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生物化学实验指导 生物化学实验指导 生命科学学院 生命科学学院 编著编著 生物化学课程组生物化学课程组 2008 年 3 月 湖北师范学院生命科学学院生物化学实验指导 1 目 录 前 言 2 生物化学实验守则3 实验一 实验基本知识及溶液的配制 5 实验二 蛋白质及氨基酸的呈色反应 9 实验三 蛋白质的等电点测定和沉淀反应13 实验四 蛋白质的定量测定方法 17 实验五 离子交换柱层析法分离氨基酸25 实验六 凝胶层析法和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法蛋白质的分子量测定 27 实验七 酶的特性34 实验八 底物浓度对酶促反应速度的影响38 实验九 酪氨酸酶的提取及其催化活性研究40 实验十 核糖核酸的提取与组分鉴定及核酸含量的测定44 实验十一 果蔬维生素C含量测定及其分析47 实验十二 小麦萌发前后淀粉酶活力的比较50 实验十三 脂肪酸的氧化53 实验十四 氨基移换反应（一）血液中转氨酶活力的测定 55 实验十五 氨基移换反应（二）谷丙转氨酶活性的鉴定57 实验十六 发酵过程中无机磷的利用 59 参考文献62 湖北师范学院生命科学学院生物化学实验指导 2 前 言 近几年来，随着生物化学学科的迅猛发展，教学内容更新较快。生化实验 被作为主干基础课列入了高等院校生命科学各专业的教学计划中，并且实验课 单独作为一门课程开出。为了提高教学水平，反映出本学科更具科学性、先进 性和实用性的实验内容，根据教学大纲的要求和课程设置，同时根据本校教学 实验条件，在参阅中外相关文献，学习兄弟院校的教学经验和资料的基础上， 编写了本实验讲义。 本书为本校生命科学学院相关专业生物化学实验指导书，同时可作为其他 相关专业学生参考。书中引用了其他作者部分内容，在此致以诚挚的谢意。 编者 2008.3 湖北师范学院生命科学学院生物化学实验指导 3 生物化学实验守则 一、生物化学实验课的目的和要求一、生物化学实验课的目的和要求 生物化学实验的方法和技术是生物科学以及其它相关研究领域中的一个非常重要 的基础性实验课程。通过生物化学实验这门课程的学习，能使学生掌握生物化学实验的 基本操作及实验技术，掌握生物大分子的分离纯化定性定量化学性质生物活性 的鉴定，掌握和了解组织代谢和能量释放转变和贮存与代谢调节过程中的代谢产物和中 间产物的定性定量分析鉴定实验，使学生分析问题和解决问题的能力及实验动手能力 得到训练，并能熟练掌握各种生物化学实验仪器的使用以及准确详实记录实验现象和数 据等各项实验技能。本课程能培养学生严谨的科学态度和工作作风，为他们今后参加科 研工作打下坚实的基础。 二、实验的进行程序和要求二、实验的进行程序和要求 1 预习 学生在课前应认真预习实验指导以及教材有关章节， 必须对该次实验的目的要求、 实验内容、基本原理和操作方法有一定的了解。 2讲解 教师对该实验内容的安排及注意事项进行讲解，让学生有充分的时间按实验指导 的要求进行独立操作与观察。 3独立操作与观察 除个别实验分组进行外，一般由学生个人独立进行操作和观察。在实 验中要按实验指导认真操作，仔细观察，作好记录。 4示教 每次的实验都备有示教内容，其目的是帮助学生了解某些实验中的难点，扩大在 实验课有限时间内获得更多感性知识的机会。 5作业 实验报告必须强调科学性，实事求是地记录、分析、综合。在实验结束时呈交。 学生应认真阅读教师批改后的实验报告，不断提高实验质量。 6小结 实验结束后，由师生共同小结本次实验的主要收获及今后应注意的问题。 三、实验规则和注意事项三、实验规则和注意事项 1每次上课前，必须认真阅读实验指导，明确本次实验的目的要求、实验原理和注意事 项，熟悉实验内容、方法和步骤。 2上实验课时必须携带实验指导、实验报告纸及绘图文具等，按规定座位入座。 3实验前，要认真检查所用仪器、药品是否完好、齐备，如有缺损应及时向教师报告， 自己不得随意调换标本、仪器等。没有得到教师的允许，不能动用实验室其它非本次 实验所用的仪器设备。 4实验时要遵守纪律。有问题时举手提问，严禁彼此谈笑喧哗，不准在实验室吃食和会 客。 5实验时要遵守实验操作规程，严格按照教师的安排和实验指导的要求进行。使用显微 镜检查非永久片时，要特别小心。防止染料或试剂沾污镜头和镜台，不要用高级显微 镜观察非永久片。操作要正规，观察要认真仔细，及时完成实验报告。 6要爱护仪器、标本和器材设备，注意节约实验材料、药品和水电。如有损坏器材应立 湖北师范学院生命科学学院生物化学实验指导 4 即报告，并主动登记、说明情况。凡是有化学药品的试剂和溶液瓶上，必须贴上标签， 注明名称、成份、浓度、配制日期。 7实验结束后，应清理实验台面，所有液体废物、酸类、染料等，应倒在废物缸内，不 能倒在水槽中。认真清理好仪器、药品及其他用品，放回原处。值日生要负责清扫地 面，收拾实验用品，处理垃圾，关好水、电、门窗后再离开。 