（茶学专业论文）单宁酶、β葡萄糖苷酶的共固定化及其在茶饮料加工中的应用研究.pdf

摘要 本文对单宁酶和b 一葡萄糖苷酶进行了共固定化，旨在应用于茶饮料生产中发挥 除混与增香之双重功效，从而为纯茶风味茶饮料的生产奠定基础。 选取海藻酸钠和壳聚糖为载体，采用四种方法对单宁酶和8 一葡萄糖苷酶进行了 共固定化。研究结果表明以海藻酸钠为载体，采用交联包埋一交联的共固定化方法 可以获得较高的酶活力回收率。 以海藻酸钠为载体，采用交联包埋交联的共固定化方法，对共固定化条件进 行了优化，得到了最佳共圃定化条件：各取单宁酶和b 一葡萄糖苷酶酶液2 5m l ，按 o 7 5 ：l ( v v ) 加入3 0 的海藻酸钠溶液6 7m l ，充分混匀后加2 5 的戊二醛使其 在溶液中的最终浓度达到1 2 5 ，振荡o 5h 后，于2 0 静簧交联4h 。用5 号针头 注入2 0 的c a c l 2 溶液中，滤出小球体。更换c a c l 2 溶液，在冰箱内浸泡硬化2 h ，滤出小球体。于l o 条件下，o 0 7 5 戊二醛溶液中交联3h ，滤出小球体，用 缓冲液冲洗，予冰箱内吸干水分得共固定化酶。采用最优共固定化条件可使单宁酶 和b 葡萄糖苷酶的活力回收率分别达6 7 3 和4 6 0 。 研究了共固定化后单宁酶和b 葡萄糖苷酶的理化性质，结果显示两种酶的最适 温度均较液酶下降了1 0 ，分别为3 5 和4 5 ；最适p h 均与液酶相同，分别为 5 0 和6 o ；共固定化后两种酶对热、酸碱、化学试剂的稳定性和贮藏稳定性都有显 著提高；共固定化b - 葡萄糖苷酶的表观k 。= 1 9 7 x1 0 一m o l l ，比液酶低，而共固定 化单宁酶的表观k 。= 1 1 6 x 1 0 4m o l l ，比液酶高。 将共固定化酶应用于茶饮料的除混和增香，研究结果表明，经共固定化酶处理 后，绿茶、红茶、乌龙茶三类茶的香精油总量均有所增加，其中以绿茶的香精油总 量增加最多，增长率达2 0 6 9 ，乌龙茶和红茶分别为1 0 3 0 ，6 7 9 。经共固定 化酶处理后三类茶的非酯型儿茶素含量增加，增幅依次为绿茶( 5 2 1 7 ) 红茶 ( 1 2 9 4 ) 乌龙茶( 8 8 3 ) ，而酯型儿茶素的含量下降，降幅依次为绿茶 ( 2 0 0 ) 乌龙茶( 1 6 6 8 ) 红茶( 5 0 4 ) 。 绿茶饮料的抗沉淀研究结果显示，未经共固定化酶处理的绿茶饮料低温时的浊 度比经共固定化酶处理的要高：经三个月贮藏经共固定化酶处理绿茶的澄清度一直 很高，未经共固定化酶处理的绿茶在6 0 天后有少许沉淀产生。 关键词：茶饮料单宁酶b 葡萄糖苷酶共固定化除混增香 a b s t r a c t t h i s p a p e ra t t e m p t e d t oc o i m m o b i l i z et a r m a s ea n d 1 3 - g l u c o s i d a s e ，a i m i n g a t a p p l y i n gi nt e ab e v e r a g et oa t t a i nt h ed o u b l ee f f i c a c i e so fh a z i n e s s - - r e m o v i n ga n da r o m a - i n c r e a s i n g ，t h u se s t a b l i s h e dt h ef o u n d a t i o n f o rt h ep r o c e s s i n go f p u r et e ab e v e r a g e c h o o s i n gt w ok i n d so fc a r r i e r s ，a l g i n a t e s o d i u ma n dc h i t o s a n ，a n di n s p e c t i n gf o u r d i f i e r e n tk i n d so fc o i m m o b i l i z e dm e t h o d s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eb e s te f f e c to fc o i m m o b i l i z a t i o nr o o t e di nc h o o s i n ga l g i n a t es o d i u ma st h ec o i m m o b i l i z e dc a r r i e ra n dt h e c o i m m o b i l i z e dm e t h o do f c r o s s l i n k i n g - e m b e d d i n g - c r o s s l i n k i n g a d o p t i n ga l g i n a t es o d i u ma sc o - i m m o b i l i z e dc a r r i e ra n d t h ec