牙本质特异性蛋白与生物矿化【PPT】 .ppt

生物矿化biomineralization,机体矿化组织在生物调控下由特殊细胞分泌有机基质，基质中蛋白质诱导钙、磷离子在基质上并按特定空间结构和时间顺序形成晶体并生长，这个过程称“生物矿化”。生物调控基因调控、细胞因子介导,dpp的发现和定义veis和penny(1967)发现高度磷酸化的含丝氨酸（ser)，天门冬氨酸（asp)的酸性蛋白。占非胶原蛋白的50%。,牙本质磷蛋白dentinphosphoprotein,dppdentinphosphophoryn,dpp,dpp的合成、分泌和分布veinstock等用3h、33p标记丝氨酸，磷酸根（小鼠）munksguard等在牙髓细胞的培养加入3h丝氨酸、33p磷酸根rabie等用胶体金抗体标记,dpp提取dpp的生物学特性（1）亲水性、强酸性、等电点1.1（2）含磷量高：5.9%（3）分子量：范围大，种属间有差异大鼠30-100kd，小鼠72kd牛35-158kd，人140kd左右,（4）氨基酸组成,人、牛、鼠的氨基酸组成,（5）氨基酸序列及分子结构1996年crossley等在iadr上报告，牛dpp氨基酸序列：asp-pse-pro-asn-pse-pseasp-(pse)nx,n=1-3,x为未知数最近george(1998)报告大鼠切牙dppc末端有（dss)n、(sd)m重复结构，磷酸化有结合ca2+能力，n3与ca2+结合能力强,目前已了解大鼠、小鼠、牛、人的氨基末端序列和功能片段。1998年gu等用rt-pcr技术克隆了人dppcdna，经分析与人牙根分离出的dppn端序列相符。macdougall等从小鼠牙本质dna克隆获得dpp-dsp复合物。,dpp的功能（1）dpp诱导和促进生物矿化的作用dpp与ca2+有强的结合能力具有与ca2+结合的高亲和力位点(ser磷酸化）结合ca2+的能力：一个po43-结合1.5个ca2+127和176molca2+/moldpp结合ca2+能力与dpp结构特点有关（george1998)(dss)n和（sd）m磷酸根、羧酸根位置。,dpp诱导调节hap晶体形成dpp与胶原结合，改变立体化学结构，hap晶体成核作用。lussi(1998)hunter(1996)证明dpp结合到hap晶体的特殊平面，调节晶体大小dpp对胶原的作用dpp对牙本质矿化作用dpp分布矿化前沿dpp种植诱导牙本质形成lussi和linda(1993),vandenbos(1994),(2)dpp抑制生物矿化作用lussi等研究：dpp浓度40ug/ml抑制hap晶体形成，dpp浓度160ug/ml晶体形成完全被抑制。clarkson等：可溶性dpp有一定的抑制牙本质再矿化作用。,人dpp提取人dpp生物学特性人dpp生物学作用,人牙本质磷蛋白的研究,北京市自然科学基金项目,人dpp分离纯化,牙本质粉沫的制备,脱矿粗提,蛋白含量分析磷含量分析分子量测定氨基酸组成分析,dpp的特性分析,蛋白含量分析,图1.dpp洗脱曲线图,磷含量分析,图2.dpp磷含量曲线,(ppm),把蛋白质吸光曲线和磷含量曲线绘于同一坐标内，可以得到如下曲线图,图3.dpp蛋白含量与磷含量曲线分析图,25,20,15,10,5,磷含量(ppm),dpp分子量测定,sds电泳图谱,hcl脱矿：141kd、124kd、108kd,dpp氨基酸分析,met8.1ile25.6leu25.8tyr8.9phe8.6lys36.4his9.8arg26.9注：均为每1000个氨基酸残基中的值,氨基酸aa数目asp238.1thr30.2ser191.5glu174.4pro41.2gly103.0ala36.9val34.6,所提dpp样品的氨基酸分析结果如下表：,本研究结果与国外学者基本一致，说明富含天门冬氨酸、丝氨酸的人dpp，含磷量高，具有与钙结合，诱导生物矿化的分子基础。