湖北师范学院生命科学学院生物化学实验指导 5 实验一 实验基本知识及溶液的配制 【课前预习】【课前预习】 1怎样使用电子分析天平？ 2溶液的配制步骤有哪些？ 【目的要求】【目的要求】 掌握实验基本知识和溶液的配制方法。 【基本原理】【基本原理】 溶液的配制步骤：计算，标量，溶解，定容，储存。 【实验用品】【实验用品】 1材料： 2器材和仪器：烧杯，容量瓶，量筒，玻璃棒，试剂瓶。 3试剂：NaH2PO42H2O，Na2HPO412H2O。 【方法步骤】【方法步骤】 （一）（一） 溶液的配制步骤溶液的配制步骤 （一）实验准备 1 准备所需的药品和玻璃仪器。 2 洗涤。 （二）计算 1 百分比浓度计算： （1） G/V 比 如：配 1%NaCl, 称 1 g NaCl 溶于 100 mL 水。 （2） V/V 比 如：配 75%乙醇 100 mL，乙醇 100 mL75%=75 mL，蒸馏水 25 mL。 （3） G/G 比 用的较少，如计算灰分中某种元素如 Fe 的含量。 2 摩尔浓度的计算：(药品的分子量一般在标签中注明) M = 摩尔数(mol)/体积(L), 摩尔数（mol）= G(g)/摩尔质量 1 M = 1 mM1000 = 1 M1000000 例如：0.1 M 或 0.1 mol/L NaCl 配 100 mL： 称取 NaCl 0.10.140=0.4 g。 3 混合溶液配制的计算： 如配 3 M EDTA, 2.25 mM NBT 以及 60 M 核黄素 100 mL，用 50 mM 磷酸缓冲液配制。 注意：分别计算三种成分的质量；用磷酸缓冲液分别配制三种成分的溶液，再混合，使混合后 的总体积为 100 mL。 湖北师范学院生命科学学院生物化学实验指导 6 （三）标量 1 根据需要选择不同量程的天平；根据要求选择不同的测量器，如量筒或移液器。 2 电子分析天平的使用: 开启、预热（1 小时） ，调水平； 校准 CAL; 称量 将量器（称量纸，称量杯等）归零去皮(Tare 或 T.O) 后，慢慢加样至量器，当加试样与指定 量相差不到 10 mg 时，极小心地将盛有试样的药勺伸向量器的正上方 2-3 cm 处，勺的另一端顶在掌心 上，用拇指、中指及掌心拿稳药勺，并以食指轻弹勺柄，将试样慢慢的抖入量器中。多加的药品取出， 但不能返回试剂瓶中。 （四）溶解 1 根据药品配制的要求选择溶剂：如：蒸馏水，双蒸水，无离子水等。 2 只能用烧杯溶解。注意加入溶剂只能加入总体积的 2/3 左右，剩余溶剂洗涤烧杯三次左右，直到 洗涤干净。 （相似相溶原理） （ 小常识小常识：药品标签中一般标识有药品的溶解性质和分子式，可根据分子式和所学的常识来判断 药品的结构和性质的特点。 ） 配制酸碱两性物质（氨基酸，蛋白质，核苷酸等）时，如果溶解性不好，可以用稀酸或稀碱促进溶解， 但 pH 应在被要求的范围内。 加热可以促进溶解，但注意应该在配制的范围内。如配 0.1%的淀粉，水浴加热（温度在 80-90） ， 过量会糊化。 （五）定容 1 固体 先于小烧杯中加少量溶剂溶解，不溶时可稍加热（前提是溶质耐热） ，冷却后移到容量瓶中， 用玻璃棒引流或用小漏斗，将小烧杯多洗几次。用溶剂加入到将容量瓶 2/3 时，将容量瓶水平方向摇动几 周（勿倒置） ，使溶液大体混匀。在慢慢加溶剂到标线 1 cm 左右，等 1-2 分钟，然后用滴官伸入瓶颈接近 液面处，眼睛平视标线，加溶剂至液体凹与标线相切，盖瓶塞倒转，使气泡升到顶，将瓶震荡数次，再倒 置，重复操作 10 次以上，才能混合均匀。 （注意：不再定容了，防止溶液漏掉） 2 液体稀释 用移液管移取一定体积的溶液于容量瓶中，再按上法进行。如果稀释时产生热量，可先 于小烧杯中加少量溶剂溶解，冷却后移到容量瓶中，再按上法进行。 用容量瓶定容后，装入试剂瓶，帖上标签。 标签应注明以下内容：药品浓度，名称，配制人和日期等。 （六）清理实验场所。 （二）（二） 缓冲溶液的配制缓冲溶液的配制 1 概念概念 由一定物质组成的溶液，在加入一定量的酸或碱时，其氢离子浓度改变甚微或基本不变，此种溶液称 为缓冲溶液缓冲溶液；这种作用称为缓冲作用缓冲作用；其溶液内所含物质称为缓冲剂缓冲剂，调节缓冲剂的比例可以配置成各种 pH 的缓冲液。 缓冲剂的组成，多为弱酸及这种弱酸与强碱所组成的盐，或弱碱及这种弱碱与强酸所组成的盐。调节 二者的比例可以配制成各种 pH 的缓冲液。 湖北师范学院生命科学学院生物化学实验指导 7 例如：某一缓冲液由弱酸（HA）及其盐(BA)所组成，它的解离方程式如下： HA H A BA B A 若向缓冲液中加入碱（NaOH）, 则 HA NaOH NaA + H2O 弱酸盐 若向缓冲液中加入酸（HCl）,则 BA HCl BCl HA 弱酸 由此可见，向缓冲液中加酸或碱，主要的变化就是溶液内弱酸（HA）的增加或减少。由于弱酸（HA） 的解离度很小，所以它的增加或减少对溶液内氢离子浓度改变不大，因而起到缓冲作用。 