法医DNA实验室的DNA污染和防范.pdf

1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 物证实验室认可 刑事技术2007年第3期 法医DNA实验室的DNA污染和防范 陈 松 (公安部物证鉴定中心,北京100038) 摘要: DNA污染是产生DNA鉴定结论错误的重要因素,法医DNA实验室要努力去解决这一问题。DNA 污染有自身污染、交叉污染、PCR污染3种。法医DNA实验室要采取实验室分区、严格检验操作步骤、对 试剂及消耗材料进行质量控制等方法防止发生DNA污染,采取设置对照样本、核查DNA结果、建立DNA 排查数据库等方法监测和发现DNA污染。 关键词: 法医DNA实验室; DNA污染;污染防范;质量控制;污染监测 中图分类号: DF795. 1 文献标识码: A 文章编号: 100823650 (2007) 0320016205 作者简介:陈松(1968 ) , 男,安徽省宿县人,理学学士, 主任法医师,主要从事法医DNA技术的研究和应用工作。 Tel : (010)66269502 Preventing DNA contamination in a forensic DNA laboratory CHEN Song (Institute of Forensic Science , Ministry of Public Security , Beijing 100038 , China) ABSTRACT: DNA contamination is an important factor in the investigation of a wrong DNA result. A forensic DNA laborato2 ry should endeavor to solve this problem. There are three main sources of exogenous DNA : 1) DNA from the analyst , 2) DNA from other samples in the lab , and 3) PCR products or fragments of the allelic ladder. They cause self2contamination , cross2con2 tamination and PCR contamination , respectively. To prevent contamination , separating operation regions , founding effective proto2 cols and quality controlling of key reagents and consuming materials should be carried out. To monitor contamination , setting up control samples , checking the DNA results and establishing DNA elimination databases should be performed in a forensic laborato2 ry. KEY WORDS: a forensic DNA laboratory; DNA contamination; preventing contamination; quality control ; monitoring con2 tamination 法医DNA新技术的应用和发展使得DNA检验灵 敏度不断提高1、 2 ,法医DNA实验室的DNA污染问 题引起人们关注。为了有效地避免DNA污染,获得 稳定、可靠的检验结果,法医DNA实验室要建立严 格的防污染措施和相应的污染监测体系来防范DNA 污染,一旦发现DNA污染,还要查找原因,提出解 决方案。 1 DNA污染及来源 DNA污染(DNA contamination)是指生物物 证检材在提取或检验过程中混有含DNA的外源生 物物质,造成DNA检验的结果发生改变。DNA污 染属于物证污染的一种,但与其它专业的污染有所 不同。