,dpp在体外诱导生物矿化作用,bsa,dpp,对照,x衍射分析结果说明,磷酸钙hap,ca5(po4)3ohca3(po4)2cahpo4ca8h2(po4)65h2o,钙磷含量的测定测定各150mg凝胶颗粒的表面ca、p沉积量,结论：人dpp与一定的支持物结合可启动hap成核诱导矿化。,实验动物：小型猪一周龄14-20kg，选实验牙第一恒磨牙20颗，下颌切牙10颗,牙随机分组，dpp盖髓，观察2周、1月、3月结果：处死动物，实验牙切片he染色结论：dpp对牙髓损伤的修复过程比氢氧化钙更快诱导修复性牙本质形成。dpp对培养的人牙髓细胞的作用,dpp促进生物矿化的动物实验,人牙本质磷蛋白促进牙髓创伤修复,人牙本质粉制备,乙酸脱矿,上清液a,上清液b,离子交换层析,可溶性dpp,再矿化实验,特性检测,测定p含量蛋白含量,1mnacl处理,牙本质磷蛋白对再矿化的抑制作用,结果,上清液a、b中的总蛋白浓度,证明：1mnacl提取可溶性dpp,再矿化实验,牙根磨片,实验组,对照组,再矿化液处理,1mnacl处理,脱矿,钙离子测定,sem观察,mrg照片吸光度测定,再矿化液中钙含量测定,t检验p0.01,扫描电镜观察,实验组,对照组,显微放射照片的平均吸光度检验,dpp抑制生物矿化的可能机制可溶性（游离性）dpp的作用,目的：利用分子生物学技术克隆和表达包含功能区的人dpp片段，以便通过人dpp功能片段研究促进牙齿生物矿化（发育和修复功能）作用的研究。,人牙本质磷蛋白基因片段的克隆和表达,人dpp基因全序列的亚克隆及其5端序列的克隆分析通过酶切分析和dna序列测定，证实dpp重组质粒（pbluebachis2-dpp)带有人dpp基因。通过基因亚克隆建立了带有人dpp基因的稳定克隆株。采用分子克隆技术构建了含人dpp基因5端序列的重组质粒pt-dpp-n并进行测序。pt-dpp-n质粒（含dppcdna5端序列）生化特性：168个氨基酸，富含天门冬氨酸和丝氨酸，含rgd序列和dss重复序列，pi为3.115，分子量为16869.1d。,pblubachis2-dpp的pcr扩增产物（人dpp基因5端序列）lane1：dna/hindiiilane2:pcr扩增产物,ala(a):31.77asx(b):00cys(c):00asp(d):4526.62glu(e):42.38phe(f):00gly(g):105.91his(h):00ile(i):00lys(k):74.14leu(l):00met(m):00,asn(n):2011.83pro(p):1.59gln(q):00arg(r):1.59ser(s):7443.78thr(t):21.18val(v):00trp(w):00unk(x):00tyr(y):1.59glx(z):00total:168100,人dpp蛋白n端氨基酸组成,人dpp蛋白asp(d):26%ser(s):58%,人dpp5端序列的表达和纯化构建带有人dpp基因5端序列gst融合蛋白表达质粒（p5x-1-hdpp-n)，并在原核表达系统中进行表达纯化。,lane1:dl2000lane2:p5x-hdpp-n酶切电泳,构建带有人dpp基因5端序列的杆状病毒表达质粒（pfastbac-hdpp-n)，并在真核（sf9细胞）中表达了人dpp基因5端序列片段。