实例：磷酸氢二钠实例：磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液磷酸二氢钠缓冲液 原理原理：加入盐酸溶液，其缓冲作用： NaH2PO4 + Na2HPO4 + HCl 2 NaH2PO4 + NaCl 加入氢氧化钠溶液，其缓冲作用： NaH2PO4 + Na2HPO4 + NaOH 2 Na2HPO4 + H2O 缓冲溶液：缓冲溶液：磷酸氢二钠-磷酸二氢钠溶液 缓冲剂：缓冲剂： 磷酸氢二钠和磷酸二氢钠 2 配制 100 mL 0.2 mol/l Na2HPO4溶液，100 mL 0.2 mol/lNaH2PO4溶液和 100 mL 0.2 mol/l Na2HPO4- NaH2PO4缓冲液： (1) 计算 NaH2PO42H2O: 156.030.10.2 = 3.1206 (g) Na2HPO412H2O: 358.220.10.2 = 7.1644 (g) (2) 分别配制 0.2 mol/l Na2HPO4和 0.2 mol/lNaH2PO4各 100 mL，定容于容量瓶之后。注意：在容量瓶上帖 标签。 (3) 按照下表中的比例分别量取 0.2 mol/l Na2HPO4和 0.2 mol/lNaH2PO4溶液，混合后装入试剂瓶，贴上标 签，标签应注明以下内容：pH 值，药品浓度，名称，配制人和日期等。 (4) 磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（0.2 mol/l）的检验： 取一滴所配制的缓冲溶液于精密 pH 试纸上，检测其 pH 值。 【实验结果】【实验结果】 检验所配制的缓冲溶液与预期 pH 值是否相符合。 【注意事项】【注意事项】 (1) 溶液要用带塞塞的试剂瓶盛装。 (2) 每瓶试剂必须有标明名称、规格、浓度和配制日期的标签。 (3) 配制硫酸、磷酸、硝酸、盐酸等溶液时，应把酸倒入水中。 湖北师范学院生命科学学院生物化学实验指导 8 (4) 不能用手接触腐蚀性及有剧毒的溶液,剧毒废液应作解毒处理, 不可直接倒入下水道。 (5) 应熟悉一些常用溶液的配制方法。 【实验报告】【实验报告】 1 详细记录溶液配制步骤。 2 如果所配制的缓冲溶液与预期 pH 值不相符合，请思考其原因。 附表 磷酸氢二钠磷酸二氢钠缓冲液（0.2 mol/L） pH 0.2 mol/L Na2HPO4 (mL) 0.2 mol/L NaH2PO4 (mL) pH 0.2 mol/L Na2HPO4 (mL) 0.2 mol/L NaH2PO4 (mL) 5.8 8.0 92.0 7.0 61.0 39.0 5.9 10.0 90.0 7.1 67.0 33.0 6.0 12.3 87.7 7.2 72.0 28.0 6.1 15.0 85.0 7.3 77.0 23.0 6.2 18.5 81.5 7.4 81.0 19.0 6.3 22.5 77.5 7.5 84.0 16.0 6.4 26.5 73.5 7.6 87.0 13.0 6.5 31.5 68.5 7.7 89.5 10.5 6.6 37.5 62.5 7.8 91.5 8.5 6.7 43.5 56.5 7.9 93.0 7.0 6.8 49.5 51.0 8.0 94.7 5.3 6.9 55.0 45.0 Na2HPO42H2O Mr = 178.05， 0.2 mol/L 溶液为 35.61 g/L。 Na2HPO412H2O Mr = 358.22， 0.2 mol/L 溶液为 71.64 g/L。 NaH2PO4H2O Mr = 138.01， 0.2 mol/L 溶液为 27.6 g/L。 NaH2PO42H2O Mr = 156.03， 0.2 mol/L 溶液为 31.21 g/L。 湖北师范学院生命科学学院生物化学实验指导 实验二 蛋白质及氨基酸的呈色反应 【课前预习】【课前预习】 1蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理是什么？ 【目的要求】【目的要求】 1. 了解构成蛋白质的基本结构单位及主要联接方式。 2. 了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。 3. 学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。 【基本原理】【基本原理】 (一) 双缩脲反应 1 原理 尿素加热至180左右生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与cu2+结合生成紫红色 化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。可用于 蛋白质的定性或定量测定。一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定 都是蛋白质或多肽。 (二) 茚三酮反应 1 原理 除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反 应生成蓝紫色物质。