由于目前常用的法医DNA技术是针对现场 提取到的、与人有关的各种生物物证进行检验,具 有人的种属特异性(human species2specific) ,这里 提到的外源DNA (exogenous DNA)一般特指人基 因组DNA ,而不是其它的非人DNA。在生物物证 检材保存过程中如果保存方法不当,样本中存在的 微生物DNA等非人DNA ,可能会造成物证DNA的 降解,从而影响检验结果,但是在实验室内利用现有 的DNA检验方法检测不到非人DNA ,不会造成DNA 污染。法医DNA实验室中的外源DNA有3个来 源3 : 1) 检验技术人员的DNA; 2)实验室其它样本 中含有的DNA; 3)检验过程中的PCR扩增产物或等 位基因标准对照物(allelic ladder)。由实验室内技术 人员自己的DNA引起的DNA污染称作自身污染 (self contamination) ,多是由于操作人员在检验过程 中的疏忽造成;由实验室内其它样本DNA引起的 DNA污染称作交叉污染(cross contamination) ,多是 由于检材保管或提取DNA时操作不当造成;由PCR 扩增产物或等位基因标准对照物引起的DNA污染 称作PCR污染(PCR contamination) ,多是由于实 验室设计、管理或操作不当造成。当技术人员自身 的DNA遗留在实验室用具或消耗品等物品上时, 自身污染也可以是通过交叉污染的方式造成(PCR 污染也是同样)。 2 实验室防污染措施 每个人在日常生活中都被DNA包围着,人的任 何活动都有可能留下DNA ,对DNA检验造成污染。 有些DNA污染,能够通过重新的检验加以纠正,而 有些污染(如对极少量物证检材的污染)则可能造成 不可弥补的损失,所以对于DNA污染,法医DNA实 验室要重在预防,建立一整套完善的防污染的制度, 61 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 刑事技术2007年第3期 并严格贯彻执行。 211 实验室的环境和设施 法医DNA实验室对环境和设施严格控制,实 行分区域管理和定期清洁制度,是避免DNA污染 的有效手段。 21111 实验室分区 由于法医DNA检验的高灵敏 性,为了防止检验过程中的交叉污染,法医DNA 实验室应建立实验室分区和授权进入制度,各区域 间的通风、排气系统不得混用,无关人员不得进入 实验区域,不同区域的实验设备及器械不得混用。 DNA实验室的分区域管理,能够保证在不同的 实验区域内完成不同的检验,按照DNA含量由少 到多的顺序,实现检材和样本的单方向流动。DNA 实验室必须设置案件受理和检材保管区、样品DNA 提取区、DNA扩增区、DNA检测区4,有条件的 实验室还应设置初检区、结果分析区、准备区等, 其中DNA扩增区和检测区还应设置缓冲区,供技 术人员更换工作服。对于微量DNA的检验,如接 触DNA等,由于检材含有的DNA量少,更存在污 染的危险,要设置专门的DNA提取区域。 PCR污染是法医DNA实验室的特点,也是实 验室污染防范的重点。在PCR扩增产物或等位基因 标准对照物中含有高浓度的DNA目的片段,极少 的量就会被检测到,实验室一旦发生此类污染,将 很难清除,后果严重。对实验室实行分区管理,严 格按要求操作,能够有效地预防污染发生,其中重 点要对DNA检测区进行严格管理。含有扩增产物 或对照物的离心管只能在DNA检测区打开,不允 许带出该区域;处理检测区的废物时要封装严密; 技术人员进出该区域要更换工作服。 21112 实验室清洁 做好实验室的清洁工作是防止 DNA实验室内发生交叉污染的有效途径。造成 DNA交叉污染的原因多种多样,主要是物证检材之 间或比对样本与物证检材之间的相互污染。DNA交 叉污染的方式可以是直接接触造成,也可以是通过 一定的载体使外源DNA发生转移造成,使DNA检 验结果错误;前者容易发现和预防,后者则较难发 现和预防,这要求实验室要做到定期清洁和消毒。 实验室的清洁范围包括对工作台面、仪器设备 表面、重复使用的工具或器皿等的清洁。工作台面 重点部位包括实验室受理检材的柜台、DNA提取工 作台、吸取DNA的超净台和检材存储柜等都是容 易接触并遗留DNA的区域;仪器设备主要有离心 机的转头、提取DNA用的加热块、扩增仪的样品 槽、移液器杆的吸孔、遗传分析仪的加样槽等;重 复使用的工具或器皿主要有剪取检材样本使用的剪 刀及镊子、配制试剂所用的试剂瓶等。 