流式细胞术.ppt.ppt

流式细胞术与流式细胞仪,南昌大学第一附属医院张长林,1930年caspersson和thorell开始致力于细胞计数的研究1934年moldaven最早设想细胞检测自动化，用光电仪记录流过一根毛细管的细胞1940年coons提出结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白1949年wallacecoulter申请了在悬液中计数粒子的方法的专利1950年caspersson用显微uv-vis检测细胞,流式细胞术发展史,流式细胞术发展史,目前国内主要流式细胞仪厂家：becktondickinson(bd)公司backmancoulter公司,流式细胞仪（flowcytometry，fcm）,是一项集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。流式技术就是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数的、快速的定量分析和分选技术。,一流式细胞仪分析原理,分析原理,在流动室，鞘液在气泵压力的推动下快速流动。经荧光素标记的特异性抗体染色的单细胞悬液加入样品管中，在鞘液的约束下分成轴流层和层流层。样品和鞘液存有气压差，使细胞成单排列，自喷嘴喷出，与水平方向的检测激光垂直交叉。细胞表面或内部标记的荧光素受激光照射后发出荧光，同时激光照射细胞产生散射光。这些荧光信号和散射光信号经荧光光电倍增管接受积分并放大，转换为电子信号输入计算机，计算机将所测数据快速而精确的计算出来，并以图表的形式直观的显示出来。,散射光信号,fsc：细胞的大小。ssc：反映细胞质内颗粒。,分选原理：,根据仪器检测到的散射光信号和荧光信号，确定某一群体为特定的生物学细胞群体，认为的给该群细胞群加上电脉冲信号，使包裹细胞四周的水滴带上电荷。在流经偏转电场时，细胞根据自身带电荷的性质产生偏转，落入各自的收容器中，不带电荷落入废液容器内，从而实现了细胞分选。美国bd公司生产的facscalibur产品台式分选速度300/秒，大型机分选速度可高达10000/秒,二分选原理,分类,台式机（临床）大型机（科研）,流式细胞仪结构,液流系统光学系统分选系统电子系统,流动室与液流驱动系统,流动室是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。流动室由石英玻璃制成，中央有一长方形小孔，供单个细胞通过。流动室内充满了鞘液，其作用是将样品环形包绕。鞘液流速稳定，样品流在鞘流的环包下形成流体动力学聚焦，从而得到准确的细胞荧光信息。流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。,流动室与液流驱动系统,激光光源及光束成形系统,目前台式机fcm，大多采用氩离子气体激光器。激光光束在到达流动室前，先经过透镜聚焦，形成约2266m的光斑，这样激光能量较强，以激发荧光染料。台式机的整个光路是封闭的，在安装时由工程师调试完毕后，无需用户作任何调节，使用十分方便。,激光光源及光束成形系统,光学系统,fcm的光学系统由若干组透镜、滤光片和小孔组成，它们将不同波长的荧光信号分别送入到不同的电子测控器。主要光学原件：滤光片(filter)长通滤片longpassfilter,lp短通滤片shortpassfilter,sp带通滤片bandpassfilter,bp,信号检测与分析,当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射时，产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间360度立体角发射，产生散射光和荧光信号。以激发光光源波长488nm为例示意图：,荧光信号示意图,散射光信号不依赖任何样品的制备技术（如染色），因此称为细胞的物理参数。前向散射角(forwardscatter，fsc)：与细胞的大小有关，在fcm应用中，常取fsc作阈值，来排除样品中的各种碎片。侧向散射角(sidescatter，ssc)：与激光束正交90度的散射光信号，与细胞粒度及复杂程度正相关。散射光信号波长与激光相同。,散射光信号,散射光信号示意图,荧光信号,一种是细胞自身在激光照射下发出微弱的荧光信号，称自发荧光。一种是经过特异荧光素标记后，受激发光照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量就能了解所研究细胞参数的存在与定量。