该反应十分灵敏，1：1500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基 酸定量测定方法。 茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原 成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原性茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。此反 应的适宜pH为5-7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。 反应机理 第一步： 9 湖北师范学院生命科学学院生物化学实验指导 C O C O C OH OH + CCOOH H NH2 R C O C O C H OH + RCHONH3CO2 + + 第二步： C O C O C H OH + C O C O C C O C O CO + 2NH3 NH2 C O C O CN + 2H2O （三）黄色反应 1 原理 在蛋白质分子中，具有芳香环的氨基酸(如酪氨酸，色氨酸等)残基上的苯环经硝酸作用可生成黄色 的硝基化合物，在碱性条件下生成物可转变为深橙色的的硝醌衍生物，反应为： OH+ HNO3 HO NO2 + H2O HO NO2+ NaOH O N OH OH 多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以都会发生黄色反应。苯丙氨酸不易硝化，需加少量浓硫酸 后才能够发生黄色反应。 (四) 考马斯亮蓝反应 1 原理 考马斯亮蓝 G250具有红色和蓝色两种色调。在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色：当它与蛋 白质通过疏水作用结合后变成蓝色。它染色灵敏度高，比氨基黑高 3 倍。反应速度快，约在 2 分钟左右时 间达到平衡，在室温一小时内稳定。在 0.01-1.0 mg 蛋白质范围内，蛋白质浓度与 A595 m值成正比。所以常 用来测定蛋白质含量。 10 湖北师范学院生命科学学院生物化学实验指导 11 【实验用品】【实验用品】 1材料： 鸡蛋，头发，指甲。 2器材和仪器：试管，试管架，移液管，电热套等。 3试剂： (1) 尿素 (2) 10%氢氧化钠溶液 (3) 1%硫酸铜溶液 (4) 2卵清蛋白溶液 (5) 蛋白质溶液 2%卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液（蛋清：水=1：9） (6) 0.5甘氨酸溶液 (7) 0.1茚三酮水溶液 (8) 0.1茚三酮-乙醇溶液 (9) 鸡蛋清溶液 将新鲜鸡蛋的蛋清与水按1：20混匀，然后用6层纱布过滤。 (10) 大豆提取掖 将大豆浸泡充分吸胀后研磨成浆状再用纱布过滤。 (11) 0.5%苯酚溶液 (12) 浓硝酸 (13) 0.3色氨酸溶液 (14) 0.3酪氨酸溶液 (15) 10%NaOH溶液 (16) 蛋白质溶液（鸡蛋清：水=1：20） (17) 考马斯亮蓝 G250 100g 溶于 50 mL95%乙醇中，加 100 mL85%磷酸混匀，配成原液。临用前取原液 15 mL，加蒸馏水至 100 mL，用粗滤纸过滤后，最终浓度为 0.01% 【方法步骤】【方法步骤】 1(1) 取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热， 尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加 10氢氧化钠溶液约 1 毫升，振荡混匀，再加 1硫酸铜溶液 1 滴， 再振荡。观察出现的粉红颜色。避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。 (2) 向另一试管加卵清蛋白溶液约 l 毫升和 10氢氧化钠溶液约 2 毫升，摇匀，再加 1硫酸铜溶液 2 滴，随加随摇，观察紫玫色的出现。 2(1)取试管2支，分别加入蛋白质样液及甘氨酸溶液1mL，然后各加入0.1茚三酮水溶液0.5 mL，混匀后 于沸水浴中加热1-2 分钟，观察颜色由有粉色变紫红色再变蓝。 (2)在一小块滤纸上滴一滴 0.5甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴一滴 0.1茚三酮-乙醇溶液，在微火 旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。 3向7支试管中分别按表加入下列试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加热。 待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10%NaOH溶液至减性，观察颜色变化。 