snps 是家族性隐睾的危险因素。鉴于 great 基因涉及神经活性受体-配体相互作用的通路，我们分析了排出了 3 者共有的聚集基因，发 现了其它 7 个与 great 基因类似的基因 grid1， p2ry6， grin2b， npff， tacr3， nr3c1， crhr2，我们推断这些基因在家族性隐睾患者的家庭中更易发生突变，而这有可能修复了 主要兴奋性神经递质受体但损害了中枢神经系统的兴奋性突触传递。 在这组病例中，系家族性三代四人发生隐睾，其中的遗传因素不可忽略30。在基因组 dna 中，任何碱基均有可能发生变异，因此 snp 既有可能在基因序列内，也有可能在