,常用荧光染料,目前台式机fcm配置488nm激光管常用染料有pi(propidiumiodide)pe(phycorey-thrin)fitc(fluoresceinisothiocyanate)percp(peridininchlorophyllprotein)pe-cy5等633nm激光管常用染料有apcapc-cy,主要性能指标,荧光检测灵敏度：分辩率：前向角散射光检测灵敏度：分析速度：分选指标：,三流式细胞仪的技术要点,（一）fcm单细胞标本的制备,1、样品来源：周围血、骨髓、淋巴样组织、脑脊液等。2、抗凝剂的选择；常用的是edta和肝素edta的优点是防止成熟的髓系细胞贴壁造成细胞的损失，并具有较强的抗血小板集聚能力。缺点；细胞散射光特征丢失较肝素标本快。,（一）fcm单细胞标本的制备,3、样品的保存；样品中细胞活性与抗凝剂的选择、运输、保存和温度密切相关。一般室温保存即可，要求采集后立刻处理染色；肝素抗凝血、髓在室温保存48-72小时；edta抗凝血、髓保存12-24小时，胞内染色样品可固定细胞长期保存。,（一）fcm单细胞标本的制备,4、单细胞悬液制备及荧光染色：（以外周血作b27为例）将单克隆抗体与外周血共孵育，裂解红细胞，洗涤固定后，上机待检。取edta抗凝均匀无凝块血液50ul20ul抗体混匀避光15-20分钟1：10溶血素2ml混匀避光102分钟300g离心5分钟弃上清液沉渣加5%pbs2ml300g离心5分钟弃上清液沉渣加0.5-1ml5%pbs混匀待机。,注意事项：,抗凝血不能有凝块以免影响结果。组织制备单个细胞必须进行机械分离后用蛋白水解酶消化。采用方法裂解红细胞（用于临床）和细胞梯度密度离心分离法（用于科研）。,（二）fcm常见荧光染料的种类和特性,异硫氰酸荧光素（fitc）藻红蛋白（fe）多甲藻叶绿素（percp）异藻蓝蛋白等（apc）151页表格,流式细胞仪数据的获取和分析,流式细胞仪首先把收集的各种光信号转换成电压脉冲，然后通过模数转换器转换成为数字号码，最后以图像形式表示。數据以fsc标准格式储存。有三类：样本获取文件數据设置文件數据分析结果。如果是一个4参数（fsc、ssc、fl1、fl2）的单细胞分析会生成8位数据。,（一）参数,目前最先进流式细胞仪已达到三种激发波长的激光管；488nm、633nm。407nm。可多达15色分析，加上前向和垂直散射光可分析17个参数。收集率可达70000细胞，分析速率达每秒50000细胞，分辨率达262144道，分选精度达1/32液滴。,1、单参数图,2、双参数图,五fcm定量分析的质量控制,流式细胞仪并非完全自动化，准确的实验结果还需人工技术配合，所以标本制备要规范，仪器本身需要质量控制。,（一）荧光染色过程中的质量控制,1.细胞浓度不低于1106/ml。2.封闭剂0.5%小牛血清清蛋白、1%小牛血清或幼年家兔血清作封闭剂，血清要灭活预实验排除细胞毒性。作用是封闭细胞表面igfc受体，防止非特异性与荧光素标记抗体结合而被染上荧光。,（一）荧光染色过程中的质量控制,3.洗涤：常用fbs做洗涤液，内加一定浓度的5%-10%小牛血清除了封闭非特异性结合外，还有助于保持细胞活性。0.2%的nan3防止抗原抗体反应后发生联合解离。染色后充分洗涤防止假阳性和假阴性。防止混合剧烈以免破碎细胞过多，导致非特异性荧光。注意离心速度，减少细胞粘连。,（一）荧光染色过程中的质量控制,4、过滤：用400目滤网过滤，去除粘连细胞团。5、对照：空白对照、阴性对照、单染荧光抗体对照。6、温度：冰上或4进行。7、结果判断：减去本底荧光。8、避光：保证细胞免疫荧光的稳定性。,（一）荧光染色过程中的质量控制,9、细胞表面染色：多数抗原存在于细胞表面，故多采用细胞表面染色。但也有部分抗原存在于细胞膜的同时也存在于细胞内，这种情况下要保持细胞的完整性以保证检测的特异性，细胞应先染色后固定。,（一）荧光染色过程中的质量控制,10、细胞内染色保持胞内的通透性，保证固定和通透细胞膜的试剂不影响抗体和抗原的结合。11、膜胞内同时染色先胞膜染色，后固定，然后通透胞膜和胞内染色，最后是dna染色。,（二）仪器的质量控制,1、调整最佳仪器状态。2、控制变异系数。3、正确使用补偿；荧光都有自身的光谱发射范围，多种荧光同时发射可发生重叠，图；fitc发射的荧光由530nm的滤片选择后送入探测器中；而pe发射的荧光由575nm滤光片选择，此时有部分fitc荧光会出现在pe探测器中，这部分荧光就叫荧光渗漏，去除这种交叉检测到的荧光的过程就是荧光补偿的过程。,（三）质料采集和分析过程中的质量控制,1、标本采集处理a、组织标本采集：b、标本固定：70%的乙醇固定效果好。