湖北师范学院生命科学学院生物化学实验指导 12 管号 1 2 3 4 5 6 7 材料（滴） 鸡 蛋 清 溶 液 4 大 豆 提 取 液 4 指甲 少许 头发 少许 0.5%苯酚 溶液 4 0.3色氨酸溶 液 4 0.3酪氨酸溶 液 4 浓 硝 酸 / （滴） 2 4 40 40 4 4 4 现象 4取 2 支试管，按下表操作。 试剂 管号 蛋白质溶液（mL） 蒸馏水（mL） 考马斯亮蓝染液（mL） 1 0 1 5 2 0.1 09 5 【实验结果】【实验结果】 列表记录各管出现的现象，并解释该现象。 【注意事项】【注意事项】 试管加热时，试管口不能对着人。 【实验报告】【实验报告】 以表格形式总结实验结果，包括观察到的现象，分析评价实验结果。 湖北师范学院生命科学学院生物化学实验指导 实验三 蛋白质的等电点测定和沉淀反应 【课前预习】【课前预习】 1什么是蛋白质的等电点？ 2蛋白质的沉淀反应原理是什么？ 【目的要求】【目的要求】 1、了解蛋白质的两性解离性质。 2、学习测定蛋白质等电点的一种方法。 3、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。 4、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 5、了解蛋白质变性与沉淀的关系。 【基本原理】【基本原理】 （一）蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列平衡： 电场中： 移向阴极 不移动 移向阳极 蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的 pH 达到一定数值时，蛋白质颗粒 上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的 pH 值称为此 种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有特异的等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此 种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液 pH 值。 本实验通过观察不同 pH 溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白 溶液中）配制各种不同 pH 值的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的 pH 值 即为酪蛋白的等电点。 （二）在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化 因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。 蛋白质的沉淀反应可分为两类。 （1）可逆的沉淀反应 此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉 13 湖北师范学院生命科学学院生物化学实验指导 14 淀仍能溶解于原来溶剂中， 并保持其天然性质而不变性。 如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇 （或 丙酮）短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。 （2）不可逆沉淀反应 此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶 剂中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固。蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。 蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷） ，并不析出。因此变性蛋白质并不一定 都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。 【实验用品】【实验用品】 1材料：新鲜鸡蛋 2器材和仪器： 水浴锅，温度计，200 mL 锥形瓶，100 mL 容量瓶，吸管，试管及试管架，乳钵。 3试剂： (1) 0.4%酪蛋白醋酸钠溶液 取 0.4 g 酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细地研磨，将所得的蛋白质悬胶液移入 200 mL 锥形瓶内，用少量 40 50的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。加入 10 mL 1mol/L 醋酸钠溶液。把锥形瓶放到 50 水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。将锥形瓶内的溶液全部移到 100 mL 容量瓶内， 加水至刻度，塞紧玻塞，混匀。 (2) 1.00 mol/L 醋酸溶液 (3) 0.10 mol/L 醋酸溶液 (4) 0.01 mol/L 醋酸溶液 (5) 蛋白质溶液 5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液（新鲜鸡蛋清 ：水=1:9） (6) pH4.7 醋酸醋酸钠的缓冲溶液 (7) 3%硝酸银溶液 (8) 5%三氯乙酸溶液 (9) 95%乙醇 (10) 饱和硫酸铵溶液 (11) 硫酸铵结晶粉末 (12) 0.1 mol/L 盐酸溶液 (13) 0.1 mol/L 氢氧化钠溶液 (14) 0.05 mol/L 碳酸钠溶液 (15) 甲基红溶液 【方法步骤】【方法步骤】 （一）酪蛋白等电点的测定 1 取同样规格的试管 4 支，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀。 湖北师范学院生命科学学院生物化学实验指导 15 试管号 蒸馏水（mL） 0.01 mol/L 醋酸（mL） 0. 1 mol/L 醋酸(mL) 1. 0 mol/L 醋酸(mL) 1 8.4 0.6 - 2 8.7 - 0.3 3 8.0 - 1.0 4 7.4 - - 1.6 2 向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液 1 mL，加一管，摇匀一管。此时 1、2、3、4 管的 pH 依次为 5.9、 5.5、4.7、3.5。观察其混浊度。静置 10 分钟后，再观察其混浊度。最混浊的一管 pH 即为酪蛋白的等电点。 （二）蛋白质的沉淀及变性 1 蛋白质的盐析 无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）的浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同，析出的 蛋白质也不同。 如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。 由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。加 蛋白质溶液 5 mL 于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出 少量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，为什么？将管内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶 解为止。此时析出沉淀为清蛋白。 取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。 2 重金属离子沉淀蛋白质 重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。 取 1 支试管，加入蛋白质溶液 2 mL，再加 3%硝酸银溶液 12 滴，振荡试管，有沉淀产生。放置片 刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？ 3 某些有机酸沉淀蛋白质 取 1 支试管， 加入蛋白质溶液 2 mL， 再加入 1 mL 5%三氯乙酸溶液， 振荡试管， 观察沉淀的生成。放置片刻倾出清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。 4 有机溶剂沉淀蛋白质 取 1 支试管， 加入 2 mL 蛋白质溶液， 再加入 2 mL95%乙醇。 观察沉淀的生成 （如 果沉淀不明显，加点 NaCl，混匀） 。 5 乙醇引起的变性与沉淀 取 3 支试管，编号。依下表顺序加入试剂： 试剂（mL） 管号 蛋白质溶液 0.1 mol/L 氢氧化钠 溶液 0.1 mol/L 盐酸溶液 95% 乙醇 pH4.7 缓冲溶液 1 1 1 1 2 1 1 1 3 1 1 1 振摇混匀后，观察各管有何变化。放置片刻向各管内加入水 8 毫升，然后在第 2，3 号管中各加一滴 湖北师范学院生命科学学院生物化学实验指导 16 甲基红，再分别用 0.1 mol/L 醋酸溶液及 0.05 mol/L 碳酸钠溶液中和之。观察各管颜色的变化和沉淀的生 成。每管再加 0.1 mol/L 盐酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。解释各管发生的全部现象。 【实验结果】【实验结果】 观察并记录各管发生的全部现象，同时解释该现象。 【注意事项】【注意事项】 等电点测定的实验要求各种试剂的浓度和加入量必须相当准确。 【实验报告】【实验报告】 以表格形式总结实验结果，包括观察到的现象，分析评价实验结果。 湖北师范学院生命科学学院生物化学实验指导 17 实验四 蛋白质的定量测定方法 【实验预习】【实验预习】 1.试比较Folin酚法与考马斯亮蓝染料结合比色法的优缺点。 2.