免疫胶体金技术基本原理及其在疾病检测中的应用进展.doc

免疫胶体金技术基本原理及其在疾病检测中的应用进展16HeilongjiangAnimalScienceandVeterinaryMedicineNo920063J萨姆布鲁克,EF弗里奇,T曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南M.2版.金冬雁,黎孟枫译.北京:科学出版社,1998免疫肢体金技术基本原理及其在疾病检测中的应用进展李忠秋,马红,郭镇华,吴赛辉,刘梯(黑龙江省农业科学院畜牧研究中心,黑龙江哈尔滨150086)中图分类号:$852.4文献标识码:A文章编号:10047034(2006)09001603近年来胶体金标记技术迅速发展,应用范围也逐渐扩大,不仅应用于光镜和电镜水平定位,定性及定量研究含有抗原物质的组织,细胞及亚细胞结构,还应用于免疫转印,流式细胞术,液相免疫测定,固相斑点金/银染色,免疫层析法(immunochromatography)和快速免疫金渗滤法(DotimmuogoldfiltrationassayDIGF4)等多种免疫标记检测技术中.1免疫胶体金标记技术的基本原理免疫胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物,应用于抗原抗体反应中的一种新型免疫标记技术.胶体金(Colloidalgold)是由氯金酸(HAuC1)水溶液在还原剂作用下,聚合成特定大小的金颗粒,颗粒之间因静电作用形成一种稳定的胶体状态,也称金溶胶(goldso1).利用胶体金在碱性环境中带负电荷的性质,与蛋白质分子的正电荷基团籍静电吸引而形成牢固的结合,这种结合对所标记蛋白质的生物活性无明显影响.除蛋白质分子外,胶体金颗粒还可以与其他多种生物大分子物质(如毒素,抗生素,激素,核酸,多肽缀合物等)结合.2免疫胶体金的制备收稿日期:20051115作者简介:李忠秋(1974一),女,助理研究员,硕士.通讯作者:刘娣(1963),女,教授,博士,博士生导师2.1胶体金的制备利用还原法可以方便地从氯金酸溶液中制备不同粒径(5150nm)的胶体金颗粒.胶体金的粒径不同会呈现不同的颜色.常用的制备方法有白磷还原法,抗坏血酸还原法,柠檬酸三钠还原法,鞣酸一柠檬酸三钠还原法,乙醇超声波还原法和硼氢化钠还原法.其中最常用的制备方法为柠檬酸三钠还原法,将0.01%的氯金酸溶液加热至沸腾,快速搅拌的同时迅速加入1%的柠檬酸三钠水溶液,继续加热,溶液颜色由浅黄色逐渐变为浅蓝色,蓝色,蓝紫色,紫红色,最后变为澄清透明的红色.此法制备程序简单,胶体金的颗粒形状,大小较均一.2.2胶体金标记蛋白的制备胶体金标记蛋白的制备,实质上是蛋白质等生物大分子物质被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程.在免疫组织化学中,将胶体金结合蛋白质的复合物称为金探针,用于免疫测定时多简称为免疫胶体金(im.munogold).胶体金对蛋白质的吸附主要取决于标记体系的pH值,电解质浓度,被标记蛋白质用量等因素.在接近于被标记蛋白质的等电点或略偏碱(pHpI)时,胶体金颗粒的吸附力最强,制成的胶体金一蛋白质复合物也最稳定,胶体金的酸碱度可用0.1moL/LK:CO3或0.1mol/LHC1调节.金溶胶的pH值可能TheReseaehofHemagglutininGeneofAvianInfluenzaisolatestrainA/Ostrieh/Denmark/72420/96(LPAIH5N2)LIUZhijun.,LIMingyi,PANYaoqian.,etal(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang471003,China;2.AnimalQuarantineInstituteofAculturalMinistry.,Qingdao266032,China)Keywords:AvianV/rus;HemagglutininGene;cloning;sequenceAnalysisAbstract:TheHAgeneofavianinfluenzaA/Ostrich/Denmark/72420/96(LPAIH5N1)isolatewasamplifiedbyRTPCR,andthensequenced.There.suhshowedthatthecDNAcontains1737bpcoveredthewholeopenreadingframeofHAgene.TheresultsofcomparativesequenceanalysisindicatedthattheHAgenesequenceoftheisolatedstrainhadabout80%homologywithsomeH5N1isolats.butabout97%highwithsomeH5N2isolatedstrainsfromdif-ferentperiodsanddifferentareasatnucleotideacid.TheresultsconfirmedthehighfrequencerecombinentoftheeightsegmentofAIVgenomeandthehiglvariationabilityofAIV.TheaminoacidsofthecleavagesitewereETR.confirmedthatLPAIH5N1wasalowpathogenicstrain.Theostrichisolatededucedaminoacidehadabout90%identitywithsomeH5N1isolates.Theantigenicityofthesetwosequencewasalmostthesame.weseethevaccinedeve1.opedwiththisHAgenecanresistthecommonstainsofH5AIVinfectioninourcountrywithhighsecurity,anditwillaccordwiththeneedofsanitationmuchmore.(009)黑龙江畜牧兽医)2006年第9期17会损害pH测定计的探头,因此,一般采用精密pH试纸测定其pH值.待标记蛋白质的离子浓度应尽可能小,标记前可用0.005%的氯化钠或双蒸水透析以除去多余的离子.测定待标记蛋白质实际用量时,最好在标记前测定形成稳定胶体金一蛋白质复合物的最小蛋白质需要量,然后按计算结果增加10%,即为待标记蛋白质的实际用量.制备好的胶体金一蛋白质复合物需进一步纯化,以除去未结合的蛋白质或胶体金颗粒,一般采用超速离心法和凝胶过滤法.3免疫胶体金技术的应用3.1电镜水平的应用金颗粒具有高电子密度,在电镜下清晰可辨.金标记技术能较好地保持组织和细胞原有的细微结构,并对被测抗原或抗体进行组织或细胞的定位观察.王美琪等人以金颗粒直径为187.2nm的PAAu复合物作探针,在电镜下研究耦联因子(CF1)在菠菜叶绿体类囊体膜上的分布,获初步结果.喻毅强等人应用免疫金标记法对51KD精子膜抗原的抗体在精子上的定位进行了超微结构观察,获得较为满意的结果,这为与男性不育相关的精子抗原及其抗体的研究提供了可行方法,对男性不育症患者的诊断及治疗提供了可靠依据.另外,可以应用大小不同的金颗粒或结合酶标进行双重或多重标记,在一张组织,细胞切片上同时显示两种或多种不同的抗原成分,具有抗原定位精确,相互关系清晰等优点.3.2光镜水平的应用胶体金用于光镜水平的研究,可以弥补其他标记物不可避免的本底过高和内部酶活性干扰等缺点.GeogheganWD等人利用胶体金标记物在免疫反应中会发生金颗粒聚集而导致颜色加深的原理,将胶体金标记物用于液相免疫组化测定,实现了在光镜水平观察胶体金标记物.胶体金颗粒由桔红色到紫红色,在光学显微镜下可用暗视野观察,直接用亮视野不易观察,且灵敏度低.在银离子的作用下,增强了光镜下的灵敏度和可观察性,称为免疫金银染色法(im.munogoldsilverstaining,IGSS),利用银离子的增强作用使得在光镜下可视粒子的半径比单独金颗粒增加了1015倍,这样在标记时可以使用更小半径的金颗粒(小于15nm),并且采用小颗粒进行标记可以增加标记密度.通过控制反应时间可以灵活地改变银在免疫金表面沉降的过程,使得银沉降的量有很大的不同,小到用电镜观察,大到可以直接用肉眼观察.金和银本身无荧光,所以免疫金银染色法可以和荧光标记联合进行多重标记,这对组织化学和免疫化学的研究将是一个强有力的方法.胡东维等人利用免疫电镜技术对郁金香杂色综合征的病原进行鉴定,并对郁金香杂色病毒在植株体内的增殖与积累进行初步分析.舒邦良等人通过制备胶体金标记的不同抗簇分化抗原,检测出存在外周血淋巴细胞表面的簇分化抗原,最终对外周血中的不同淋巴细胞亚群进行分类.3.3斑点金免疫渗滤法(DotimmuogoldfiltrationassayDIGFA)的应用近几年发展起来的以胶体金为标记物的斑点金免疫渗滤试验,又名滴金免疫测定法(简称滴金法).斑点金免疫渗滤试验最初是从斑点ELISA基础上发展建立起来的,用胶体金标记物代替酶,不需酶对底物的反应,更加简便,快速,在临床检验中应用日趋广泛.斑点金免疫渗滤法的基本原理仍是间接法或夹心法.试验方法是以硝酸纤维素膜为载体,将试剂及标本滴加在膜上,使抗原抗体反应和洗涤在一特殊的渗滤装置上以液体渗滤过膜的方式迅速完成.