o - i m m o b i l i z e dm e t h o d o f c r o s s l i n k i n g e m b e d d i n g c r o s s l i n k i n g ，w eo p t i m i z e d t h eb e s tc o i m m o b i l i z e dc o n d i t i o n s a sf o l l o w s ：2 5m lo f t a n n a s ea n d2 5m lo f1 3 一g l u c o s i d a s e j o i n e d6 7m lo f 3 0 a l g i n a t e s o d i u ma tt h er a t eo fo 7 5 ：l ( v v ) a f t e rf u l l ym i x e d ，2 5 g l u t a r a l d e h y d ew a sa d d e dt o m a k ei t sf i n a lc o n c e n t r a t i o ni ns o l u t i o na c h i e v e1 2 5 a n ds h a k e d3 0m i n u t e so nt h e o s c i l l a t o r a n dt h e np l a c e da t2 0 f o r4h o u r s i tw a s p o u r e d i n t o2 0 o fc a c l 2s o l u t i o n w i t h i n j e c t o ra n d t h es m a l ls p h e r o i d sw e r es t r a i n e do u t a f t e rc h a n g i n gc a c l 2s o l u t i o n ，t h e s m a l ls p h e r o i d sw e r es t i f f e n e df o r2h o u r si nt h er e f r i g e r a t o r t h es m a l ls p h e r o i d sw e r e f u r t h e rs t r a i n e do u ta n dc r o s s l i n k e d 、i 也0 0 7 5 g l u t a r a l d e h y d ea t1 0 f o r3h o u r s t h e c r e a t e ds m a l ls p h e r o i d sw e r es t r a i n e do u ta g a i n w a s h e dw i t l lb u f f e ra n di n h a l e dt h ew a t e r c o m p l e t e l y x j g t l e n c o - i m m o b i l i z e du n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h ea c t i v i t yr e c o v e r i e so f t a u n a s ea n d1 3 一g l u c o s i d a s ec o u l dr e a c h6 7 3 a n d4 6 0 r e s p e c t i v e l y t h e p r o p e r t i e so f c o i m m o b i l i z e dt a n n a s ea n d 1 3 g l u c o s i d a s ew e r e a l s os t u d i e di nt h i s p a p e r t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h e o p t i m u l t it e m p e r a t u r eo fb o t hk i n d so fe n z y m e s d e c r e a s e db y1 0 ，s e r v e da s3 5 a n d4 5 ，r e s p e c t i v e l y t h e r ew a sn ov a r i a t i o ni nt h e o p t i m u mp ho f b o t hk i n d so f e n z y m e s ，s e r v e da s5 0a n d6 0 ，w h i c hw e r ei d e n t i c a lw i t h t h o s eo ft h e i rf r e ee n z y m e s c o m p a r e d 、i t l lt h e i rf r e ee n z y m e s ，t h es t a b i l i t i e st ot h e r m a l ， a c i da n da l k a l ia n dc h e m i c a lr e a g e n ta sw e l la ss t o r i n gs t a b i l i t yo fc o - i m m o b i l i z e dt a n n a s e a n d 1 3 一g l u c o s i d a s ew e r em a r k e d l ye n h a n c e d t h ea p p a r e n tk m o fc o i m m o b i l i z e db g l u c o s i d a s ew a s1 9 7 x1 0 。