试比较二喹啉甲酸法与Folin酚法的优缺点。 3.凯氏定氮法中在消化样品时，加入浓硫酸，硫酸钾和硫酸铜粉末的目的是什麽？ 4.紫外吸收法测定蛋白质含量的原理是什麽？ （一） Folin酚试剂法(Lowry法) （一） Folin酚试剂法(Lowry法) 【实验目的】【实验目的】 1.学习Folin酚试剂法测定蛋白质含量的原理。 2.掌握Folin酚试剂法测定蛋白质含量的方法和操作。 【实验原理】【实验原理】 蛋白质中含有酪氨酸和色氨酸残基，能与Folin酚试剂起氧化还原反应。反应过程分为两步，第一步： 在碱性溶液中， 蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu 2+作用生成蛋白质Cu2+复合物； 第二步： 蛋白质Cu2+ 复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。 该呈色反应在30分钟内即接近极限，并且在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故 可用比色的方法确定蛋白质的含量。进行测定时要根据蛋白质浓度的不同选用不同的测定波长：若蛋白质 含量高时（25100 g）在500 nm波长处进行测定，含量低时(525 g)在755nm波长处进行测定。最后根据 预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白质的含量。 Folin酚试剂法操作简便，灵敏度高，样品中蛋白质含量高于5 g即可测得，是测定蛋白质含量应用 得最广泛的方法之一。 【实验用品】【实验用品】 1.实验器材 100毫升容量瓶2只；移液管1毫升4支，5毫升2支；分光光度计。 2.实验试剂 (1)Fo1in酚试剂甲：将lg碳酸钠溶于50 mL0.l molL氢氧化钠溶液中，再把0.5 g硫酸铜(CuSO45H2O)溶于 100 mL1酒石酸钾(或酒石酸钠)溶液，然后将前者50mL与后者lmL混合。混合后1日内使用有效。 (2)Folin酚试剂乙： 在1.5 L容积的磨口回流瓶中加入100 g钨酸钠(Na2WO42H2O)、 25 g钼酸钠(Na2MoO42H2O)、 700 mL蒸馏水、50 mL85磷酸及100 mL浓盐酸，充分混匀后回流10 h。回流完毕，再加150 g硫酸锂、50 mL蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴，冷却后定容到1000 mL。过滤，如显 绿色，可加溴水数滴使氧化至溶液呈淡黄色。置于棕色瓶中暗处保存。使用前用标准氢氧化钠溶液滴定， 酚酞为指示剂，以标定该试剂的酸度，一般为2 molL左右(由于滤液为浅黄色，滴定时滤液需稀释100倍， 以免影响滴定终点的观察)。使用时适当稀释(约1倍)，使最后浓度为l molL酸。 湖北师范学院生命科学学院生物化学实验指导 (3)标准蛋白质溶液：用分析天平精密称取牛(或人)血清白蛋白100毫克，用少量蒸馏水完全溶解后，转移 至100毫升容量瓶中，准确稀释至刻度，使蛋白质浓度1 mg/mL。 (4)样品溶液：配制约0.5 mg/mL的酪蛋白溶液作为未知样品溶液。 【方法步骤】【方法步骤】 1. 绘制标准曲线 取7支试管，按下表分别加入各试剂 各管加入Fo1in酚试剂乙后，立即摇匀，放置30分钟后比色，在500 nm处记下各管光密度，以0号管为对照， 以光密度为纵坐标，标准蛋白质溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。 2. 测定未知样品：取2支试管，分别准确吸取1毫升样品溶液，各加5毫升Fo1in酚试剂甲，摇匀，室温放 置10分钟后，再各加1毫升Fo1in酚试剂乙，立即摇匀，放置30分钟，在500 nm处测定光密度值。 【实验结果】【实验结果】 根据未知样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品溶液中的蛋白质含量。 【注意事项】【注意事项】 注意要准确配制所用试剂，准确量取各溶液。 【实验报告】【实验报告】 总结实验结果，并分析评价实验结果。 （二） 紫外吸收法 （二） 紫外吸收法 【实验目的】【实验目的】 1. 学习紫外吸收法测定蛋白质含量的原理。 2. 掌握紫外分光光度计的操作方法。 【实验原理】【实验原理】 大多数蛋白质分子结构中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）残基，使蛋白质在280 nm的紫外光区 产生最大吸收，并且这一波长范围内的吸收值与蛋白质浓度的成正比，利用这一特性可定量测定蛋白质的 含量。 紫外吸收法可测定0.1-0.5 mg/mL的蛋白质溶液，此操作简便，测定迅速，不消耗样品，低浓度盐类 不干扰测定。因此，此法在蛋白质的制备中广泛应用。 18 湖北师范学院生命科学学院生物化学实验指导 【实验用品】【实验用品】 1.实验器材 试管及试管架；50毫升容量瓶2只；移液管；紫外分光光度计。 2.