【doc】 乙型肝炎病毒基因检测方法研究.doc

乙型肝炎病毒基因检测方法研究中华临床新医学cknesechmcnewmcine2005年第5卷第9期819?临床研究?乙型肝炎病毒基因检测方法研究杨建林薛宝莲【中圈分类号】12.62【文献标识码】b【文章编号】168o一9866(2o05)一o9081902摘要目的建立简便,准确,实用的检测乙型肝炎病毒(hbv)基因变异的方法.方法根据hbv基因序列,用巢式聚合酶链反应(nestpcr)分别扩增hbvp基因b区和前c区片段,产物用apau,ssp1,u361酶切,30%acr胶电泳,分析酶切产物片段长度,建立检测p基因与前c基因变异的方法,对5o例慢性乙型肝炎(慢乙肝)患者检测ymdd和前c区基因序列变异.结果所建的nestedpcr方法操作简便,快速,结果准确,经济成本低,灵敏度高,可检测到103拷贝/mi的hbvdna.50例慢乙肝患者中,单纯ymdd变异的32例,合并前c变异的4例.20例健康体检者,血清作为阴性对照.结论本方法简便准确,适合较大样本检测,可用于临床常见拉米夫定耐药性hbvp基因变异与前c区基因变异的筛检.关键词乙型肝炎病毒;变异基因;变异基因检测为建立简便,准确,实用的检测乙型肝炎病毒基因变异的方法,笔者根据其基因序列,用巢式聚合酶链反应的方法,分别扩增其b区和前c区片断.分析其酶切产物片断长度,并用此方法对5o例慢性乙肝患者进行检测.结果证实,本方法简便,准确,灵敏度高,适合较大样本检测.报告如下.1对象和方法1.1血清标本来源所有标本均来自我院就诊的患者,男32例,女18例,年龄1646岁,用拉米夫定6个月一3a,变异基因的血清标本均一加保存.变异基因的阳性血清标本来自北京佑安医院肝病研究所.1.2试剂来源及方法乙肝五项:试剂来源于上海荣盛生物技术有限公司,用酶联免疫法检测.珊vdna:试剂来源于深圳市匹基生物工程股份有限公司,用荧光定量分析法检测.变异基因:患者在未用拉米夫定时检测一次乙肝五项和哪vdna,如,抗一hbe,hbvdna阳性,hbeag阴性的标本和hbvdna阳阳,符合用拉米夫定的开始用拉米夫定治疗,不定期检测hbvdna,如hbvdna由治疗前的阳性,治疗后由阴性转变为阳性,选择后一次的阳性标本,如治疗后玎bvdna一直仍阳性,选择治疗前与治疗后最后一次阳性标本.1.2.1试剂来源所有试剂均由北京佑安医院肝病研究所提供.1.2.2pcr所用引物序列见表1.衰1pcr所用引物序列引物sls2s4引物序列5一c,cc顷ccc一35一catc兀g兀,口rac】1ac】1g一35一grr(:aaatctatacccaaagc一35一gqv,gcactcagtccgtritc一31.2.3变异基因检测万法1o血清加5o裂解液,95汽浴15rnin,120or/rnin离心2rnin,弃去上清液,沉淀物用于pcr.扩增模板.1.2.3.1mdd基因扩增与前c区基因p(扩增先用引物1(s1),引物2()作pcr扩增.sl,各1.5,10*bur3,dntp2.,taqe0.8,反应总体积为31.循环参数:94300s预变性,9430s,5545s7230s,共循环35圈.72延伸420s.1.2.3.2前c区基因pcr.扩增引物3(s3),引物49(sd)各1.5,其余成分不变,循环参数:9460os预变性,943os,55%30s,726os,共循环35圈.72延伸420s.1.2.3.3前c区扩增产物的酶切bs614u,bsa0.2,1o*作者单位:017000内蒙古鄂尔多斯市第二人民医院bur2,2014,混匀后每份分装16,取pcr2扩增产物4.37水浴1h.ymdd扩增产物的酶切,apa1l3.5u/份,1o*bur2u1,bsa0.2,014.