m o l l , w h i c hw a s l e s st h a nt h a to fi t sf r e ee n z y m e ，w h e r e a s t h ea p p a r e n tk mo f c o i m m o b i l i z e dt a n n a s ew a s1 1 6 x1 0 4m o l l ，h i g h e rt h a nt h a to f i t s f r e ee n z y m e t h ec o i m m o b i l i z e de n z y m e sw e r ea p p l i e di nt e ab e v e r a g et or e m o v eh a z i n e s sa n d i n c r e a s ea r o m a t h er e s u l t ss h o w e dt h a ta f t e rt r e a t e db yc o i m m o b i l i z e de n z y m e s ，t h et o t a l a m o u n to fe s s e n t i a lo i li ng r e e nt e a ，o o l o n gt e aa n db l a c kt e aw a si n c r e a s e db y2 0 6 9 ， 1o 3 0 a n d6 7 9 ，r e s p e c t i v e l y t h ec o n t e n to fn o n e s t e mc a t e c h i n si ng r e e nt e a ，b l a c k t e aa n do o l o n gt e aw e r ei n c r e a s e db y5 2 1 7 ，1 2 9 4 a n d8 8 3 ，r e s p e c t i v e l y t h e c o n t e n to fe s t e mc a t e c h i n si ng r e e nt e a ，o o l o n gt e aa n db l a c kt e ad e c r e a s e db y2 0 0 ， 1 6 6 8 a n d5 0 4 r e s p e c t i v e l y t h ea n t i s e d i m e n te f f e c to fg r e e nt e ai n f u s i o nt r e a t e d w i t hc o i m m o b i l i z e de n z y m e sw a sa l s os t u d i e d i ti n d i c a t e dt h a tt h et u r b i d i t yo f g r e e nt e a i n f u s i o nt r e a t e dw i t h o u tc o i m m o b i l i z e de n z y m e sw a sh i g h e rt h a nt h a tt r e a t e dw i t hc o t i m m o b i l i z e de n z y m e s r e m a r k a b l ya tl o w e rt e m p e r a t u r e a f t e rs t o r e df o r t h r e em o n t h s ，t h e p e l l u c i dd e g r e eo fg r e e n t e ai n f u s i o nt r e a t e dw i t hc o i m m o b i l i z e de n z y m e sw a sv e r yh i 曲， b u tg r e e nt e ai n f u s i o nt r e a t e dw i t h o u tc o i m m o b i l i z e de n z y m e sh a dp r o d u c e daf e w s e d i m e n t sa f t e rs t o r e df o r6 0 d a y s k e y w o r d s ：t e a b e v e r a g e ，t a r m a s e ，8 - g l u c o s i d a s e ，c o i m m o b i l i z a t i o n h a z i n e s s - r e m o v i n g ，a r o m a i n c r e a s i n g h q百 茶饮料自二十世纪八十年代开发成功以来，咀其天然、健康、解渴、提神、饮 用方便等特点，受到广大消费者的欢迎，已成为世界三大饮品之一。国内液态茶饮 料的研制开发始于2 0 世纪8 0 年代初期，2 0 世纪9 0 年代末开始得以迅速发展， 1 9 9 7 年产量仅有2 0 万吨，2 0 0 0 年增长至1 0 0 万吨，2 0 0 2 年高达4 0 0 万吨。目前， 国内已有5 0 多家公司生产液态茶饮料，品种多达6 0 个i l l 。故此，饮料专家预言： “2 l 世纪将是茶饮料的世纪”。然而，茶饮料生产长期以来受困于三大技术难题： 即货架期的混浊沉淀( 茶乳酪) 、香气恶化淡薄和汤色褐变【2 】。因此加强对上述技术难 题的研究，提出简便易行的解决方案，将为茶饮料的健康发展奠定坚实的基础。 1 研究现状 1 1 茶饮料中茶乳酪的形成与单宁酶的应用 1 1 1 茶乳酪的形成机理 早期对茶乳酪的研究多集中在对其组成的研究，现已基本搞清参与绿茶茶汤形 成沉淀的物质包括：茶多酚、咖啡碱、氨基酸、茶多糖、淀粉、果胶、矿物质、蛋 白质、叶绿素等。红茶茶汤冷却后比绿茶、乌龙茶更容易形成茶乳酪。r o b e r t s ( 1 9 6 3 ) 指出参与红茶茶汤形成沉淀的物质主要是咖啡碱、茶红素和茶黄素，构成 比例为1 7 ：6 4 ：1 7 。赵育璋( 1 9 9 4 ) 研究了包种茶的茶乳酪组成，儿茶素、咖啡 因、蛋白质及果胶的含量比例为2 4 ：2 0 ：1 8 ：2 ，咖啡因是诱发茶乳酪生 成的主要物质，而儿茶素中以酯型几茶素( e g c g 、e c g ) 较非酯型儿茶素( e c 、 e g c ) 更容易形成茶乳酪【”。 参与茶乳酪形成的成份很多，这些物质主要通过分子间的交互作用而产生沉 淀，如茶多酚、蛋白质、咖啡碱间的氢键缔合，茶多酚、氨基酸、咖啡碱间的氢键 缔合，咖啡碱、氨基酸间的氢键缔合，咖啡碱、蛋白质问的氢键缔合，茶多酚、氨 基酸间氢键缔合以及各组分之间的疏水相互作用力1 4 - 7 1 。 1 1 2 单宁酶在茶饮料生产中的应用 对单宁酶的研究始于上个世纪六十年代，因其具有转溶茶乳酪的专一性，故其 应用多集中于茶饮料工业。c o g g o np 等( 1 9 7 3 ) 用单宁酶处理细碎的鲜茶叶，开发 制备出速溶茶 8 1 ，其后又利用单宁酶提高了茶叶的冷溶性 9 1 。t a k i n oy ( 1 9 7 6 ) 利用 米曲霉产生的单宁酶作用于6 的红茶茶汤，在p h5 6 、4 5 条件下作用3 0 - - 6 0 m i n ，茶汤中的茶乳酪最少【l0 】。同年可口可乐公司利用单宁酶防止茶饮料中的“冷 后浑”取得了良好的效果，浑浊度从8 0 降至8 【8 l 。p r o c t e r 等( 1 9 8 5 ) 用单宁酶 对红茶进行处理，发现速溶茶完全溶于冷水且滋味良好【l “。t h o m a s 等( 1 9 8 5 ) 研究 单宁酶对红茶及绿茶茶汤的作用，提出最佳作用条件为p h5 0 6 0 、4 5 1 2 1 。 d o n d e r o c m ( 1 9 9 3 ) 等在4 5 、p h5 0 条件下，用0 5 荤宁酶处理茶提取液，与 未处理样品相比，处理样品的浑浊度降低，滋味强度提高，也提高了产品的制各率 【9 】。日本专利报道：将提取液的温度控制在单宁酶的适宜温度( 2 0 c - 8 0 ) ，添 加酶量为每克干茶o 5 5 0 单位，调整p h4 0 7 0 ，经酶处理的茶汤用分子量不少于 5 0 0 0 道尔顿的超滤膜过滤，再经反渗透浓缩后，冷冻干燥即得冷水可溶的速溶茶 口】。m i k u k u ik ( 1 9 9 3 ) 研究认为添加0 0 0 1 的单宁酶和0 2 的b 环糊精于红茶 提取液，可防止茶汤乳化，有利于风味和色泽【9 1 。同样，日本专利( 1 9 9 3 ) 也有报 道添加单宁酶和环糊精能够改善茶提取液的品剧”j 。 1 1 3 单宁酶的固定化 由于单宁酶的市场价格昂贵，使用寿命较短，因而在茶饮料工业中的应用受到 了限制，因此许多学者也进行了单宁酶的固定化研究并将其应用于了茶饮料生产 中。英国专利( 1 9 7 6 ) 报道，单宁酶用硅藻土固定( 2 5m g 单宁酶儋硅藻土) ，在 p h5 5 、4 0 条件下处理“冷后浑”，效果很好【l ”。日本专利也报道，将单宁酶固 定在聚砜中空纤维超滤膜上，然后用这种膜将茶汁趁热过滤，可避免“冷后浑”而 得到澄清的茶汁1 1 4 l 。n i c o l a sp 等( 1 9 9 7 ) 报道，将固定化单宁酶应用在2 0 6 5 下浸提茶叶，该单宁酶可实现流化床操作【l 。龚加顺等( 1 9 9 9 ) 报道，采用微孔吸 附面积大的沸石固定化单宁酶，并应用于茶汤的“冷后浑”转溶研究，发现当茶汤 浓度为1 0 ，温度为4 0 时，茶汤的澄清度最高可达4 1 5 【l6 1 。