实验试剂 (1)标准蛋白质溶液：精确配制2 mgmL的酪蛋白溶液。 (2)样品溶液：配制约0.5 mg/mL的酪蛋白溶液作为未知样品溶液。 【方法步骤】【方法步骤】 1. 绘制标准曲线 取 7 支试管按下列各表加入各试剂： 试剂加完后摇匀，在紫外分光光度计上，于280 nm处以0号管为对照，分别测定各管溶液的光密度值。 以光密度为纵座标，标准蛋白溶液浓度为横座标，绘制出标准曲线。 2.测定未知样品 取样品溶液4毫升,加蒸馏水4 mL混匀，在280 nm下测定其光密度值。 【实验结果】【实验结果】 根据样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品溶液的蛋白质含量。 【注意事项】【注意事项】 注意要准确配制所用试剂，准确量取各溶液。 【实验报告】【实验报告】 总结实验结果，并分析评价实验结果。 （三）凯氏定氮法 （三）凯氏定氮法 【实验目的】【实验目的】 学习凯氏定氮法的原理和操作技术。 【实验原理】【实验原理】 凯氏定氮法用于测定有机物的含氮量,若蛋白质的含氮量已知时，则可用此法测定样品中蛋白质的含 量。 19 湖北师范学院生命科学学院生物化学实验指导 20 当蛋白质与浓硫酸共热时，其中的碳、氢两元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一 步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程通常称为“消化”。但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫 酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。消化完成后，在凯氏 定氮仪中加入浓碱，可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借助水蒸汽蒸馏法，将产生的氨蒸馏到一定 量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨与溶液中氢离子结合，使溶液中的氢离子浓度降低，指示 剂颜色改变，然后用标准无机盐酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止。根据所用标准盐酸的量 可计算出待测物中的总氮量。 蛋白质的含氮量为16%，即1克蛋白质中的氮相当于6.25克蛋白质，用凯氏定氮法测出的含氮量乘以 6.25,即得样品中蛋白质的含量。 【实验用品】【实验用品】 1.实验器材 微量凯氏定氮仪1套；50 mL凯氏烧瓶4个；移液管；锥形瓶；试管；小玻璃珠 2.试验试剂 (1)浓硫酸；30氢氧化钠溶液；2硼酸溶液；标准盐酸溶液(0.01 molL)。 (2)粉末硫酸钾硫酸铜混合物：K2SO4与CuSO45H2O以3：1配比研磨混合。 (3)混合指示剂(田氏指示剂)：由50mL0.1甲烯蓝乙醇溶液与200 mL0.1甲基红乙醇溶液混合配成，贮 于棕色瓶中备用。 (4)样品溶液：配制3 mg/mL的牛血清白蛋白溶液作为样品。 【方法步骤】【方法步骤】 1.安装凯氏定氮仪。 2.消化：取4个50 mL凯氏烧瓶并标号,各加1颗玻璃珠，在1号及2号瓶中各加样品1 mL，催化剂 (K2SO4CuSO45H2O)200 mg，浓硫酸5 mL。注意加样品时应直接送入瓶底，而不要沾在瓶口和瓶颈上。在3号 及4号瓶中各加1 mL蒸馏水和与1、2号瓶相同量的催化剂和浓硫酸，作为对照。在通风橱内进行消化。 在消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续 消化，直至消化液呈透明淡绿色为止。撤掉火力，冷却至室温。 3.蒸馏： (1)蒸馏器的洗涤：用水洗涤干净微量凯氏定氮仪，在蒸汽发生器中加入用几滴硫酸酸化的蒸馏水和几滴 甲基红指示剂，用这样的水蒸气洗涤凯氏定氮仪。约15分钟后，在冷凝器下端倾斜放好装有硼酸 指示剂的锥形瓶，继续蒸汽洗涤2分钟，观察锥形瓶内的溶液是否变色，如不变色则证明蒸馏装置内部已 洗涤干净。移走锥形瓶，停止加热，打开夹子。 (2)蒸馏：取下棒状玻塞，用吸管吸取消化液，细心地插到反应室小玻璃杯的下方，塞紧棒状玻塞。将一 个含有硼酸和指示剂的锥形瓶放在冷凝器下方，使冷凝器下端浸没在液体内。取30的氢氧化钠溶液10 mL 放入小玻璃杯中， 轻提棒状玻璃塞使之流入反应室(为了防止冷凝管倒吸，液体流入反应室必须缓慢)。 尚未完全流入时，将玻璃塞盖紧，向玻璃杯中加入蒸馏水约 5 mL。再轻提玻璃塞，使一半蒸馏水慢慢流 入反应室，一半留在玻璃杯中作水封。加热水蒸汽发生器，沸腾后夹紧夹子，开始蒸馏。氨气进入锥形瓶， 湖北师范学院生命科学学院生物化学实验指导 瓶中的酸溶液由紫色变成绿色。变色时起记时，再蒸馏5分钟。移动锥形瓶，使硼酸液面离开冷凝管约1厘 米，并用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外面，继续蒸馏