实验室清洁主要是采用擦拭清洗的办法,先用 新鲜配制的10 %漂白液(7mM次氯酸钠溶液)将需 要清理物体的表面反复擦拭,再用75 %乙醇擦洗以 去除残留物,可以有效清除它们表面附着的各种污 染物,条件允许的情况下定时进行紫外灯照射消 毒5。实验室除要建立定期清洁制度外,一旦发现 在检验过程中有可能发生DNA污染时,要及时清 理和清洁。 212 技术人员的操作 在各种情况下,实验结果的准确、可靠,首先 要依赖于实验室内技术人员的操作,应该说技术人 员是影响DNA鉴定结果的主要因素。技术人员在 进行DNA检验的过程中要时刻树立防污染的意识, 警惕任何可能造成DNA污染的操作和步骤,严格 按照操作要求进行检验,才能达到防止污染的目的。 21211 个人防护 法医DNA实验室内技术人员说 话或咳嗽时飞溅的唾液、脱落的头皮屑等含有大量 的DNA ,在实验过程中都可能造成自身DNA的污 染,所以技术人员要采取个人保护措施,防止污染 发生。由于DNA检验技术人员本身在检验过程中 不注意或操作不当造成的DNA污染并不少见。 2004年,美国华盛顿警察局犯罪实验室在调查23 起DNA检验造成错误鉴定的原因时,发现其中8起 案件是由于技术人员自身DNA污染造成,另有8起 由于DNA交叉污染造成6。 DNA实验室内技术人员在检材交接、保存、初 检及提取DNA时,必须穿戴好实验室工作服、一 次性手套、面罩(或口罩)、发罩(或帽子 ) ; 进行 其它检验操作时,也必须穿工作服、戴手套,进出 DNA扩增区及检测区时,还应在缓冲区更换工作 服,防止空气中含有扩增产物的气溶胶颗粒被带入 其它区域造成污染。 21212 器具和消耗材料的使用 DNA检验使用的 各种器具和消耗材料都有可能是携带外源DNA的 载体,操作中如果不慎会造成DNA污染。实验过 程中,要尽量使用一次性用品或器具,其中包括手 套、移液用的吸头、离心管等;使用的手套在接触 可能含有DNA的物品后要及时更换,当打电话、 触摸计算机键盘等时要除去手套;重复使用的器具, 如剪刀、镊子等,处理物证检材后要及时更换;实 验区内备用的离心管、吸头、剪刀、镊子、干净的 棉签拭子等用具要封装严密;为了防止移液器头部 的DNA污染,还可以使用防止气雾的吸头(aero2 sol resistant tip)。 21213 DNA提取 从检材样本中提取DNA是DNA 检验的开始,也是最容易造成DNA自身污染和交叉污 染的步骤。为了避免DNA污染,现场提取物证检材和 比对样本提取DNA时要分开在不同区域操作,对于不 71 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 刑事技术2007年第3期 具备条件的实验室,也要分开在不同时间分别提取物证 检材和比对样本DNA;处理物证检材时,不要把多件 检材放在一起,一次只应处理一件物证检材,不要把检 材直接放在工作台面上,每次都要放置新的衬纸垫,做 到及时更换衬纸垫和手套;提取DNA时,先处理检材 DNA含量少的物证,再处理检材DNA含量多的物证, 防止造成DNA量少的物证检材的污染。 21214 DNA扩增和检测 DNA扩增和产物检测的 过程中要注意避免PCR污染的产生。扩增时,由于 样品多,要注意不要加错样,把已加样完的样品移 离原来的位置,与未加样样品分开,可以防止此类 错误,有条件的实验室,可使用自动化工作站;打 开含有DNA的离心管前要在离心机中瞬时离心, 以使溶液处于管底,防止开盖时溶液渗出或飞溅; DNA检测区的一切物品,尤其是含扩增产物的离心 管严禁带入DNA提取区和扩增区。 213 试剂及消耗品的防污染质量控制 法医DNA实验室所使用的试剂及消耗品的质 量能否满足要求是保证DNA检验结果准确的基础。 2002年,英国法庭科学服务中心(FSS)的DNA实 验室在DNA检验中曾因离心管被生产工人的DNA 污染而导致错误地串并数起刑事案件,误导了警察 对案件的调查7,使我们认识到质量控制(quality control , QC)的重要性。 DNA实验室为了在检验中获得准确、可靠的 结果,在关键试剂和消耗材料使用前要对其进行 质量控制检验,确认其指标合格后才能用于DNA 检验。