谢达平等 ( 2 0 0 0 ) 尝试采用海藻酸钙固定化单宁酶，然后用聚电解复合物对其进行修饰，不 仅能增加胶珠的强度，而且还可有效防止酶渗漏，固定化单宁酶的最适p h 值增大 至4 5 6 ，0 ，且使用稳定性和保存期显著改善，非常适宜速溶茶加工m j 。b o a d idk 等( 2 0 0 0 ) 尝试采用多种载体对单宁酶进行固定化研究，结果表明以海藻酸钙为核 心，外面包裹壳聚糖，再甩戊二醛交联，所产生的皎珠性能最佳，固定化单宁酶可 在茶汤中连续进行三批共3 9 小时的“冷后浑”转溶处理，冰箱保存一个月后酶活力仍 保持稳定1 1 8 j 。 1 2 茶饮料的增香与b 一葡萄糖苷酶的应用 1 2 1 茶叶中的香气前体 香气是茶叶品质的重要组成，具有量微、常温常压下易挥发、不稳定等特性。 目前茶饮料生产多采用高温热水提取，使原本微量的香气又大量损失，另一方面高 温灭菌也是造成香气劣变的重要原因。针对当前茶饮料香气淡薄的问题，已有研究 提出的解决途径主要有：( 1 ) 添加香精香料；( 2 ) 加一环状糊精( s c d ) ； ( 3 ) 香气前体酶法释香。 大量研究表明，茶叶中芳樟醇及其氧化物、香叶醇、苯甲醇、苯乙醇、( 顺1 3 一 己烯醇等主要香气多以不挥发的单糖苷或双糖苷形式存在，且无一例外地存在b d 一毗哺型葡萄糖苷【2 02 ”。t a k e ot ( 1 9 8 1 ) 用机械方法破碎茶新梢发现有大量芳樟醇 和香叶醇产生，当加入0 一葡萄糖苷酶抑制剂h g ”及特异性抑制剂葡萄糖酸一1 ，4 - 内 酯屡芳樟醇和香叶醇的释放受阻。f i s c h e rn ( 1 9 8 7 ) 用外源8 。葡萄糖苷酶和果胶酶 处理红绿茶产生大量香气物质。m o r i t a k 等( 1 9 9 4 ) 将从茶鲜叶中制各的粗糖苷物质 分别用四种酶制荆共同培养，经0 葡萄糖营酶处理的产生大量的香气物质【2 2 1 。李平 等( 2 0 0 0 ) 研究表明t 3 葡萄糖苷酶对茶汁具有明显的增香效果【”】。现在的研究表明 茶叶香气中的单萜烯醇( 主要是香叶醇和芳樟醇) 就是在b 葡萄糖苷酶的作用下由 其糖苷类前体水解而得以释放出来的。 1 2 2b 葡萄糖苷酶的固定化 m o r i s i 等( 1 9 7 3 ) 利用醋酸纤维素对0 葡萄糖苷酶进行了包埋，k e n n e d y 等 ( 1 9 7 4 ) 利用钠玻璃、k e n n e d y 等( 1 9 7 6 ) 利用水合金属氧化物、c a r d o s o 等( 1 9 7 8 ) 和 k e n n e d y 等( 1 9 7 9 ) 利用铅玻璃通过螯合或金属结合的方式对b 葡萄糖苻酶进行了固 定化，但活力回收率都较低1 2 4 l 。宛晓春等( 1 9 9 8 ) 利用丝素蛋白作载体分别采用包 埋法和共价法两种方法固定了b 一葡萄糖苷酶，酶经固定化后其最适p h 向碱性偏移 接近中性，最适温度没有发生明显的变化口”。舒爱民( 2 0 0 0 ) 利用壳聚糖也对b 。葡 萄糖苷酶进行了固定化研究，酶的活力回收率为5 8 7 ，其热和p h 稳定范围均有 所加宽【2 6 1 。张正竹等( 2 0 0 4 ) 也使用丝素膜对黑曲霉来源的葡萄糖苷酶进行了固 定化并研究了固定化酶的性质，酶的活力回收率为5 6 3 ，最适p h 没有发生明显 变化，但最适温度上升了2 0 【27 1 。李平等( 2 0 0 4 ) 将固定化b 。葡萄糖苷酶应用于 茶饮料的增香，经气相色谱质谱联用仪分析后发现香气的种类和总量均有所增加 1 2 8 。 1 3 酶的共固定化技术 1 9 1 6 年n e l s o n 和g r i f f i n 最先发现了酶的固定化现象，1 9 6 9 年千烟一郎博士率 先将固定化酶应用于工业，其后固定化酶得以迅猛发展 2 93 0 1 。固定化酶具有易回 收，可反复使用，容易装柱实现工业化生产等优点i 川。 近年来，酶的共固定化( c o i m m o b i l i z a t i o n ) 正成为该研究领域的热点课题， 即将两种或多种酶进行共固定以形成多功能的生物催化剂。酶的共同定化是以单一 酶的固定为基础，综合考虑所共固定化的酶的最佳固定化方法，经常研究使用的方 法有交联法和包埋法。交联法是使用双功能或多功能试剂与酶分子之间进行分子间 交联的固定化方法，最常用的交联试剂是戊二醛。包埋法是将酶包埋于格子内，常 用的包埋剂有聚丙烯酰胺凝胶、卡拉胶、大豆蛋白、海藻酸钠等。此外共固定化技 术还可应用于细胞与细胞、酶与细胞、细胞器与细胞器之间的共固化。就目前困内 外的研究情况，共固定化技术尚处于起步阶段，有待于更深入地研究 3 2 3 3 】。 2 本研究的目的与意义 目前茶饮料市场主要以调味茶为主，并没发挥出纯茶的风味特点。而纯茶饮料 中因茶成分含量高，货架期成分问的氧化络合易形成浑浊、沉淀。针对此现象，学 者们已提出许多物理、化学的解决方法，但这些方法都或多或少地损害了茶饮料的 原有风味。单宁酶是酶促转溶茶乳酪的专一酶类，不会引起其他有效成分的变化。 