或ssp14u,10*bur2,014.混匀后每份分装16,取pcr.扩增产物4,37水浴1h.酶切产物经30%act(由亚甲基双丙烯酰胺和丙烯酰胺配制)电泳1h,溴化乙淀染色51ornin,紫外线分析仪上观察电泳条带.2结果2.1变异株的鉴定dd出现171bna条带为野毒株,l49bpdna条带为变异株.yvdd出现315bpdna条带为野毒株,283bpdna条带为变异株.前c区基因出现110bpdna条带为野毒株,bpdna条带为变异株.2.2敏感性对不同hbvdna含量的血清标本进行巢式pcr扩增,可检测到含量为103拷贝/mi的样本,表明巢式pcr具有较高的敏感性.2.3方法的重复性以上标本20例进行2次检测,结果均能重复.2.450倒检测样本结果单纯yvdd变异的23例(46%),dd变异的22例(44%),前c区基因变异的1o例(加%),yvdd与dd同时变异的18例(36%),yvdd合并前c区变异的5例(10%),y1dd合并前c区变异的5例(10%),三者同时变异的4例(8%).加例阴性对照者检测的三项变异指标均为阴性.3讨论近年来发现hbv可出现多种变异,可使hbv感染后,hbv感染标志物不典型,变异后可加重病情,或出现耐药或免疫逃疫现象,给诊断和治疗及预防造成困难,因而hbv变异的研究对了解发病机理,病理判断,诊断,治疗及预后均有关系.3.1前c区变异由于aa28的变异,使hbe艟不能产生或合成障碍,而c蛋白仍能产生,患者表现为血清hbsag,抗一hbe及hbvdna阳性,hbeag阴性,常表现为进展性肝病及肝功能衰竭.3.2p区基因变异p区编码dna聚合酶,对hbv复制起重要作用,此区发生突变,则可能导致hbv复制改变或阻断.近年来,抗hbv药物核苷类似物拉米夫定等的应用,亦发现hbv变异,拉米夫定是一种非常强的抗病毒药物,其主要作用靶hbv聚合酶,为其作用的主区,分为a,b,c,d,e5个活性区,其中a,b,c为三磷酸核苷结合的催化位点,b,e区可能参与rna模板和启动子定位.c区包括ymw基因域,为酶催化的活性部位,其中在逆转录病毒最多的变异是ym叻中的m变异如yvdd或叻.文献报道,mdo变异最早可发生在治疗后2周820中华临床新医学chineseclinicalnewmedicine2005年第5卷第9期内,一般发生在治疗后9个月(4%),1a(16%一32%),2a(38%),3a(57%),4a(67%).体外实验也证实,一旦出现ym.dd基因序列变异,hbv对拉米夫定敏感性明显降低.因此,临床在长期用药过程中,开展hbvp基因耐药性变异检测,以指导临床及时调整治疗方案,准确,合理用药,提高疗效.目前检测hbv耐药性基因变异的方法很多,但是不是操作复杂,就是成本或仪器,设备昂贵,具有局限性.本方法操作简便,整个检测过程仅需10h,灵敏度高,能检测到1拷贝/mlhbvdna,结果准确,成本低.无需特殊仪器,凡能进行牛e牛搴牛e牛牛亭牛e牛牛e牛e,卜e牛epcr检测的实验室均能开展,是一种很好的检测方法,值得推广应用.参考文献1.陆志檬,等.病毒性疾病诊疗新技术人民军医出版社,2002年月lo月2.丁静娟,张伟三,等.乙型肝炎病毒耐拉米夫定多聚酶基因变异检测方法研究.中华实验和临床病毒学杂志,2004年3月(收稿日期2oo50619)(编辑寒梅)牛e牛e牛e牛e牛e牛e牛e牛e牛亭牛e牛牛e?药物与临床?口服降糖药的临床应用苏德禹【中图分类号】r969.4【文献标识码】b【文章编号】168098(mos)一09082001糖尿病(dm)是严重危害人类健康的常见病,对人类的健康感性.