c、单细胞悬液的制备：细胞浓度调整为1106/ml。d、石蜡包埋组织的单细胞制备：一般不用。2、资料采集：一般每个标本应获取1104。2104个有核细胞的荧光和散光系数，白血病微小残余病变检测应收集5104个细胞。3、资料分析；略,六流式免疫荧光技术在医学中的应用,fcm在各个领域中应用极为广泛；在医学基础研究、临床诊断和医学研究中中应用中尤为广泛，如在感染疾病、自身免疫疾病、肿瘤的诊断、疗效和预后判断等；fcm技术不仅仅是细胞技术，也可结合分子生物学的其他技术对细胞或生物颗粒进行分析。,（一）淋巴细胞及其亚群分析及其意义,淋巴细胞是免疫系统中执行免疫功能的重要细胞，各种白细胞分化抗原（cd）分子广泛分布在t细胞、b细胞、骨髓造血干细胞、血小板、巨噬细胞、树突细胞和自然杀伤细胞等免疫细胞。免疫细胞表面标志改变与细胞的活化和功能的改变有着密切关系，不同类型免疫细胞间的比例也对机体免疫功能具有重要的影响，而这些变化与临床疾病的病理变化密切相关。因此通过流式细胞仪计数和多参数分析淋巴细胞亚群对了解淋巴细胞发育、分化、活化和功能成熟，鉴别新的淋巴细胞亚群具有重要价值；更重要的是通过研究和分析疾病与特异性淋巴细胞亚群或某些疾病，如免疫性疾病、感染性疾病、肿瘤等的诊断、治疗、免疫功能重建和器官移植检测有着重要临床意义。,（1）淋巴细胞及其亚群分析,t淋巴细胞及亚群：外周血中成熟淋巴细胞主要属于tcrt细胞，可分为th、ts、treg，tcrt细胞和nk1.1t细胞等，他们都有一个共同的标志cd3。,a、辅助/诱导性t淋巴细胞（th）占27-51%，是主要的功能亚群，主要表达cd3cd4cd8。b、抑制/细胞毒性t淋巴细胞（ts）占15-44%，是主要的效应性t细胞亚群，主要表达cd3cd4cd8。c、treg细胞是近年来新发现的一个t淋巴细胞亚群，具有重要的免疫调节功能，在自身免疫病、肿瘤和器官移植排斥反应中具有重要作用，主要标志为cd4cd25foxp3。,d、th/ts比例，一般采用cd4/cd8比例，正常值2：1，免疫力低下时比例倒置。e、t淋巴细胞的绝对计数，在某些疾病中t淋巴细胞会大量减少；cd4和cd8t细胞均减少。f、t淋巴细胞活化；cd69正常情况下极少表达，早期出现cd69表达，中期cd69、cd25（il-2r）表达，晚期出现cd71（转铁蛋白受体）和hla-dr表达。g、初始t细胞和记忆t细胞亚群表达见157；,b细胞及亚群；b细胞在外周血占5%-15%，与自身免疫疾病、b细胞系的肿瘤关系密切；b慢性淋巴细胞白血病与淋巴瘤等主要表达cd19、20、21、22。nk细胞：外周血占10%，cd16、cd56是特异性标志。nk细胞在抗感染、抗肿瘤和移植排斥反应中具有重要作用。dc:是重要的抗原提呈细胞分为髓样cd1淋巴样cd2。重要标志cd11c+、hla-dr+。,2、临床意义,总t和总b及其亚群的意义总t（50-84%）和总b（5-18%）可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病。对cd4和cd8t细胞的测定有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病、移植排斥反应的监测。cd4/cd8的意义评价自身免疫失调、免疫失调或免疫缺陷病病人的免疫状态，监测骨髓移植病人以免受到急性gvhd的攻击。（自免病比值升高，病毒感染、肿瘤、再障比值降低）。nk细胞的意义nk（7-40%）细胞能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。,（二）白血病和淋巴瘤的免疫分型,由于白血病在细胞形态上、临床表现及对治疗反应上均有高度的异质性，为了更好地了解疾病的发病机理、病理学特点及临床病程，需要将这些异质性的疾病进行分类，而选择一类性质相似的疾病也是评价新的治疗方法及分析预后因素的必要条件。,1976年fab协助组提出依据细胞形态特征来判断细胞的成熟程度，并根据原始细胞的数量将白血病进行分类，但缺陷是受主观因素的影响，重复性较差，对不典型的白血病患者的髓片，同一形态学专家在不同时间或不同专家可得不同结论。1985年fab协助成员及多位免疫学专家、细胞遗传学专家分别对急性淋巴性白血病(all)及急性髓系白血病（aml）的形态学（m）、免疫学（i）、细胞形态学（c）进行了讨论，提出了mic分型标准，也标志着流式细胞仪在白血病免疫分型中的应用。,fcm通过对外周和骨髓细胞表面抗原和dna的检测分析，对各种血液病的诊断、疗效和预后