茶叶中的香气成分可以游离态和键合态糖苷前体两种形式存在，如能使糖苷类香气 前体水解释放，将有益于改善茶饮料的香味品质。现在研究表明b 葡萄糖苷酶可有 效地水解释放茶叶中萜烯醇类的糖苷类香气前体。鉴于单宁酶对茶乳酪的酶促转溶 作用和b 葡萄糖苷酶对萜烯醇类糖苷前体的水解释放作用，已有许多文献报道了它 们在茶饮料加工中的应用。但是单宁酶、b 一葡萄糖苷酶的市场价格昂贵，且液态酶 使用寿命短、不易回收，因此本研究试图对这两种酶进行共固定化，旨在应用于茶 饮料生产中发挥除混与增香之双重功效，从而为纯茶风味的茶饮料生产奠定基础。 3 主要研究内容 3 1 共固定化载体和共固定化方法的选择。选取两种常用于固定化单宁酶或b 葡萄 糖苷酶的载体，采用四种不同的共固定化方法进行试验，通过比较两种酶的活力回 收率、操作难易程度，确定适合的载体和共固定化方法。 3 2 共固定化条件的优化。采用确定的载体和共固定化方法，对酶的共固定化涉及 的主要参数进行单因子优化试验，通过比较两种酶的活力回收率，以获取最优的共 固定化条件。 3 3 共固定化酶的性质研究。研究共固定化酶的最适p h 、最适温度、p h 稳定性、 温度稳定性、贮藏稳定性、操作半衰期、米氏常数以及金属离子对酶活力的影响。 3 4 共固定化酶对茶饮料的除混及增香研究。利用共固定化酶处理绿茶、红茶、乌 龙茶饮料，通过h p l c 分析比较处理前后茶多酚组成的变化；以绿茶饮料为对象， 考察共固定化酶处理对其抗沉淀效果的影响：通过g c 分析比较处理前后茶汤香气 总量及主要香气成分的含量变化。 材料与方法 1 试材 红茶、绿茶、乌龙茶购自安徽农业大学茶叶经销部。茶样经烘干、粉碎、筛 分，取2 0 4 4 0 目样品，混匀后低温保藏。 海藻酸钠购自广东汕头市谣陇化工厂。壳聚糖购自浙江玉环县海洋生物化学公 司。 2 仪器与试剂 主要仪器：气相色谱仪：安捷伦6 8 9 0 型气相色谱 高效液相色谱：w a t e r s6 0 0 型高效液相色谱 h y p e r s i lo d s 色谱柱：大连依利特公司 7 5 2 紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司 浊度计：北京哈纳科技有限公司 y c l 型实验层析冷柜：北京德天佑科技发展公司 电子天平：m e t i l e rt o l e d o 公司 p h 计：s a r t o r i u s 公司 d g z 2 0 4 一i 型真空干燥箱：南京实验仪器厂 台式离心机：上海安亭科学仪器厂 s d e 装置：中国科学技术大学玻璃仪器厂定制 主要试剂：单宁酶( 2 3 9u 幢，f l u k a ) 、1 3 一葡萄糖苷酶( 1 2 4u r a g 、f l u k a ) 、对 硝基1 3 一d 葡萄糖苷( p n p g ，s i g m a ) 、单宁酸( s i g m a ) 、戊二醛( e m e r k ) 。儿 茶素标准品e g c g 、e g c 、e c g 、e c 、d l c ( s i g m a ) 。顺一3 一己烯醇、苯甲醇、 芳樟醇、苯乙醇、水杨酸甲酯、香叶醇、癸酸乙酯( 内标) 标准品系日本学者山西 贞教授馈赠。其它试剂和药品均为国产分析纯。 3 实验方法 3 1 p 一葡萄糖苷酶与单宁酶的活力测定方法 3 1 11 3 葡萄糖苷酶的活力测定 参考相关文献【3 4 3 8 】，考察对硝基苯酚的特征吸收波长和绘制对硝基苯酚的标准 蓝线，并对1 3 葡萄糖苷酶活力测定方法略作改动，得到b 葡萄糖苷酶的活力测定 方法：取三只5 0m l 道夫管分别设定为对照管、测定管，加入0 9m l 的柠檬酸缓冲 液( p h 5 0 ，5 0m m o l l ) 和0 0 5m l1 3 葡萄糖苷酶酶液。对照管于1 0 0 水浴中处 理1 0m i n 灭活t 3 葡萄糖苷酶，测定管于3 5 的水浴中预热5m i n 。向三只管中各 加o 0 5m l 经3 5 预热的1 0m m o l lp n p g ，精确反应1 0r a i n ，加1 0m l1 0m o l l n a 2 c 0 3 终止反应，于确定的对硝基苯酚的特征吸收波长处测吸光值。 固定化b 葡萄糖昔酶的活力测定方法与液酶基本相同，不同处在于向三只道夫 管中加1 0m l 柠檬酸缓冲液( p h5 , 0 ，5 0m m o l l ) 和o 1g 固定化酶。 上述条件下以每m i n 水解产生o ，0 1u m o l 对硝基苯酚的酶量定义为一个酶活力单 位。 共固定化1 3 葡萄糖苷酶的活力回收率= ( 共固定化b 葡萄糖苷酶的总活力单位 投入b 一葡萄糖昔酶液酶的总活力单位) x1 0 0 ，下文中共固定化单宁酶的活力 回收率计算与此相同。 3 1 2 单宁酶的活力测定 参考相关文献 3 9 4 0 ，考察单宁酸的特征吸收波长和绘制单宁酸的标准曲线，并 对单宁酶活力测定方法略作改动，得到单宁酶的活力测定方法：取一只5 0m l 道夫 管为对照管，加1 0m l 柠檬酸钠缓冲液( p h5 0 ，5 0m m o l l ) 。