新型可降解树枝状大分子及抗肿瘤前药的合成与表征硕士论文.pdf

synthesis and characterization of a novel degradabable dendrimer and preparation of its anti-tumor prodrug candidate jun fu supervisor xuefei zhang college chemistry program polymer chemistry 树枝状大分子;齐聚物;抗癌前药;胶束。 湘潭大学硕士毕业论文 abstract iii abstract controlled drug release is one of the most important tasks in pharmaceutics. great progress has been made in this field, and many materials and systems have been developed to satisfy the requirements for controlled delivery of a variety of drugs. prodrug is a new drug delivery system (dds) based on polymer compounds. its structure includes polymer carrier, active drug, spacer and targeting moiety. with the development of biodegradable polymers which are degradable, resorbable and metabolizable in human body without danger of accumulation, they have become the preferred candidates for dds carriers. the candidates as carriers for drug delivery systems should include these advantages: excellent biocompatibility, the precise and well-defined structure, the low polydispersity. the unique properties of dendrimers, such as their high degree of branching, globular architecture, multivalency, and well-defined molecular weight, make them promising new scaffolds for drug delivery. dendrimers are a new class of high-efficiency nonbiological vectors with very broad application prospects in the pharmaceutical field. by the stepwise synthesis of dendrimers affords molecules with a highly regular stucture and a well-defined morphology, drug loading with a significant increase and the administration process with reflections in nano-scale. but because of the bad biocompatibility, toxicity and undegradability, the application of dendriemrs for drug delivery has been limited. so a low toxicity and degradabable dendrimer from glycerol and glycolic acid oligomer was prepared, and it was well biodegradble because of the ester between the repit units.the conjugation of the well-defined mpeg to the dendrimer was to improve its biocompatibility, so a low toxicity, well-defined architecture, degradabable and excellent biocompatable drug carrier was prepared. the pharmacokinetics behavior could be controlled and changed by synthesis of the precise oligmers of glycolic acids with different repeat units; it is expected to be an excellent drug carrier candidate. the dumbbell-shape dendrimers composed of glycerol and oligomers of glycolic acid and the polymeric micelle formed with amphiphilic mpeg-dendrimer as carrier were prepared. the preparation and characterization of dendrimers