,lane1:超声后的沉淀lane2:超声后的上清lane3:中分子量marker,lane1:蛋白复性时的析出沉淀lane2:gst-bsamarkerlane3:蛋白纯化带,a上：正常sf9细胞培养24小时a下：正常sf9细胞培养48小时b上：病毒感染细胞24小时b下：病毒感染细胞48小时,ab,1:2代毒细胞总蛋白2：3代毒细胞总蛋白,12,14kd,vies等（1994）筛选鼠切牙成牙本质细胞和牙本质cdna文库时发现一种与bsp的氨基酸组成相似的新蛋白称dsp。鼠dsp占牙本质非胶原蛋白的5%8%，含糖30%，其中10%为涎酸。dsp主要氨基酸是天门冬、丝、甘、谷氨酸，有13个潜在的磷酸化位点，6个n-糖基化的位点。鼠dsp基因编码383个氨基酸（17-信号肽，366分泌dsp）,牙本质涎蛋白dentinsialoproteindsp,dsp生物学作用可能参与牙本质生物矿化的启动晶体形成。并促进hap晶体生长。可能参与牙胚发育期上皮与间叶组织之间信号传递，互相调控。,macdougall等（1997）发现：小鼠牙的dpp与dsp是一条目的基因编码的蛋白质。dsppcdna中信号肽及n端序列有75%与dsp一致，c端的489个氨基酸编码与dpp一致。dspp为酸性蛋白（pi=4.0），富含天门冬氨基酸（18.9%），丝氨酸（36.3%）dspp基因位于人类染色体4q2123.,牙本质涎磷蛋白dentinsialophosphoprotein,dspp,dspp与dpp、dsp的关系,信号肽dsp-dpp,基因碱基顺序1-135136-12461439-2905,氨基酸顺序1-1718-387452-940（17）（370）（489）,gu.k等（2000）克隆了人dspp基因，证实与小鼠有同源性。cdna=4420kb,940个氨基酸。1-4外显子编码dsp5外显子编码dsp的c端和dpp全长。,连接区,mplp,dspp的生物学作用,与牙齿发育中，上皮间叶细胞的相互调控作用有关。促进生物矿化及牙髓创伤的修复dspp基因突变，影响dspp基因功能，导致牙本质发育不全（dgi-ii）,牙本质发育不全ii型（dentinogenesisimperfectadgi-iishieldstypeii)发病可能原因：dspp基因外显子2或3的dsp区出现突变点，核苷酸易位，导致跨膜氨基酸改变。部分dsp和dpp全部表达缺失矿化障碍。定位4q21.,dspp与遗传性乳光牙本质opalescentdentin,牙本质形成和矿化是多因素参与的复杂过程。牙本质特异性蛋白是诱导牙本质矿化最重要的蛋白质，也是成牙本质细胞标志物。目前研究的热点。牙本质涎磷蛋白在小鼠牙胚发育中的表达。牙本质涎磷蛋白反义核酸体外培养牙胚矿化的影响。小鼠牙本质磷蛋白启动子报告基因的构建和分析。cbfal对小鼠牙本质涎磷蛋白基因启动子转录调控作用的研究。遗传性乳光牙本质致病基因dspp的突变分析。,小结,georgea等（1993）首发现的酸性磷酸蛋。分布：成牙本质细胞，前期牙本质，牙本质。dmp1分子量61kd，富含丝氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸，dmp1氨基酸序列中有rgd序列（精-甘-天门冬黏附，调节细胞。,牙本质基质蛋白1dentinmatrixproteindmp1,dmp1基因人染色体4q21区，编码389个氨基酸。,hirst(1997)macdougall等（1997）发现dmp1分布骨和牙齿中，dmp1是矿化组织特异蛋白，不是牙本质特异蛋白。,dmp1的生物学作用：介于bsp与dpp之间，诱导牙本质细胞分化，刺激分泌，促进矿化。动物实验：smith等（1990、1992）樊明文（1996）与dgi-ii型可能无关（aplin等）,骨基质中发现的小分子蛋白质，再骨、牙中分布，是矿化组织特异性蛋白。骨钙素基因在染色体1上，由125个氨基酸编码组成3个r-羟基