取二只5 0m l 道夫 管为测定管，加入o 5 m m o l l 的单宁酸溶液1 0 i r l l 。3 0 预热5r a i n 后，向三只道 夫管分别加入己预热的单宁酶溶液1 0 0u l ，分别于t l 、t 2 ( 间隔1 0r a i n ) 时间取1 0 0 u l 反应液加入4 0m l 无水乙醇中终止反应，于确定的单宁酸的特征吸收波长下进行比 色。根据单宁酸的吸光值的减少值计算单宁酶活力。 固定化单宁酶的活力测定方法与液酶基本相同，不同处在于先向三只道夫管中 加0 1g 固定化酶。 上述条件下以每m i n 水解减少o 0 1u m o l 底物单宁酸所需要的酶量定义为一个酶 活单位。 3 1 3 单宁酶及b 葡萄糖苷酶相互间的活力影响 3 1 3 1 单宁酶对b 一葡萄糖苷酶活力测定底物p n p g 的作用试验 按照测定8 葡萄糖苷酶活力的方法测定单宁酶的活力。 3 1 3 2b 葡萄糖苷酶对单宁酶活力测定底物单宁酸的作用试验 按照测定单宁酶活力的方法测定b 葡萄糖苷酶的活力。 3 1 3 3 单宁酶的存在对b 葡萄糖苷酶活力测定的影响 在1 3 葡萄糖苷酶活力测定时除了加o 0 5m lb 葡萄糖苷酶，同时加o 0 5m l 单 宁酶，然后与未加单宁酶时测定的活力进行比较。 3 1 3 40 葡萄糖苷酶的存在对单宁酶活力测定的影响 在单宁酶活力测定时除了加0 0 5m l 单宁酶，同时加o 0 5 m lb 葡萄糖苷酶，然 后与未加1 3 葡萄糖苷酶时测定的活力进行比较。 3 2 共固定化载体及共固定化方法的选择 3 2 1 以海藻酸钠为载体共固定化单宁酶和b 一葡萄糖苷酶 3 2 1 1 直接包埋法 取单宁酶液和p 一葡萄糖苷酶液各2 5m l ( 酶液浓度均为o 1m g m l ，下文同) ， 按0 7 5 ：l ( v l v ) 比例加入3 0 的海藻酸钠溶液6 7m l ，充分混匀后，在振荡器上振 荡o 5h 。用5 号针头注入2 0 的c a c l 2 溶液中，滤出小球体，更换c a c l 2 溶液再浸 泡硬化1h ，滤出小球体，冰箱内用吸水纸吸干水分得共固定化酶。 3 2 1 2 包埋交联法 取单宁酶液和b 一葡萄糖苷酶液各2 5m l ，按o 7 5 ：l ( v v ) 的比例加入3 0 的海 藻酸钠溶液6 7m l ，充分混匀后，在振荡器上振荡0 5h 。用5 号针头注入2 0 c a c l 2 溶液中，滤出小球体，更换c a c l 2 溶液，再浸泡硬化lh ，滤出小球体在冰箱 内用0 0 2 5 戊二醛交联2 5h ，再滤出小球体弗用缓冲液冲洗，在冰箱内用吸水纸 吸于水分得共固定化酶。 3 2 1 3 交联包埋法 取单宁酶液和1 3 葡萄糖苷酶液各2 5m l ，按o 7 5 ：l ( v l v ) 的比例加入3 0 的海 藻酸钠溶液6 7i i l l ，充分混匀后，加2 5 的戊二醛1 3m l ，在振荡器上振荡0 5h ， 于冰箱中静置交联3h 。用5 号针头注入2 0 的c a c l 2 溶液中，滤出小球体，更换 c a c l 2 溶液再浸泡硬化1h ，再滤出小球体并用缓冲液冲洗，在冰箱内用吸水纸吸干 水分得共固定化酶。 3 2 1 4 交联包埋交联法 取单宁酶液和b 葡萄糖苷酶液各2 5m l ，按0 7 5 ：l ( v v ) 的比例加入3 0 的海 藻酸钠溶液6 7m l ，充分混匀后，加2 5 的戊二醛l 3m 1 ，在振荡器上振荡0 5h ， 于冰箱中静置交联3h 。用5 号针头注入2 0 的c a c l 2 溶液中，滤出小球体，更换 c a c l 2 溶液，再浸泡硬化1h ，滤出小球体在冰箱内用o 0 2 5 戊二醛交联2 5h ，再 滤出小球体并用缓冲液冲洗，在冰箱内用吸水纸吸干水分得共固定化酶。 3 2 2 以壳聚糖为载体共固定化单宁酶和1 3 葡萄糖苷酶 3 2 2 1 壳聚糖载体的预处理 取5 0g 、8 0 目的壳聚糖，加入2 0 的醋酸溶液5 0 0m l ，充分搅拌成透明胶 体，再缓慢加入5 0 的n a o h 溶液，调节p h 至中性，得絮凝沉淀。用去离子水冲 洗、抽滤，在真空干燥箱中5 0 干燥得预处理载体 4 1 4 2 】。 3 2 2 2 交联载体的制备 取预处理的壳聚糖载体2 0g ，加入5 0 的戊二醛溶液5 0m 1 ，4 。c t 缓慢搅拌 4h ，于冰箱内静置8h ，缓冲液冲洗得交联载体4 3 1 。 3 2 2 3 直接吸附法 取预处理的壳聚糖载体0 5g ，加2 5m l 单宁酶液、2 5m ls 一葡萄糖昔酶液，4 缓慢搅拌4h ，于4 冰箱内静置吸附8h ，抽滤得共固定化酶。 3 - 2 ，2 ，4 吸附交联法 取预处理的壳聚糖载体0 5g ，加2 5m 1 单宁酶液、2 5r n l1 3 葡萄糖菅酶液，4 缓慢搅拌4h ，于4 冰箱内静置吸附8h 后抽滤。再加入5 0 的戊二醛1 2 5 m l ，缓慢搅拌4h ，于4 冰箱内静置交联8h ，抽滤，缓冲液冲洗得共固定化酶。 