and amphiphilic block copolymers, the morphology and size of drug-loaded micelles were studied. the research was mainly concerned with the following aspects: 1the precise oligomers of glycolic acid were synthesized by group protection methods. the protection was accomplished with tert-butyl- as the carboxyl protecting 湘潭大学硕士毕业论文 abstract iv group.by using glycerol and oligomers of glycolic acid as templates, dendrimers with different generations were synthesized via a convergent method.at last,the third generation dumbbell-shape dendrimer based on sebacic acid as core and the convergent method was synthesized, and the structure was confirmed by 1h nmr. 2the hydroxyl group of mpeg was converted into a carboxyl group by reacting with the diglycolic anhydride in the presence of dimethylaminopyridine (dmap).the carboxyl-terminated mpeg-dendrimer was prepared by esterification using coupling agent dicyclohexyl carbodiimide (dcc) and the catalyst dmap.then the carboxyl-terminated mpeg-dendrimer was reacted with paclitaxel to prepare prodrugs. the products were confirmed by 1h nmr and gpc. 3the micellization behavior of the mpeg-g3-paclitaxel prodrug was examined by using fluorescent probe technique to determinate critical micelle concentration (cmc). keywords: drug delivery system; dendrimer; oligomer; anticancer prodrug; micelle. 湘潭大学硕士毕业论文 目 录 v 目 录 第一章 绪 论 . 1 1.1 引言 . 1 1.2 药物控制释放 . 1 1.2.1 药物控制释放系统概述 . 1 1.2.2 药物控制释放系统种类 . 1 1.2.3 药物控制释放载体 . 2 1.3 树枝状大分子 . 5 1.3.1 树枝状大分子的研究背景 . 5 1.3.2 树枝状大分子结构 . 5 1.3.3 树枝状大分子的合成 . 6 1.3.3.1 发散法 . 7 1.3.3.2 收敛法 . 7 1.3.3.3 发散收敛共用法 . 7 1.3.3.4 固相合成法 . 8 1.3.3.5 金属配位法 . 8 1.3.4 树枝状大分子的分析与表征技术 . 8 1.3.5 树枝状大分子的应用 . 9 1.3.5.1 催化剂 . 9 1.3.5.2 表面活性剂 . 9 1.3.5.3 纳米材料 . 9 1.3.5.4 膜材料 . 9 1.3.5.5 生物医药领域 . 10 1.3.6 作为药物载体的树枝状大分子 . 10 1.3.7 树枝状大分子与药物分子的结合 . 10 1.3.7.1 树枝状大分子的主客体化学 . 11 1.3.7.2 药物共价结合到树枝状大分子的“表面” . 12 1.3.7.3 树枝状大分子药物 . 13 1.4 本课题的内容 . 14 1.4.1 课题提出的背景及意义 . 14 1.4.2 本课题的主要工作 . 15 第二章 哑铃型树枝状大分子的合成与表征 . 16 2.1 引言 . 16 2.2 实验部分 . 16 湘潭大学硕士毕业论文 目 录 vi 2.2.1 化学试剂 . 16 2.2.2 实验仪器与测试条件 . 17 2.2.3 端羟基的羟基乙酸二聚体的合成与表征 . 17 2.2.4 端基为溴的羟基乙酸三聚体的合成与表征 . 18 2.2.5 端基分别为溴和羧基的羟基乙酸三聚体的合成与表征 . 19 2.2.6 5-羟基-2-苯基-1，3-二氧杂环己烷的合成与表征 . 20 2.2.7 5-苄氧基-2-苯基-1，3-二氧杂环己烷的合成与表征 . 21 2.2.8 2-苄氧基丙二醇的合成与表征 . 22 2.2.9 端基全保护的支化分子的合成与表征 . 23 2.2.10 端基为羟基的支化分子的合成与表征 . 24 2.2.11 端基为溴的支化单体的合成与表征 . 25 2.2.12 含两个羧基的核分子的合成与表征 . 26 2.2.13 二代树枝状大分子的合成与表征 . 27 2.2.14 端羟基的二代树枝状大分子的合成与表征 . 28 2.2.15 端基为溴的二代树枝状大分子的合成与表征 . 29 2.2.16 三代树枝状大分子的合成与表征 . 31 2.2.17 端基为羟基的三代树枝状大分子的合成与表征. 32 2.2.18 端基为溴的三代树枝状大分子的合成与表征 . 34 2.2.19 哑铃型树枝状大分子的合成与表征 . 