DNA实验室的关键试剂主要是指DNA纯 化试剂盒和STR复合扩增试剂盒,关键消耗材料 是指离心管、吸头、棉签拭子等。对于不同批次 的试剂或消耗材料,必须对每一批次分别进行质 控检验;对于同一批次的试剂或消耗材料只需对 随机抽取的样品进行质控检验。质控检验是用质 控对象分别对已知DNA分型的阳性对照(posi2 tive control)和不含DNA的阴性对照 ( negative control)进行DNA检验, 如果阳性对照的结果分 型正确,阴性对照的结果不含谱带,就表明质控 对象合格。质控合格的试剂或消耗材料要标记质 控日期和有效期,再用于DNA检验。 3 实验室DNA污染监测和发现 DNA实验室一旦发生DNA污染,就会产生错 误的结论,这就要求实验室要有一套监测和发现 DNA污染的措施,通常采取设置对照样本、核查 DNA图谱质量、建立DNA排查库等办法加以解 决8。值得一提的是这些检测污染的方法起不到预 防DNA污染的作用,只是能够发现检验过程中存 在的一些污染,但不能够发现所有的DNA污染。 311 设置对照样本 在DNA检验过程中,平行设置不同类型对照样 本的检验,根据检验结果来判断在操作中是否存在 DNA污染,是对法医DNA实验室DNA污染进行监 测的好方法,实验室的技术人员必须按照要求进行操 作。2002年,美国的联邦调查局(FBI)的DNA实 验室发生的技术人员未按照操作规范进行阴性对照检 验,无法确定在检验过程中是否有DNA污染的存在, 导致百余起案件重新鉴定,一些DNA结果从国家 DNA数据库中被删除,一些物证检材因没有检验条 件而无法做出鉴定结论,严重影响了FBI的声誉9。 DNA检验中设置的对照样本有阴性对照和阳性 对照两种。 31111 阴性对照 阴性对照,又 称空 白 对 照 (blank control) ,是指平行实验中设置的不含DNA 样品的检验,主要有PCR阴性对照、试剂空白对照 和检材空白对照三种。PCR阴性对照是在PCR反应 时用水代替模板DNA进行反应的对照,主要用于 监测PCR反应体系和PCR检验过程中DNA污染情 况;试剂空白对照是使用所有检验试剂平行对空白 样品进行检验的对照,主要用于监测检验全过程所 用试剂的DNA污染情况;检材空白对照是对空白 检材的载体样本(不含检材斑迹的载体)进行平行 检验的对照,主要用于监测载体样本的DNA污染 情况,这在ABO血型等检验中常用,在DNA检验 中较少用。阴性对照的检验结果应该没有DNA谱 带,一旦发现结果中有谱带出现,就表明有DNA 污染的存在。 阴性对照可以监测检验中发生的系统污染,但 对于发生在特定样品检验中的偶然污染无能为力, 还要靠其它的监测办法。 31112 阳性对照 阳性对照是指在平行实验中设置 已知分型的DNA样本,主要用于监测DNA分型结 果的可靠性和准确性。用于阳性对照的DNA样本 可以使用参考标准物质,如A9947或K562等10, 也可以使用实验室中已知分型的自制DNA样本。 当阳性对照的检验结果产生多余的等位基因时,表 明有DNA污染的存在。 312 核查DNA图谱质量 核查DNA检验结果的图谱质量是发现是否存 在DNA污染的又一方法。核查DNA图谱的方法主 要是看DNA结果中是否有多余的谱带或明显不符 合逻辑的结果。以下几种情况值得注意 : 1) 对于等 位基因标准对照物污染的情况比较容易发现,在某 一或某些基因座的分型结果中如果包含的等位基因 如同Ladder一样,就要考虑可能发生Ladder的污染。 81 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 刑事技术2007年第3期 这是实验室中发生的比较严重的一类污染,一般多 发生在PCR反应的操作中。 2) 对于已知嫌疑人的 比对样本,只应该是一个人的DNA图谱,如果结 果中发现有明显多余的谱带存在,就要考虑有DNA 污染的发生。 3) 当核查DNA图谱时,如果发现人 员样本与DNA检验结果在性别上不同时,要加以 注意是否存在DNA污染或弄错样本编号的情况。 4) 在DNA检验结果中,不是只要有多余的谱带都 是由于DNA污染造成的,有些多余谱带是与生物 技术或检测技术相关的,如影子带(stutter)、加A 不完全、荧光洇渗 (pull 2 up) 、模板量太多等造成, 要注意加以区别和分析11。 