3 2 2 5 交联吸附法 取交联载体0 5g ，加单宁酶液和b 葡萄糖苷酶液各2 5m l ，4 缓慢搅拌4h 后再于4 冰箱内静置吸附8h ，抽滤缓冲液冲洗得共固定化酶。 3 2 2 6 交联吸附交联法 取交联载体o 5g ，加单宁酶液和b 葡萄糖苷酶液各2 , 5m l ，4 缓慢搅拌4h 后，于4 冰箱内静置吸附8h 。加入2 5 的戊二醛溶液2 5m l 使体系的戊二醛体 积分数达o 5 ，缓慢搅拌4h ，4 静鼍交联8h ，抽滤，缓冲液冲洗得共固定化酶。 3 2 3 以壳聚糖微球为载体共固定化单宁酶和b 葡萄糖苷酶 3 2 3 1 壳聚糖微球的制备 壳聚糖溶于3 , 0 醋酸溶液，得5 , 0 的壳聚糖醋酸溶液。取1 0m 1 壳聚糖醋酸 溶液缓慢加入4 0m l 液体石蜡与2 , 0m ls p a n s 0 组成的混合液中，于5 0 充分搅拌 3 0r a i n 使体系呈乳状液，然后加入2 5 的戊二醛溶液1 5m l ，搅拌1 0m i n ，再用 1 , 0m o l ln a o h 溶液调节体系p h 处于9 1 0 之间，于6 0 7 0 水浴中反应3h ， 倒掉上层油层，依次用石油醚、丙酮、无水乙醇抽洗，最后用蒸馏水抽洗，6 0 真 空干燥，得壳聚糖微球“4 5 1 。 3 2 3 2 共固定化酶的制备 称取1 ，0g 壳聚糖微球，加入5 0m m o l l 、p h5 0 的柠檬酸缓冲液，浸泡2 4h 后 抽干。向处理后的壳聚糖微球中加入单宁酶液和b 葡萄糖苷酶液各5 , 0m l ，于4 8 吸附1 2h ，并不断搅拌，然后加入2 5 的戊二醛2 5m l ，使体系戊二醛的体积分 数达0 5 ，再于4 8 交连3h ，用缓冲液冲洗、抽干，吸千水分得共固定化酶。 3 3 单宁酶和p 葡萄糖苷酶共固定化条件的优化 3 3 1 前交联戊二醛浓度的确定 按3 2 1 4 的共固定化方法( 以下相同) ，分别设定前交联时戊二醛浓度为 o 2 5 、o 5 0 、o 7 5 、0 1 0 、1 ，2 5 、1 5 0 、1 7 5 、2 0 0 ，其它条件和步骤不变。制备得 共固定化酶，按单宁酶和b 葡萄糖苷酶活力测定方法测定活力，并比较不同前交联 戊二醛浓度下两种酶的活力回收率。 3 3 2 前交联时间的确定 采用3 3 1 确定的前交联戊二醛浓度，在冰箱内的静置交联时间分别设为l 6 h ，其它条件和步骤不变。制备得共固定化酶，按单宁酶和b 一葡萄糖苷酶活力测定 方法测定活力，并比较不同前交联时间下两种酶的活力回收率。 3 3 3 前交联温度的确定 采用3 3 2 已确定的参数条件，分别在4 、1 0 、2 0 、3 0 、4 0 进行前交联试验， 其它条件和步骤不变。制各得共固定化酶，按单宁酶和1 3 葡萄糖苷酶活力测定方法 测定活力，并比较不同前交联温度下两种酶的活力回收率。 3 3 4 海藻酸钠溶液浓度的确定 采用3 3 3 已确定的参数条件，分别选用1 0 、2 , 0 、3 0 、4 0 、5 0 的海藻酸钠 溶液浓度进行试验，其它条件和步骤不变。制各得共固定化酶。按单宁酶和1 3 一葡萄 糖苷酶活力测定方法测定活力，并比较不同海藻酸钠溶液浓度下两种酶的活力回收 率。 3 3 5 硬化剂c a c l 2 浓度的确定 采用3 3 4 已确定的参数条件，分别采用1 0 、2 0 、3 0 、4 0 、5 0 的c a c l 2 溶 液浓度进行试验，其它条件和步骤不变。制备得共固定化酶，按单宁酶和b ，葡萄糖 苷酶活力测定方法测定活力，并比较不同c a c l 2 浓度下两种酶的活力回收率。 3 3 6 硬化时间的确定 采用3 3 5 已确定的参数条件，将硬化时间分别设为l 、2 、3 、4 、5h 进行试 验，其它条件和步骤不变。制备得共固定化酶，按建立的单宁酶和b - 葡萄糖苷酶活 力测定方法测定活力，并比较不同硬化时间下两种酶的活力回收率。 3 3 7 后交联戊二醛浓度的确定 采用3 3 6 已确定的参数条件，分别采用o 0 2 5 、0 0 5 0 、0 0 7 5 、0 1 0 0 、o 1 2 5 、 0 1 5 0 的戊二醛浓度进行后交联试验，其它条件和步骤不变。制备得共固定化酶， 按建立的单宁酶和0 葡萄糖苷酶活力测定方法测定活力，并比较不同后交联戊二醛 浓度下两种酶的活力回收率。 3 3 。8 后交联温度的确定 采用3 3 ，7 已确定的参数条件，分别在4 、1 0 、2 0 、3 0 、4 0 进行后交联试验， 其它条件和步骤不变。制备得共固定化酶，按单宁酶和1 3 葡萄糖苷酶活力测定方法 测定活力，并比较不同后交联温度下两种酶的活力回收率。 3 3 9 后交联时间的确定 采用3 3 - 8 已确定的参数条件，分别设定后交联时问为l 、2 、3 、4 、5h 。制各 得共固定化酶，按单宁酶和b 葡萄糖苷酶活力测定方法测定活力，并比较不同后交 联时间下两种酶的活力回收率。 3 4 共固定化酶的性质研究 3 4 1 共固定化酶的最适温度 在2 0 7 0 的范围内，按b 一葡萄糖苷酶活力测定方法，每隔5 测定b 葡苞 糖苷酶液酶和共固定化1 3 一葡萄糖苷酶的活力；在2 0 6 0 的范围内，