35 2.3 小结 . 36 第三章 结合有抗癌药物的二嵌段共聚物前药的合成与表征 . 38 3.1 引言 . 38 3.2 实验部分 . 38 3.2.1 化学试剂 . 39 3.2.2 实验仪器与测试条件 . 39 3.2.3 端基为羧基的聚乙二醇单甲醚的合成与表征 . 39 3.2.4 端基为羟基的三代树枝状大分子的合成与表征. 39 3.2.5 聚乙二醇单甲醚树枝状大分子的合成与表征. 41 3.2.6 端基为羧基的聚乙二醇单甲醚树枝状大分子的合成与表征 . 43 3.2.7 聚乙二醇单甲醚树枝状大分子紫杉醇前药的合成与表征 . 44 3.3 小结 . 48 第四章 两亲性树枝状大分子抗肿瘤前药胶束制备与表征 . 49 4.1 引言 . 49 4.2 实验部分 . 49 4.2.1 化学试剂 . 49 湘潭大学硕士毕业论文 目 录 vii 4.2.2 实验仪器与测试条件 . 49 4.2.3 聚乙二醇单甲醚树枝状大分子紫杉醇前药的制备 . 49 4.2.4 胶束的制备与临界胶束浓度的测定 . 49 4.3 结果与讨论 . 50 4.3.1 胶束的制备与临界胶束浓度的测定 . 50 4.4 小结 . 52 总结与展望 . 53 参考文献 . 54 致 谢 . 60 附录 a 攻读硕士学位期间发表论文情况 . 61 湘潭大学硕士学位论文 第一章 绪 论 - 1 - 第一章 绪 论 1.1 引言 随着医药技术的迅猛发展和人们对健康水平要求的日益提高， 药物的控制释放体系 成为生物医用材料研究领域的重要课题，而其支撑点是要有性能良好的药物载体。高分 子材料由于其具有的优良性能被广泛应用于医学领域， 作为药物控制释放的载体是最热 门的方向之一。 高分子药物控制释放体系就是指利用天然或合成的高分子化合物包埋药 物或其它生物活性剂，以使药物长效释放，或延长药物在体内循环时间，或使药物响应 刺激信号释放。通过控制药物释放还可将人体内药物浓度维持在一个适宜的浓度范围， 减少病人服药次数，并达到最佳疗效1。经过三十年来的不断努力，对高分子药物控制 释放的研究已得到了长足的进步，这一领域作为高分子化学与物理、材料物理与化学、 药物学、 制剂学等学科中一个活跃的边缘领域己成为生物高分子材料科学的一个重要方 面并受到越来越多的科技工作者的关注。 1.2 药物控制释放 1.2.1 药物控制释放系统概述 药物控制释放系统(drug controlled release system)，是将药物或其他的活性物质与 适当的载体按一定的形式制成制剂，以可控方式释放到作用部位或特定靶向器官，使得 一次性给药可在较长时间内维持适当的药物浓度，保持一定的供给和消除关系，并且使 其保持在阈值范围内，有效地解决了体内药物浓度忽高忽低，降低或避免毒副作用，提 高药物的生物利用度2-5。药物控制释放与常规释放相比具有无可比拟的优点6： 药 物释放到环境中的浓度比较稳定。常规药物投药后，药物浓度迅速上升至最大值，然后 由于代谢、排泄及降解作用又迅速降低，要将药物浓度控制在最小有效浓度和最大安全 浓度之内很困难7-9(图 1.1)。 能十分有效地利用药物。 能够让药物的释放部位尽 可能接近病灶区，从而提高了药效、避免发生全身性的毒副作用。 可以减少用药次 数，大大提高了药物的利用率和使用效果。 1.2.2 药物控制释放系统的分类 控制释放系统的分类方法有多种，按释药机理分，可分为扩散机理、化学反应机理 和溶剂活化体系等10；按给药途径可分为经皮渗透系统、口服系统、植入系统和注射系 统等。按形态结构可分为微球、微囊等。总体上主要分为化学体系和物理体系两类。物 理体系则是将药物用载体以一定方式包埋起来，实现药物的可控释放。化学体系是指将 湘潭大学硕士学位论文 第一章 绪 论 - 2 - 药物分子连接在聚合物上，利用高分子作为载体，在到达患病部位后，药物分子脱离高 分子链，发挥疗效的药物释放体系，即通常所说的大分子药物(polymer conjugate drugs)。 药物分子可以接在高分子链的侧链上，也可接在高分子链的主链末端。 fig. 1.1 drug concentrations of site therapeutic action after delivery as a conventional injection (thin line) and as temporal controlled release system (bold line). 1.2.3 药物控制释放载体 在药物控制释放体系中，除药物本身外，药物载体也扮演着重要角色。与传统药物 制剂中起保持药物制剂成形作用的赋形剂(如明胶和乳糖)不同，在药物控制释放体系中 的药物载体材料需起到对药物缓释、导向、延长寿命及用药简便的作用，因此对材料的 要求更高。 由于高分子材料具有的优良性能，使它在药物载体中显示了越来越重要的地位，它 们的性能应该满足以下条件： 1) 具有生物相容性和生物降解性。 2) 高分子材料的降解产物须无毒和不产生炎症反应11。 3) 高分子材料的降解必须发生在一个合理的期间12，而药物的释放速度也可通过 控制载体材料的降解速度予以控制。 此外，高分子材料的可加工性、可消毒性、力学性能以及来源保证、价格高低也是 影响材料最终能否实际应用的重要因素13。 天然高分子一般具有较好的生物相容性和细胞亲和性， 因此被用做高分子药物载体 材料。目前，作为药物载体的天然生物降解性高分子主要有14-25：胶原和明胶、壳聚糖、 海藻酸、琼脂、纤维蛋白和胶原蛋白等。 由于天然高分子材料的来源、处理方法等不同常会造成产品性能难以重现，而且其 湘潭大学硕士学位论文 第一章 绪 论 - 3 - 力学性能、加工性能也较差，难以符合医学应用的要求。合成高分子材料正好可以弥补 天然材料所存在的缺点，因此成为当前药物释放体系的主要药物载体材料26。 表1.1列出了一些目前已用于临床的聚合物， 除此之外还有许多聚合物正处于研究阶 段，它们都具有各种各样的生物性能。 