由于只降低高血糖,因而不会引起低血糖反应.此类药构成了严重威胁.寻求更有效的药物控制糖尿病的发展,减少物主要有苯乙双胍,二甲双胍,吡咯苯胍.苯乙双胍易引起乳酸糖尿病的危害,是目前治疗糖尿病的主要方向.口服抗糖尿病性酸血症渐趋淘汰.吡咯苯胍能刺激胰岛素8细胞分泌,抗血药物具有方便,快捷,无痛苦,可持续长期使用等优点,在临床被小板黏附,抑制脂肪分解,增加葡萄糖的利用,作用比苯乙双胍广泛应用.强,不引起乳酸性酸血症.二甲双胍能明显改善糖尿病患者的1磺酰腺类(su)糖耐量和高胰岛素血症,对餐后餐前均有明显降低作用.该类药物可特异性阻滞胰岛j3细胞上atp敏感性钾通道,5嚏唑烷二酮类导致膜去极化,促使电压依赖ca2通道开放,引起胞浆内ca2噻唑烷二酮类药物是近年来新开发的一种很有前途的胰岛浓度升高,从而增加胰岛素分泌和释放.磺酰脲类适用于食素增敏剂,目前已经开发的同类药物有曲格列酮,噻格列酮等多疗,运动,减重仍不能控制的非肥胖的2型糖尿病患者,第一代种.以曲格列酮研究最有深入,也最早在临床应用.噻唑烷二有甲基磺丁脲d860,第二代格列本脲,格列喹酮,格列齐特,梅酮类机理尚未阐明,有人认为与其能抑制脂肪源性肿瘤坏死因列波脲.格列喹酮其作用强,剂量小,不良反应相对较小已广泛子一a(tnfa)产生有关,因为脂肪源tnfa可降低骨骼肌细应用于临床,主要从胆汁排泄,可改善肾脏血流,较少引起肾功胞的胰岛素受体的酪氨酸激酶活性,抑制胰岛素受体底物一i能障碍,适用于肾功能轻中度不良的2型糖尿患者,第三代的的磷酸化并抑制葡萄糖转运因子一4的表达,从而引起胰岛素格列美脲除具有第一代的作用机制外,还能增加组织对胰岛素的抵抗,而噻唑烷二酮可明显抑制脂肪组织产生tnfa,并可的敏感性而发挥降血糖作用.促进glu一4在骨骼肌的表达,从而提高机体的胰岛素的敏感2快速促胰岛素分泌型性0.此类药物为苯甲酸和苯丙氨酸衍生物,主要药物有美格列定及其衍生物,瑞格列萘,美格列萘,瑞格列定,那格列定,吗啉胍化合物等.瑞格列萘是苯甲酸衍生物,是促胰岛素分泌剂,其作用机制是通过与胰岛8细胞膜上的特异性受体结合来促进胰岛细胞上atp的敏感性k通道关闭,抑制k从8细胞外流,使细胞膜去极化,从而开放电压依赖的cd通道,使细胞外ca2进入胞内,促进储存的胰岛素分泌,瑞格列萘对功能受损的胰岛细胞起到保护作用,它最大的优点是可以模仿胰岛素的生理性分泌,该药主要适用于2型糖尿病患者.3伍一葡萄糖药醴抑制剂这类药物能抑制小肠上皮刷状缘的a葡萄糖苷酶,使肠内葡萄糖的产生吸收减慢,降低餐后血糖,适用餐后高血糖,并能改善外周靶组织对胰岛素的敏感性,减少糖尿病患者的胰岛素的用量.目前常用阿卡波糖,优格列波糖,两者降糖作用相当,作用位点稍有差异,优格列波糖肠胀气等反应较小.4双胍类主要用于肥胖的2型糖尿病,常与磺脲类或胰岛素合用,主要通过增强外周组织糖的无氧酵解,增加组织细胞对糖的利用,抑制肝糖原异生及肝糖生成,抑制或延迟肠壁细胞对葡萄糖的摄取而降低餐后高血糖.本类药物还能改善组织对胰岛素的敏作者单位:365000福建省三明市第一医院药剂科随着糖尿病基础理论研究的深入及临床药理学的迅速发展,口服降糖药物的研究与开发取得了很大的发展,为糖尿病的防治拓展了更加广阔的空间,各类降糖药特点各异,应采取个体化给药,以更好地控制血糖,减少并发症的发生.参考文献1.张翠欣,王中孝.降糖药的研究进展j.中药国药学杂志,2002;37(5):3283302.殷志杨.第二代降糖药的临床应用j江苏药学与临床研究,1997;5(4):363.潘启超.新抗糖尿病药一格列美