5) 阴性对照发生污染 时,要注意核查检验样本的DNA分型是否含有阴 性对照污染的等位基因。 313 DNA数据库的检索比对 DNA检验结果的数字化使得DNA数据库的建 设发展迅速,利用DNA数据库的自动比对功能, 把DNA实验室获得的所有DNA分型进行数据库管 理,可以发现DNA实验室中可能存在的一些污染。 31311 DNA排查数据库 DNA排查数据库(elim2 ination database)是储存需要排除的相关人员DNA 分型的数据库,用于监测和发现DNA检验结果是 否受到相关的现场或实验室人员污染。英国的国家 DNA数据库(NDNAD)是世界上最早、最大、发 挥作用最好的数据库,其中建立了现场警员排除库 (PED)、实验室人员排除库(SED)和耗材生产人 员排除库(MED) ,用于检查实验室的DNA检验结 果是否受到相关人员的污染12。许多DNA实验室 都建立技术人员的DNA分型数据库,用于检测技 术人员自身的DNA污染,但是在国内,目前还未 建立现场勘查人员和耗材生产人员的DNA排查库, 无法对这些人员进行排查,只在特殊案件的检验结 果中才会考虑进行个案排查。 31312 同批次样本间的比对 DNA交叉污染和样品 编号混淆也是DNA实验室中偶尔发生的问题,对同 批次检验样本间的DNA分型结果进行比对可以用来 发现此类错误。英国FSS使用的I23专家分析管理软 件就具有这一功能,对同批次检验的DNA结果相互 比对,发现可疑的比中记录后进行认真的核查来确定 每次检验的大量样本间是否存在交叉污染的情况。对 于国内的DNA实验室,可以在出具鉴定结论之间, 将DNA分型先录入DNA数据库进行自动比对,如果 发现DNA分型相同的样本来自同批次检验,且前期 没有相互关联的信息,就要进行认真的核查。 4 DNA污染的纠正 DNA污染的结果会影响DNA鉴定的质量,降 低鉴定结果的侦查和证据价值,严重时会造成鉴定 结论错误,产生错案。DNA实验室一旦发现有 DNA污染的存在,就要认真查找污染源,分析造成 的原因,提出解决方案,同时还要对这一时期获得 的DNA数据进行复核,查找是否存在未被发现的 污染情况。 DNA实验室在查找污染原因时,可以设计一系 列的阴性对照试验对检验过程中使用的所有试剂逐 一进行排查,丢弃发现有问题的试剂;也有的实验 室为了方便,丢弃污染时所有使用过的试剂,重新 配制新试剂进行检验。DNA污染发生后,还要清洁 所有的工作台面和仪器设备表面。 当DNA实验室发生的PCR污染不是由于试剂 原因造成,结果又难以解释时,要考虑PCR产物形 成气溶胶造成污染的情况,这类污染往往难于去除。 小的DNA分子达到一定数量时很可能会包含在气 溶胶的颗粒上,污染DNA扩增区域的环境,从而 造成PCR污染。实验室一旦发生PCR污染,要对 扩增区采取清洁台面、通风透气、紫外照射等办法 进行彻底地处理,一般所需时间较长,会对DNA 鉴定工作产生影响。为了不影响工作,必要时可在 DNA实验室之外的其它实验室进行DNA扩增。 当对DNA鉴定结论产生怀疑时,条件允许的 情况下可以采用重新检验的方法进行验证,这是纠 正DNA污染的另一方法。当两次检验的结果相同 时,应该认为DNA结果是可靠的;当两次结果不 同时,要认真分析原因后再考虑进一步采取的措施。 如果是同一个体来源的样本出现两次结果的不同, 则肯定有错误发生;如果发生在现场提取的物证检 材上,由于DNA检验对检材是消耗性的,则要分 析检材上是否存在不同来源的DNA。 DNA污染是产生DNA鉴定结论错误的重要因 素,法医DNA实验室要努力去解决这一问题。但 是, DNA污染不仅发生在DNA实验室的检验环节, 还有可能发生在物证检材的提取过程中,也有可能 发生在用其它物证技术对物证检材进行检验之时。 所以,随着法医DNA技术的广泛应用,对DNA污 染的防范不单是DNA检验人员的职责,而是所有 法庭科学技术人员共同的责任,应引起高度重视, 以使现场提取到的物证检材发挥应有的价值。 参考文献: 1 Gill P , Whitaker J , Flaxman C , et al. 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