张恩英等人建立了检测日本血吸虫病患者血清中血吸虫抗原的斑点金免疫渗滤法,检验证明此法的敏感性,特异性和ELISA相近,且操作更简便,快捷.ChenX等通过斑点金免疫渗滤法,用抗溶血磷脂酸抗体检测急性心肌梗死病人31例,健康对照12例.结果急性心肌梗死病人血清中溶血磷脂酸含量明显高于对照,此法灵敏度高,且方便易于操作.3.4胶体金免疫层析法(colloidgoldimmunochromatographicassay.CIA)的应用胶体金免疫层析技术是20世纪90年代出现的一种快速免疫检测技术.其原理是将配体(抗体或抗原)先同定于硝酸纤维素膜等微孔滤膜的某一区带,胶体金标记另一配体,吸附于玻璃纤维上,然后固定于硝酸纤维素膜的某一特定位置,当干燥的硝酸纤维素膜一端浸到样品后,由于毛细作用,样品将沿着膜向上移动,当移动至胶体金标记物处时,如样品中含有带检受体,则发生第一步高度特异性的免疫反应,形成的免疫复合物继续移动至线状包被区时,发生第二步高度特异性的免疫反应,形成的免疫复合物被截留在包被的线状区,通过标记的胶体金而显红色(检测带),而游离标记物则越过检测带,与结合标记物自动分离.此法最先由BeggsM等人用于人绒毛膜促性腺激素(HumanChorionicGonadotropin,HCG)的测定.经过近几年的发展,应用范围日益扩大.Hasan等人用免疫层析法检测粪便中的霍乱弧菌,得到了理想的效果.王中力等人用自制的犬细小病毒(CPV)试纸条检测CPV抗原,具有简单,快速,准确等优点.李兆隆等_2研制了检验人精浆特异蛋白P30的免疫胶体金试纸条,主要用于法医物证检验.曲萌等采用胶体金标记鼠抗人IgM单克隆抗体制成免疫层析试纸条,检测肝炎病毒IgM抗体.富青等利用胶体金免疫层析技术,建立了测定人血清中乙肝表面抗体的半定量法,其原理是将包被有抗原的硝酸纤维素18HeilongjiangAnimalScienceandVeterinaryMedicineNo92006膜与乙肝表面抗体为阳性的血清反应,血清中的抗体标二抗便与固相上的一抗结合而显色,样品中抗体量便与固相上的抗原结合,再与金标抗人IgG反应,金动物疫病基因芯片诊断技术的研究进展杨林,廖明(1.华南农业大学兽医学院农业部养禽与禽病防治重点开放实验室,广东广州510642;2.黑龙江省兽医卫生防疫站,黑龙江哈尔滨150090)中图分类号:$851.4文献标识码:A文章编号:10047034(2006)09001802基因芯片(GeneChip)又称DNA芯片或DNA微阵列(DNAmicroarray),是将大量的DNA片段按预先设计的排列方式固化在载体表面,并以此作为探针,在一定的条件下,与样品中待检测的靶基因片段杂交,通过检测杂交信号,实现对靶基因的存在,含量及变异等信息的快速检测.它是分子生物学和微细加工技术(microfabricationtechnology)相结合的产物.自从1996年美国Affymetrix公司成功地制作出世界上首批用于药物筛选和实验室试验用的生物芯片,并制作出芯片系统,此后世界各国在芯片研究方面快速前进,不断有新的突破.它是生物芯片(Biochip)中发展最成熟应用最广泛的一类.我国这方面的研究虽然起步较晚,但其潜在的应用价值和巨大的市场已经引起我国政府和科学工作者的高度重视.1基因芯片诊断的优势基因芯片在动物疫病的诊断方面具有独特的优势.与传统检测方法相比,它可以在1张芯片同时对多个样品进行多种疾病的检测;无需机体免疫应答反应,能及早诊断,待测样品用量小;能检测病原微生物的耐药性和亚型;极高的灵敏度和可靠性;自动化程度高,利于大规模推广应用.这些特点可使兽医工作者在短时间内掌握大量的疾病诊断信息,这些信息有收稿日期:20060309基金项目:中国博士后科学基金资助项目(2005038178)作者简介:杨林(1969一),女,研究员,博士.通讯作者:廖明(1968一),男,教授,博士,博士生导师助于在短时间内找到正确的防治措施.基因芯片通过系统监控,分子杂交确认,是DNA杂交技术和PCR扩增技术相结合的分子诊断方法,为疾病的l临床诊断开辟了一条新的道路.动物体的每种组织,每一种细胞在不同分化阶段和不同状态的疾病条件,以及不同致病原因时都有独立的基因表达谱.基因芯片可以作为疾病诊断和预测的标准.应用基因芯片不仅可以提高疾病诊断的效率,而且可以诊断出疾病的具体类型,发病阶段,严重程度和愈后指示.2基因芯片常用的诊断方式一是同步检测多种病原体.由于大部分病原微生物的基因组测序已完成,可将许多代表每种微生物的特殊基因制成1张芯片,通过反转录可检测标本中有无病原体基因的表达及表达的情况,以判断检测有无感染病原及感染程度.二是同步检测多个样品.在对同一病原进行多次检测时,1张基因芯片可同时对多个样品做出检测.这可大大地缩短重复检测所需的时间.如2