table 1.1 polymers used as drug carriers polymer structure notes poly(vinyl alcohol)(pva) surface stabilizer in microsphere formulation. bioadhesive hydrogels. poly(ethylene vinyl acetate)p(evac) used in magnetically controlled temporal release. ultrasound-stimulated release, subcutaneous implant for cancer pain relief, and chemotherapeutic agents. poly(enol-ketone)(p ek) produced by controlled oxidation of pva. poly(acrylic acid)(paa) bioadhesive polymer. hydrogels of paa reversibly swell as function of ph. poly(acrylamides) e.g. poly(n-(2-hydroxylpropyl ) methacrylamide) p(hpma) plasm expander use as polymer-drug conjugate for distribution control. enzyme cleavable side chains employed to target release at colon. component of photosensitive delivery system. oh n o n o ch3 o n oh n r ooh n ch3 o nh oh 湘潭大学硕士学位论文 第一章 绪 论 - 4 - poly(n-isopropyl acrylamide) e.g. p(nipaam) pronounced negative thermosensitivity. used in stimuli sensitive systems. poly(acrylates) controlled drug release applications reported in polymer-drug conjugate and topical applications. poly(ethylene glycol) (peg) used as diffusion-limited tablet formulation, cross-linked hydrogels, and polymer-drug conjugate. poly(glycolic acid) (pga) extensively employed in drug delivery and tissue engineer. poly(lactic acid) (pla) extensively employed in drug delivery and tissue engineer. poly(-caprolactone) (pcl) extensively employed in drug delivery and tissue engineer. poly(3-hydroxyl butyrate) extensively employed in drug delivery and tissue engineer. poly(ortho esters) proposed as a material for the pulsatile delivery of insulin. n ch3 o nh o n n r oor o n o o n o ch2 o 5 n o n o o o o o o oo r n 湘潭大学硕士学位论文 第一章 绪 论 - 5 - np r r n poly(anhydrides) a wide variety of drug and proteins have been incorporated into matrixes. poly(amino acids) predominantly to deliver low molecular weight drugs and used as carrier of conjugate of drug. poly(urethanes) hard and soft segment polymers containing peg for temporal controlled release. poly(phosphazenes) peg-modified nanoparticles for site-specific drug delivery. 1.3 树枝状大分子 树枝状大分子是近年来出现的一类新型合成高分子， 它们具有高度支化、 高度对称、 单分散以及高表面官能团密度等很多独特的性质，呈现出其它物质无法比拟的优点，因 此在很多应用领域，尤其是在生物医学领域，受到广泛的关注，已经成为一个新的研究 热点。 1.3.1 树枝状大分子的研究背景 树枝状大分子是 1985 年由美国密歇根化学研究所的 tomalia27博士和 south florida 大学的 newkome28教授几乎同时独立开发的一类新型的高分子材料，从其诞生 开始发展到现在，虽然只有短短的 20 来年的时间，但是由于其新奇的结构、独特的性 能和潜在的应用前景而受到人们的格外青睐。 1.3.2 树枝状大分子结构 树枝状大分子(dendritic polymers, dendrimers, arborols, cascade polymers, starburst molecules, well defined polymers, 简称树枝状大分子)是通过多功能基单体(又称支化基 元)逐步重复的反应得到的具有树枝状高度支化结构的大分子。树枝状大分子不同于传 统的自由缠绕的聚合物，在结构上分为三个部分：始发内核、连在始发内核上被称为代 的重复结构、连在树枝状大分子最外层重复单元上的末层功能化基团。这些结构决定了 ch2 8 n o o o h n n o nh2 r n h n o o 湘潭大学硕士学位论文 第一章 绪 论 - 6 - 整个树枝状大分子大小、形状以及其物化性质29。 树枝状大分子是一种真正纳米级的分子，其直径范围从 g0-g10.0(g 即树枝状大分 子的代数)为 1nm13nm。低代的树枝状大分子可以充分伸展，呈现平面结构。到了高代 数以后, 由于空间位阻的作用，树枝状大分子则呈现球状结构31，并且在球状结构中存 在着孔腔，由于这些孔腔里面可以装载某些特定的药物分子，因此在药物靶向控释方面 有着重要的意义。树枝状大分子表面的官能团数目与引发核上反应官能团 nc、反应试 剂的官能度 nb 以及 g 有关，即：终止官能团数目= nc nbg 32。例如，对 nc= 4，nb= 2 的树枝状大分子，如果是一个 10 代产品(g= 10)，则理论上表层终止官其外层能团数 目可达 4096 个。通过对这些官能团的修饰，可以将抗体、基因或者具有药物靶向引导 功能的物质连接到树枝状大分子的表面， 从而使树枝状大分子在生物医学领域显示出巨 大的应用潜力33-38。 图 1-2 树枝状大分子示意图 树枝状大分子分为：有机骨架树枝状大分子、含硅磷的树枝状大分子以及含金属树 枝状大分子等三类30。其中pamam是在药物研究领域研究最多也是研究最为成熟的树 枝状大分子，目前已合成到10代，其具有很好的生物相容性，无免疫原性，末端带功能 化基团，可以用来结合靶向或客体分子39-41，也可以通过对其修饰得到更有效的树枝状 大分子。此外还有聚醚类、聚酯类、聚丙烯亚胺类等。 1.3.3 树枝状大分子的合成 由于树枝状大分子的形态结构的特殊性，其合成方法也应与线形高分子不同。自 1985 年开发树枝状大分子以来， 已合成了多种结构的树枝状大分子。 碳氢树枝状大分子 如聚亚苯基化合物42， 枝干上含氧原子的化合物如树枝状聚酯43， 此外， 树干上含氮44、 湘潭大学硕士学位论文 第一章 绪 论 - 7 - 磷45、硅46、硼47、锗48和秘49等杂原子的树枝状大分子近年来也被大量地合成出来。 合成的关键在于采取适当的方法，精确控制分子链在空间的生长。目前，树枝状大分子 的合成主要有发散法、收敛法、发散收敛共用法、固相合成法等。 1.3.3.1 发散法50-60 (divergent strategy) tomalia52,61与 newkome57发展了发散合成路线。发散合成是从所需合成的树枝状 大分子的中心点开始向外扩展来进行合成的。 首先将中心核分子与两摩尔以上的含有两 个以上被保护的支链活性点的试剂反应，再移去保护基团，使活化的基团又反应，如此 反复进行直至合成所需大小的树枝状大分子。 如 tomalia 等合成的聚酰胺-胺(pamam )： 由 nh3或 nh2ch2ch2nh2等为核，与丙烯酸甲酯的双键进行 michael 加成反应，酰胺 化，重复第一过程，可以得到一定代数的树枝状大分子。 图 1-3 发散法合成树枝状大分子示意图 发散合成法对于在外圈安置官能团十分方便，其缺点是反应增长级数越大，所需反 应的官能团数目越多，引入分支单元的反应可能会受到空间位阻的影响，易使增长反应 造成反应不完全，使分子产生缺陷。若使反应完全，需要过量的试剂与较苛刻的反应条 件，从而使产物纯化带来一定的困难。 1.3.3.2 收敛法62-66 (convergent strategy) fr chet65和 miller66等发展了收敛合成路线。收敛合成是从所需合成的树枝状大分 子的边缘部分开始，向内进行。 收敛合成法的一个显著优点是：每一代反应的反应点数有限，因而可以得到单分散 程度很高的产物，同时纯化与表征也容易。但随着增长级数的增加，在中心点的反应基 团所受空间位阻增大，阻碍反应的进一步进行，使其合成的高分子不如发散合成法合成 的大。当然，在中心点官能化的分子可用来与各种固定核结合。这就可以合成出拥有不 同的楔形、半球形表面的树枝状大分子结构。 1.3.3.3 发散收敛共用法67-69 此法可结合两种方法的优点。一般是指先用发散法制得低代的树枝状大分子，称为 “超核(hypercore)”，再用收敛法制得一定代数的扇形，称为“支化的单体”，然后将“支化 湘潭大学硕士学位论文 第一章 绪 论 - 8 - 的单体”接到“超核”上。 另一种又称双指数混合增长。该法只需要采用一种单体就可合成树枝状大分子。 图 1-4 收敛法合成树枝状大分子示意图 1.3.3.4 固相合成法70-71 该法是利用已知的链状聚合物作为固相载体，先使单体与连在其上的官能团反应， 再将单体上的潜在官能团活化后用发散法或收敛法合成树枝状大分子。 实质就是发散法 或收敛法，不过由于合成的分子连在固体聚合物上，所以过量的试剂容易除去，使每代 的纯化变得简单。但此法产率较低，且不适合高代树枝状大分子的合成。 husdon71等首次运用固相合成法合成了新奇的聚核酸树枝状大分子，其含有 87 个 核酸基元，分子量达 25000。这种人工生物大分子可望用以处理合成材料表面以改善生 物相容性，以及作为亲和色谱的配体识别纯化生物式样等。 1.3.3.5 金属配位法 含有机金属的树枝状大分子在合成过程中， 直接通过金属配位键而不是共价键作为 支链的连接，即使用这样的配合物作为构筑单元用于支化和桥联。改变与配位体配位的 金属离子可以改变光学性质和氧化还原性质72。90 年代初，balzani 等人73-75开始报道 有机过渡金属作为支化中心引入到树枝状大分子上，如以 2，3 或 2，5-双（2-吡啶基） 吡嗪为桥联配体，以 2，2 -联吡啶为终端配体的树枝状铷（）聚吡啶配合物，经进一 步研究发现其具有吸附和氧化还原性质。一般情况下，金属在树枝状大分子中除作支化 中心外，还可以作为中心核76-79和端基80-83。 1.3.4 树枝状大分子的分析与表征技术84-85 1.元素组成：元素分析，ms 质谱；